CN106279438B - 新型嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体,包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域,在重组嵌合抗原受体的N端、C端或者各功能结构域之间***光诱导元件。本发明运用分子克隆方法将光诱导元件LOV2基因克隆入质粒Lenti‑EF1α‑CD19CAR构建具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的共表达载体,利用293T细胞包装获得带有光诱导CAR分子的慢病毒载体。本发明所述重组嵌合抗原受体通过慢病毒载体在T细胞中表达后,T细胞的杀伤毒性受到LOV2的可逆控制,为CAR‑T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学转化领域,尤其涉及具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体及其编码基因与应用。
背景技术
免疫***是人体的防御体系,一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能,另一方面消除体内衰老细胞及发生突变的细胞,有的突变细胞会变成癌细胞。癌症免疫治疗正是通过人为的干预,来调动机体自身的免疫***对癌细胞进行杀灭和抑制其增殖。
过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是指将体外激活的自体或异体免疫细胞输注给患者,以杀伤患者体内的肿瘤细胞,是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一,已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。其中,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗法是近年来发展非常迅速的一种新的细胞免疫治疗技术,通过基因工程技术修饰效应T细胞,克服肿瘤局部免疫抑制微环境和宿主免疫耐受状态,提高了抗肿瘤的靶向性、杀伤性和持久性。
CAR结构由胞外抗原结合区、跨膜结构区和胞内信号转导区组成。胞外抗原结合区主要是抗原特异性单克隆抗体单链的重链(VL)和轻链(VH)的可变区组成,二者以铰链区连接形成单链抗体(single chain fragment varible,scFv)。CAR通过识别肿瘤抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs, ITAM)”在体外进行基因重组,通过基因转染技术修饰患者的T淋巴细胞,使患者T淋巴细胞表达肿瘤抗原受体,经过纯化和大规模扩增修饰后的T淋巴细胞,称为嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(CAR-T)。
CAR技术临床上在血液***肿瘤和实体瘤的治疗上取得了显著成绩( Grupp SA,Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric antigen receptor-midified T cells foracute lymphoid leukemia [J]. N Engl J Med, 2013,368:1509-1518.Davila ML,Riciere I, Wang X, et al. Efficiacy and toxicity management of 19-28z CAR Tcell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia [J]. Sci Transl Med.2014,6:224-225.
Kochenderfer JN, Dudley ME, Rosenberg SA, et al. Chemotherapy-Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma and Indolent B-cell Malignancies CanBe Effectively Treated With Autologous T Cell Expressing an Ati-CD19 ChimericAntigen Receptor[J]. J Clin Oncol, 2015,33:540-549.Louis CU, Savolo B, DotiG, et al. Antitumor activity and long-ter fate of chimeric antigen reeptor-positive T cell in patients with neuroblastoma[J]. Blood, 2011,118:6050-6056.Tang X, Zhou Y, Li W, et al. T cell expressing a LMP1-specific chimericantigen receptor mediate antitumor effects against LMP1-positivenasopharyngeal carcinoma cells in vitro and in vivo[J]. J Biomed Res, 2014,28:468-475.Gargeet T, Fraser CK, Dotti G, et al. BRAF and MEK inhibitionvariably affect GD2-specific chimeric antigen receptor (CAR) T-cell functionin vitro[J]. Immunother, 2015,38:12-23.)。目前已经发展到第三代。第一代CAR由单链抗体通过跨膜结构区域与胞内信号传导区(ITAM)相连,ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ;第二代CAR的胞内信号传导区引入了共刺激分子(costimulatory molecule,CM),主要为CD28分子;第三代CAR引入了双共刺激分子(CM1和CM2),主要为 CD28分子加上CD134或CD137等。第一代CAR-T淋巴细胞研究较多,但是大多数试验在细胞扩增、体外存活时间、细胞因子分泌等方面还存在不足,没有达到预期的临床效果。研究表明,T淋巴细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号,由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动;第二信号为协同刺激信号,通过CD28/B7等重要的共刺激分子,促进IL-2合成,并使T淋巴细胞充分活化及免于凋亡。即使T淋巴细胞与抗原接触,如果没有协同刺激信号,细胞难以发挥正常功能。相应的,仅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受体,如果没有协同刺激信号2,也难以高效激活CAR-T淋巴细胞。因此,依照T淋巴细胞活化的双信号学说,第二代和第三代CAR在嵌合抗原受体上加上如CD28、CD137等共刺激分子,以提高T淋巴细胞的细胞毒性、增殖活性,维持T淋巴细胞应答,延长T淋巴细胞存活时间等。研究证实第二代的CAR-T淋巴细胞在杀伤肿瘤活性和体内存活时间均优于第一代。目前,第三代CAR-T淋巴细胞临床应用还比较少,故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T淋巴细胞,以及选择怎样的共刺激分子组合,还需要进一步观察。
虽然CAR-T靶向***细胞是目前最有前景的癌症治疗方案之一,但是其具有靶向非肿瘤“脱靶效应”(Morgan RA,Yang JC,Kitano M,et al. Case report of aserious adverse event following the administration of T cells transduced witha chimeric antigen receptor recognizing ERBB2[J].Mol Ther,2010,18( 4) : 843-851)和“细胞因子风暴”(Wrzesinski C,Paulos CM,Kaiser A,et al.Increasedintensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptivelytransferred tumor- specific T cells [J]. J Immunother,2010,33( 1) : 1- 7)的毒性效应。增加CAR-T细胞的活性“开关”控制是解决CAR-T毒性问题的重要内容,为CAR-T在临床的推广应用具有重要意义。因此,CAR-T杀伤活性的可逆光控对CAR-T的临床转化具有积极的推进作用。
发明内容
本发明的目的在于提供光诱导元件调控的重组嵌合抗原受体及其编码基因。
为解决上述技术问题,本发明具体技术方案如下:具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体,包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域,在重组嵌合抗原受体的N端、C端或者各功能结构域之间***光诱导元件。
本发明所述的重组嵌合抗原受体,光诱导元件选自隐花色素(CRY)、紫外和蓝光敏感黄素蛋白(LOV和BLUF)和光敏色素(PHY)中的一种或几种,进一步优选拟南芥(水稻、果蝇、番茄、大麦、蕨类、苔藓、藻类、非洲爪蟾、小鼠、人等)的CRY,拟南芥(燕麦等)的LOV2,植物的PHY。更优选来源于燕麦的LOV2(aa 404-546 of Avena sativa Phototropin 1,NPH1-1,GenBank: AAC05083.1)其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
在光照条件下,由于受光照刺激致使含有光诱导元件的重组嵌合抗原受体得以表达,达到光控性的“开”作用;在避光条件下,不具备重组嵌合抗原受体的表达条件以实现光控性的“关”作用。
本发明所述的重组嵌合抗原受体,所述光诱导元件可以位于重组嵌合抗原受体的N端、C端或者各功能结构域之间,即位于重组嵌合抗原受体的N端(抗原结合区之前),抗原结合区与跨膜结构区之间、跨膜结构区与共刺激信号传导区之间、共刺激信号传导区之间与T细胞信号传导区之间或者C端(T细胞信号传导区之后)。
本发明所述的重组嵌合抗原受体,所述抗原结合区功能结构域选自人抗体、人源化抗体、抗原结合片段或其组合,可以是完整的抗体,Fab、Fab'、 (Fab')2、Fv片段或者单链可变区片段scFv。
优选的,本发明所述抗原结合区功能结构域结合肿瘤抗原。所述肿瘤为***癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病(慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、腺癌、大肠癌、乳腺癌、实体瘤、头颈部癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、转移性癌、多形性胶质母细胞瘤等。
优选的,所述肿瘤抗原选自CD19,CD20,CD22,CD33, CD138,ROR1,Her2/neu,间皮素,CD33/IL3Ra,c-Met,PSMA,CAIX,CEA、PSCA,GD2,糖脂F77、EGFRvIII,GD-2,FAP,FBP,NY-ESO-1TCR,MAGEA3TCR或其任意组合。
优选的,本发明所述共刺激信号传导区选自CD27,CD28,CD137(4-1BB),CD134(OX40),CD30,CD40,PD-1,LFA-1,CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合。
优选的,本发明所述跨膜结构区选自CD3、CD4、CD8或CD28蛋白分子的跨膜结构区。
优选的,本发明所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD28、CD137、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ蛋白分子的T细胞信号传导区中的一种或几种。T细胞信号传导区包含有免疫受体酪氨酸活化基序。
本发明所述的重组嵌合抗原受体,在抗原结合区和跨膜结构区之间还有细胞外铰链区,优选的,所述细胞外铰链区是CD8蛋白分子的铰链区或免疫球蛋白IgG铰链区或其组合。光诱导元件可以位于抗原结合区与细胞外铰链区之间、细胞外铰链区与跨膜结构区之间、跨膜结构区与共刺激信号传导区之间、共刺激信号传导区与T细胞信号传导区之间或者T细胞信号传导区之后。
本发明的一个优选的方案,当光诱导元件位于T细胞信号传导区之后时,其末端可以连接有光效应元件,优选光效应元件为人白蛋白,氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明所述的重组嵌合抗原受体的抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区各功能结构域以及光诱导元件可以直接相连,即通过克隆基因时加入酶切位点或者融合PCR技术将这些元件相连接后进行表达。也可以通过连接肽连接各功能结构域。连接肽优选柔性肽或刚性肽,优选柔性肽是指1~20个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的连接肽,优选刚性肽是指保持连接肽前后形成α螺旋稳定二级结构的连接肽。
本发明的优选方案,光诱导元件上游通过柔性肽,优选连接肽1与重组嵌合抗原受体的抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区或T细胞信号传导区的下游相连,连接肽1的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示。光诱导元件下游通过刚性肽,优选连接肽2与重组嵌合抗原受体的抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区或光效应元件的上游相连,连接肽2的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。
本发明的一个优选的方案,所述的重组嵌合抗原受体,光诱导元件为LOV2,抗原结合区为CD19 scFv、细胞外铰链区为CD8铰链区、跨膜结构区为CD8跨膜结构区、共刺激信号传导区为4-1BB共刺激信号传导区、T细胞信号传导区为CD3 ζ信号传导区。当光诱导元件位于T细胞信号传导区之后时,光效应元件为人白蛋白。
本发明的一个优选的方案,所述的重组嵌合抗原受体, CD19 scFv氨基酸序列如SEQ ID No:3所示、CD8铰链区氨基酸序列如SEQ ID No:4所示、CD8跨膜结构区氨基酸序列如SEQ ID No:5所示、4-1BB共刺激信号传导区氨基酸序列如SEQ ID No:6所示、光诱导元件LOV2氨基酸序列如SEQ ID No:1,CD3 ζ信号传导区氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。当光诱导元件位于T细胞信号传导区之后时,光效应元件氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明的一个优选的方案,所述的重组嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID No:8-12所示。
SEQ ID No:8对应的重组嵌合抗原受体为:CD19 scFv-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:9对应的重组嵌合抗原受体为:CD19 scFv-CD8铰链区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:10对应的重组嵌合抗原受体为:CD19 scFv-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-连接肽1-LOV2-连接肽2-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:11对应的重组嵌合抗原受体为:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:12对应的重组嵌合抗原受体为:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-人白蛋白。
本发明的另一目的在于提供编码上述具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的基因,包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域的基因序列,在重组嵌合抗原受体基因序列的两端或者各功能结构域基因序列之间***光诱导元件基因。
所述光诱导元件选自隐花色素(CRY)、紫外和蓝光敏感黄素蛋白(LOV和BLUF)和光敏色素(PHY)中的一种或几种,进一步优选拟南芥(水稻、果蝇、番茄、大麦、蕨类、苔藓、藻类、非洲爪蟾、小鼠、人等)的CRY,拟南芥(燕麦等)的LOV2,植物的PHY。更优选来源于燕麦的LOV2(aa 404-546 of Avena sativa Phototropin 1,NPH1-1,GenBank: AAC05083.1)其核苷酸序列如SEQ ID No:13所示。
本发明所述的重组嵌合抗原受体,所述抗原结合区基因选自人抗体、人源化抗体、抗原结合片段的基因或其组合,可以是完整的抗体,Fab、Fab'、 (Fab')2、Fv片段或者单链可变区片段scFv基因。
优选的,本发明所述抗原结合区功能结构域结合肿瘤抗原。所述肿瘤为***癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病(慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、腺癌、大肠癌、乳腺癌、实体瘤、头颈部癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、转移性癌、多形性胶质母细胞瘤等。优选的,所述肿瘤抗原选自CD19,CD20,CD22,CD33, CD138,ROR1,Her2/neu,间皮素,CD33/IL3Ra,c-Met,PSMA,CAIX,CEA、PSCA,GD2,糖脂F77、EGFRvIII,GD-2,FAP,FBP,NY-ESO-1TCR,MAGEA3TCR或其任意组合。
优选的,本发明所述共刺激信号传导区基因选自CD27,CD28,CD137(4-1BB),CD134(OX40),CD30,CD40,PD-1,LFA-1,CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区基因、与CD3ζ特异性结合的配体基因或其任意组合。
优选的,本发明所述跨膜结构区基因选自CD3、CD4、CD8或CD28蛋白分子的跨膜结构区基因。
优选的,本发明所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD28、CD137 、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ蛋白分子的T细胞信号传导区基因中的一种或几种。
本发明的一个优选的方案,所述的重组嵌合抗原受体基因,在抗原结合区基因和跨膜结构区基因之间还有细胞外铰链区基因,所述细胞外铰链区基因,优选CD8蛋白分子的铰链区或免疫球蛋白IgG铰链区的基因或其组合。光诱导元件基因可以位于抗原结合区与细胞外铰链区基因之间、细胞外铰链区与跨膜结构区基因之间、跨膜结构区与共刺激信号传导区基因之间、共刺激信号传导区与T细胞信号传导区基因之间或者T细胞信号传导区基因之后。
本发明的一个优选的方案,当光诱导元件基因位于T细胞信号传导区基因之后时,其末端可以连接有光效应元件基因,所述光效应元件优选人白蛋白,核苷酸序列如SEQ IDNo:14所示。
本发明的优选方案,光诱导元件基因上游通过连接肽1基因与重组嵌合抗原受体的抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区或T细胞信号传导区基因的下游相连,连接肽1的核苷酸序列如SEQ ID No:27所示。光诱导元件基因下游通过连接肽2基因与重组嵌合抗原受体的抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区或光效应元件基因的上游相连,连接肽2的核苷酸列如SEQ ID No:28所示。
本发明的一个优选方案,所述的重组嵌合抗原受体基因,抗原结合区为CD19scFv,核苷酸序列如SEQ ID No:15所示、细胞外铰链区为CD8铰链区,核苷酸序列如SEQ IDNo:16所示、跨膜结构区为CD8跨膜结构区,核苷酸序列如SEQ ID No:17所示、共刺激信号传导区为4-1BB共刺激信号传导区,核苷酸序列如SEQ ID No:18所示、T细胞信号传导区为CD3ζ信号传导区,核苷酸序列如SEQ ID No:19所示。当光诱导元件位于T细胞信号传导区之后时,光效应元件核苷酸序列如SEQ ID No:14所示。本发明的一个优选的方案,所述的重组嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQ ID No:20-24所示。
SEQ ID No:20对应的重组嵌合抗原受体基因为:CD19 scFv-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:21对应的重组嵌合抗原受体基因为:CD19 scFv-CD8铰链区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:22对应的重组嵌合抗原受体基因为:CD19 scFv-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-连接肽1-LOV2-连接肽2-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:23对应的重组嵌合抗原受体基因为:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD3 ζ信号传导区。
SEQ ID No:24对应的重组嵌合抗原受体基因为:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-人白蛋白。
本发明的另一目的在于提供表达本发明所述具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的重组载体、表达框、慢病毒载体或细胞,含有上述重组嵌合抗原受体基因。
本发明的一个优选方案,表达载体为Lenti-EF1α,重组载体为Lenti-liCAR,具体为将重组嵌合抗原受体序列,核苷酸序列如SEQ ID No:20-24任一项所示,***表达载体Lenti-EF1α的BamH I和EcoR I酶切位点间所得到的载体。
本发明的一个优选方案,所述细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞,记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。
本发明的一个目的是提供具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体制备方法,可包括以下步骤:
1)共表达载体的构建
运用分子克隆方法将光诱导元件LOV2基因克隆入质粒Lenti-EF1α-CD19CAR(CD3ZetaQQ)构建具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的共表达载体;
2)慢病毒载体的包装
利用293T细胞包装获得带有光诱导CAR分子的慢病毒载体。所述慢病毒载体为将上述共表达载体与慢病毒包装必须的结构蛋白表达质粒共转高效组装慢病毒的细胞中所得的具有表达重组基因的慢病毒。本发明的一个优选方案,将上述共表达载体与慢病毒结构蛋白表达载体pGP和pVSVG共同转染HEK 293T细胞培养得到慢病毒载体;
3)慢病毒介导具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体转染细胞。
本发明提供的方法包括如下步骤:构建目的基因慢病毒包装载体,包装慢病毒,慢病毒介导的T细胞转基因,重组CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤活性具有可逆光控制特性,即仅在光照条件下具有杀伤能力。
本发明优点:
本发明提供了一种具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体,实验证明,该重组蛋白通过慢病毒载体在T细胞中表达后,T细胞的杀伤毒性受到LOV2的可逆控制。本发明所述的具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体保持了CAR-T的靶向性和杀伤性的同时对此两种特性增加了控制开关,为CAR-T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。
附图说明
图1为本发明所述具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体结构示意图。
图2为转染本发明所述具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的Jurkat-CAR5~Jurkat-CAR9细胞活性光诱导控制研究结果。
图3 Jurkat-CAR5分别在光照和避光条件下不同效靶比的细胞杀伤能力实验结果。
图4 Jurkat-CAR6分别在光照和避光条件下不同效靶比的细胞杀伤能力实验结果。
图5 Jurkat-CAR7分别在光照和避光条件下不同效靶比的细胞杀伤能力实验结果。
图6 Jurkat-CAR8分别在光照和避光条件下不同效靶比的细胞杀伤能力实验结果。
图7 Jurkat-CAR9分别在光照和避光条件下不同效靶比的细胞杀伤能力实验结果。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
下述实例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1、具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的设计
本发明选用临床效果较好的CD19-CAR基因,构成元件依次如下:CD19 scFv、CD8hinge、CD8 transmembrane、4-1BB intracellular、CD3ζ;
本发明所用LOV2(aa 404-546 of Avena sativa Phototropin 1,NPH1-1,GenBank: AAC05083.1)来源于燕麦(Avena sativa),根据人(Homo spaice)密码子偏好性进行密码子优化,氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,核苷酸序列如SEQ ID No:13所示。
将LOV2分别***到CD19-CAR的抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域前后或之间,具体如下:
liCAR5:CD19 scFv-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区(氨基酸序列如SEQ ID No:8所示,核苷酸序列如SEQ IDNo:20所示)。
liCAR6:CD19 scFv-CD8铰链区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区(氨基酸序列如SEQ ID No:9所示,核苷酸序列如SEQ IDNo:21所示)。
liCAR7:CD19 scFv-CD8铰链区-CD8跨膜结构区-连接肽1-LOV2-连接肽2-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区(氨基酸序列如SEQ ID No:10所示,核苷酸序列如SEQID No:22所示)。
liCAR8:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-CD3 ζ信号传导区(氨基酸序列如SEQ ID No:11所示,核苷酸序列如SEQID No:23所示)。
liCAR9:CD19 scFv- CD8铰链区-CD8跨膜结构区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3 ζ信号传导区-连接肽1-LOV2-连接肽2-人白蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No:12所示,核苷酸序列如SEQ ID No:24所示)。
连接肽1氨基酸序列如SEQ ID No:25所示,核苷酸序列如SEQ ID No:27所示;连接肽2氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,核苷酸序列如SEQ ID No:28所示。
实施例2、具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的表达
一、共表达载体Lenti-liCAR5、Lenti-liCAR6、Lenti-liCAR7、Lenti-liCAR8和Lenti-liCAR9的构建
Lenti-EF1α-CD19CAR(CD3ZetaQQ)购自爱康得生物医学技术(苏州)有限公司(http://www.icartab.com.cn)。质粒pUCK-AsLOV2购自公司。
以经典CD19-CAR分子(SEQ ID No:45)和根据人密码子偏好性优化的LOV2分子(SEQ ID No:13)为模板,分别设计引物如下:
liCAR5:
CALOV(EcoRI):5’-TTCGAATTCGCCGCCACCATG-3’ SEQ ID No:29;
CALOV5aR:5’-GCTCCCACTCCCGCTTCCGCTGGACACGGTGACCAGA-3’ SEQ ID No:33;
GSLOVF:5’-GGAAGCGGGAGTGGGAGCCTTGCAACCACCTTGGAAAG-3’ SEQ ID No:31;
EALOVR:5’-CCGCTGCTTCTTTGGCCGCTGCTTCCAGCTCTTTGGCGGCCTCATC-3’ SEQ IDNo:32;
EALOV5cF:5’-AGCGGCCAAAGAAGCAGCGGCCAAAACCACTACCCCAGCACCGA-3’ SEQ IDNo:34;
CALOV(BamHI):5’-GCGGGATCCTCACCGAGGCGGC-3’ SEQ ID No:30;
liCAR6:
CALOV(EcoRI):5’-TTCGAATTCGCCGCCACCATG-3’ SEQ ID No:29;
CALOV6aR:5’-GCTCCCACTCCCGCTTCCATCGCAGGCGAAGTCAA-3’ SEQ ID No:35;
GSLOVF:5’-GGAAGCGGGAGTGGGAGCCTTGCAACCACCTTGGAAAG-3’ SEQ ID No:31;
EALOVR:5’-CCGCTGCTTCTTTGGCCGCTGCTTCCAGCTCTTTGGCGGCCTCATC-3’ SEQ IDNo:32;
EALOV6cF:5’-AGCGGCCAAAGAAGCAGCGGCCAAAATCTACATTTGGGCCCCT-3’ SEQ ID No:36;
CALOV(BamHI):5’-GCGGGATCCTCACCGAGGCGGC-3’ SEQ ID No:30;
liCAR7:
CALOV(EcoRI):5’-TTCGAATTCGCCGCCACCATG-3’ SEQ ID No:29;
CALOV7aR:5’-GCTCCCACTCCCGCTTCCACAGTAAAGAGTGATCA-3’ SEQ ID No:37;
GSLOVF:5’-GGAAGCGGGAGTGGGAGCCTTGCAACCACCTTGGAAAG-3’ SEQ ID No:31;
EALOVR:5’-CCGCTGCTTCTTTGGCCGCTGCTTCCAGCTCTTTGGCGGCCTCATC-3’ SEQ IDNo:32;
EALOV7cF:5’-AGCGGCCAAAGAAGCAGCGGCCAAAAAGCGCGGTCGGAAGA-3’ SEQ ID No:38;
CALOV(BamHI):5’-GCGGGATCCTCACCGAGGCGGC-3’ SEQ ID No:30;
liCAR8:
CALOV(EcoRI):5’-TTCGAATTCGCCGCCACCATG-3’ SEQ ID No:29;
CALOV8aR:5’-GCTCCCACTCCCGCTTCCCAGTTCGCAGCCGCCTTCC-3’ SEQ ID No:39;
GSLOVF:5’-GGAAGCGGGAGTGGGAGCCTTGCAACCACCTTGGAAAG-3’ SEQ ID No:31;
EALOVR:5’-CCGCTGCTTCTTTGGCCGCTGCTTCCAGCTCTTTGGCGGCCTCATC-3’ SEQ IDNo:32;
EALOV8cF:5’-AGCGGCCAAAGAAGCAGCGGCCAAACGCGTGAAATTCAGCCGCAG-3’ SEQ IDNo:40;
CALOV(BamHI):5’-GCGGGATCCTCACCGAGGCGGC-3’ SEQ ID No:30;
liCAR9:
CALOV(EcoRI):5’-TTCGAATTCGCCGCCACCATG-3’ SEQ ID No:29;
CALOV9aR:5’-GCTCCCACTCCCGCTTCCTCACCGAGGCGGCA-3’ SEQ ID No:41;
GSLOVF:5’-GGAAGCGGGAGTGGGAGCCTTGCAACCACCTTGGAAAG-3’ SEQ ID No:31;
HSALOVR:5’-CTTTAAACCGATGAGCAACCTCATCAATCTCCTCGGCAG-3’ SEQ ID No:42;
LOVHSAF:5’-AGACTGCCGAGGAGATTGATGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAG-3’ SEQ ID No:43;
LOVHSA(BamHI):5’-CGCGGATCCCTATTAAAGGCCTAAGGCAG-3’ SEQ ID No:44;
以质粒Lenti-EF1α-CD19CAR为模板,通过融合PCR(使用NEB公司Q5高保真DNA聚合酶)的方法扩增获得liCAR5,liCAR6,liCAR7,liCAR8和liCAR9的核苷酸分子片段。通过引物添加限制性内切酶的方法分别在目的片段的两段加上EcoRI和BamHI酶切位点。
PCR条件:
第一轮PCR:预变性98°C,30s;变性98°C,10s,退火58°C,30s,延伸72°C,45s,30个循环;终延伸72°C,2min;降温4°C。将此轮PCR产物作为模板和上下游引物共同加入反应***,进行第二轮PCR:预变性98°C,30s;变性98°C,10s,退火58°C,30s,延伸72°C,1min,30个循环;终延伸72°C,2min;降温4°C。用EcoRI与BamHI双酶切质粒Lenti-EF1α-CD19CAR及回收的融合PCR产物(为liCAR各个核苷酸分子片段),质粒反应体系为30ul(1ul的质粒,3μl的Buffer,0.5μl的EcoRI,0.5μl的BamHI,25μl的ddH2O),PCR回收产物反应体系30μl(20μl的PCR回收产物,3μl的Buffer,0.5μl的EcoRI,0.5μl的BamHI,6μl的ddH2O),37°C水浴30min。反应结束用1%琼脂糖凝胶电泳分析,分别回收目的片段。用连接酶将目的片段克隆到质粒载体段中,反应体系为10μl(0.5μl的载体,8μl的融合PCR产物,0.5μl的T4DNA连接酶,1μl的Buffer),4°C连接过夜。将连接体系放入70°C水浴灭活酶10min,置冰上冷却。将连接产物转化DH5α感受态细胞,经冰浴30min,42°C水浴热休克90s,再次立即置冰上5min,加入LB液体培养基摇菌后,将菌液涂在氨苄青霉素(Amp+)抗性的LB平板上,37°C培养箱倒置培养培养过夜。次日观察平板上菌落生长情况。挑取平板上Amp筛选的单克隆,进行菌落PCR鉴定,用1%琼脂糖凝胶电泳分析,筛选出扩增条带与预期相符的单克隆菌落。将筛选出的单克隆扩大培养,次日保存一部分菌液为15%甘油菌于-80°C冰箱中。剩余菌液用质粒DNA少量提取试剂盒提取质粒。将提取的质粒进行DNA测序鉴定。经鉴定符合要求的含有嵌合抗原受体基因片段的慢病毒转移载体,分别命名为Lenti-liCAR5、Lenti-liCAR6、Lenti-liCAR7、Lenti-liCAR8和Lenti-liCAR9;然后测序鉴定。测序表明,编码liCAR5的各基因片段序列和连接正确,其核苷酸序列如SEQ ID No:20所示,氨基酸序列如SEQ ID No:8所示;编码liCAR6的各基因片段序列和连接正确,其核苷酸序列如SEQ ID No:21所示,氨基酸序列如SEQ ID No:9所示;编码liCAR7的各基因片段序列和连接正确,其核苷酸序列如SEQ ID No:22所示,氨基酸序列如SEQ ID No:10所示;编码liCAR8的各基因片段序列和连接正确,其核苷酸序列如SEQ ID No:23所示,氨基酸序列如SEQ ID No:11所示;编码liCAR9的各基因片段序列和连接正确,其核苷酸序列如SEQ ID No:24所示,氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。
二、慢病毒载体Lentivial的包装
将培养的HEK 293T细胞接种于多聚赖氨酸处理的100mm培养皿中,待细胞融合度达70%-80%时,换无血清DMEM培养液,37°C、5% CO2培养。2h后,用三质粒磷酸钙法包装慢病毒,
以Lenti-liCAR5为例,其具体步骤如下:
在1个10ml离心管中加慢病毒载体Lenti-liCAR5质粒30 μg,20 μg 的pGP,10 μg的pVSVG,2 mol/LCaCl2 124 ul,加双蒸水补全至1mL,再加1mL 2 × Hank,充分混匀,室温静置20min,然后逐滴加入到上述100mm培养皿中,37°C、5% CO2培养6-8小时更换新鲜5%FBS的DMEM培养基继续培养。在倒置显微镜下观察转染24、48、72h后的细胞生长状况并每天收集上清。离心除去细胞碎片,用0.45μm滤器过滤。过滤后,将病毒上清液移入Millipore浓缩柱,离心30min,浓缩至100~200uL,将浓缩的病毒液移入EP管,-80°C保存备用(或者将病毒上清使用超速离心机以4°C、7000×g离心2h后弃去上清,以Opti-MEM重悬病毒颗粒,-80°C保存备用)。
参照上述方法分别获得慢病毒载体Lentivial的包装的Lenti-liCAR6-9。
三、慢病毒介导光诱导CAR转染Jurkat细胞。
将生长状态良好的Jurkat细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板中,加无血清RPMI1640培养基至2 ml,加入2ul 8 μg/L Polybrene,加入100μl纯化病毒液,混匀,于37°C、5% CO2培养。培养至8h后,换成10%FBS的RPMI1640培养,48h后观察荧光。分别将得到的含有慢病毒载体Lenti-liCAR5-9的上清经过离心纯化后,感染Jurkat细胞传代培养,加入100untis/mL IL-2促进细胞增殖分化,获得Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9。
实施例3、具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体T细胞杀伤活性研究
接种100μl 1×104/孔的靶细胞(白血病细胞Raji)到96孔细胞培养板中,按照2:1效靶比分别加入Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞(表达liCAR5-9的Jurkat的细胞),补培养液至200μl,分别在光照条件下(LED灯,465nm,30μmol m-2 s-1,曝光4h)和避光条件下的37°C、5% CO2培养箱共培养48h。
(1)实验一
共培养48h后,分别收集细胞培养悬液经过离心收取上清,使用人IL-2 ELISA kit检测IL-2含量,具体步骤参见人IL-2 ELISA kit使用说明书。具体结果如图2所示。图2表明Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞在光照条件下的IL-2活性与经典CAR-T细胞相似,但在避光条件下,显著性低于各自在光照条件下和经典CAR-T的活性。说明本发明设计的Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞活性受到光诱导控制。
(2)实验二
共培养48h后,收集细胞培养悬液,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞活性。接种100μl 1x104/孔的靶细胞Raji到96孔细胞培养板中,按照不同效靶比(E/T值0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1)分别加入Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞,补培养液至200μl,分别在光照和避光条件下的37°C、5% CO2培养箱共培养48h。共培养48h后,从细胞培养箱里取出细胞培养板,在只接种Raji细胞的培养孔中加入试剂盒提供的乳酸脱氢酶(LDH)释放剂,加入量为原有培养液体积的10%(20μl)。加入LDH释放剂后,反复吹打数次混匀,然后继续在细胞培养箱中孵育。1h后,将培养细胞板用多孔板离心机400×0g离心5min。分别取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相应孔中,随即进行样品测定。各孔分别加入60μl的LDH检测工作液。混匀,室温避光孵育30min,然后在490nm处测定光密度值。详细步骤参见乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒使用说明书。具体结果如图3-7所示,结果显示随着效靶比增高,过表达重组嵌合抗原受体的Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞杀伤力也随之提升。在光照条件下,与经典型CD19-CAR T细胞相似的剂量效应表明了这些过表达重组嵌合抗原受体的Jurkat细胞的特异性杀伤能力没有因为修饰而改变;而避光条件下的Jurkat-CAR5,Jurkat-CAR6,Jurkat-CAR7,Jurkat-CAR8,Jurkat-CAR9细胞的杀伤能力较经典型CAR T低下表明其活性未完全显示。这些结果表明,本发明所述的的光控制重组嵌合抗原受体的激活通路受到光照诱导而激活T细胞杀伤活性。由此,光照成为CAR-T治疗中控制细胞杀伤能力的激活条件。
Claims (14)
1.具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体,包括抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域,其特征在于在重组嵌合抗原受体的N端、C端或者各功能结构域之间***光诱导元件,所述光诱导元件为LOV2,氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,所述抗原结合区为CD19 蛋白分子的scFv,氨基酸序列如SEQ ID No:3所示,细胞外铰链区为CD8蛋白分子的铰链区,氨基酸序列如SEQ ID No:4所示,跨膜结构区为CD8蛋白分子的跨膜结构区,氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,共刺激信号传导区为4-1BB蛋白分子的共刺激信号传导区,氨基酸序列如SEQ ID No:6所示,T细胞信号传导区为CD3 ζ蛋白分子的信号传导区,氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。
2.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于所述光诱导元件位于抗原结合区与细胞外铰链区之间、细胞外铰链区与跨膜结构区之间、跨膜结构区与共刺激信号传导区之间、共刺激信号传导区之间与T细胞信号传导区之间或者T细胞信号传导区之后。
3.如权利要求2所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于所述光诱导元件位于T细胞信号传导区之后,其末端连接有光效应元件,所述光效应元件为人白蛋白。
4.如权利要求3所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于所述光效应元件氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区各功能结构域以及光诱导元件可以直接相连,也可以通过连接肽连接各功能结构域。
6.如权利要求5所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于所述连接肽的氨基酸序列如SEQID No:25-26所示。
7.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体,其特征在于所述的重组嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID No:8-12所示。
8.一种具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体基因,其特征在于编码如权利要求1-7任一项所述的重组嵌合抗原受体,包括抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域的基因序列,在重组嵌合抗原受体基因序列的两端或者各功能结构域基因序列之间***光诱导元件基因,所述光诱导元件为LOV2,基因序列如SEQ ID No:13所示,所述光诱导元件基因位于抗原结合区与细胞外铰链区基因之间、细胞外铰链区与跨膜结构区基因之间、跨膜结构区与共刺激信号传导区基因之间、共刺激信号传导区之间与T细胞信号传导区基因之间或者T细胞信号传导区基因之后,所述抗原结合区为CD19 scFv,核苷酸序列如SEQ ID No:15所示、细胞外铰链区为CD8铰链区,核苷酸序列如SEQ ID No:16所示、跨膜结构区为CD8跨膜结构区,核苷酸序列如SEQ ID No:17所示、共刺激信号传导区为4-1BB共刺激信号传导区,核苷酸序列如SEQ ID No:18所示、T细胞信号传导区为CD3 ζ信号传导区,核苷酸序列如SEQ ID No:19所示。
9.如权利要求8所述的重组嵌合抗原受体基因,其特征在于所述光诱导元件基因位于T细胞信号传导区基因之后,其末端连接有光效应元件基因,所述光效应元件基因序列如SEQID No:14所示。
10.如权利要求8或9所述的重组嵌合抗原受体基因,其特征在于抗原结合区、细胞外铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区各功能结构域基因以及光诱导元件基因可以直接相连,也可以通过连接肽基因连接各功能结构域。
11.如权利要求10所述的重组嵌合抗原受体基因,其特征在于所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No:27-28所示。
12.如权利要求8所述的重组嵌合抗原受体基因,其特征在于所述的重组嵌合抗原受体基因序列如SEQ ID No:20-24所示。
13.表达具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的重组载体、表达框或细胞,其特征在于含有如权利要求8-12任一项所述的重组嵌合抗原受体的基因。
14.如权利要求13所述的表达具有光诱导元件的重组嵌合抗原受体的重组载体、表达框或细胞,其特征在于所述细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、CIK细胞。
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