CN109535260B

CN109535260B - 一种靶向cd46的人源嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN109535260B
Application number: CN201811396656.4A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞; 吴炯; 孟庆涛
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: CN109535260A

Abstract

本发明公开了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述的单链抗体hCD46scFV与其他结构由连接肽所连接。本发明还公开了靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体以及慢病毒。本发明还公开了该嵌合抗原受体的应用。该嵌合抗原受体中的scFV具有抗人CD46的特异性，能特异性结合到靶抗原上，通过联合重组腺病毒的使用发挥针对结直肠癌细胞的细胞毒效应，所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于表面CD46阳性的肿瘤治疗。

Description

一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

设计一种活体之外能够产生自身抗原特异性的T细胞，通过肿瘤靶向特异性的T细胞介导免疫反应是肿瘤治疗的方法的研究方向。目前，已证实的肿瘤靶向的特异性T细胞分离及转移已经在治疗黑色素瘤、血液肿瘤中取得了不错的临床结果。

嵌合抗原受体(CAR，chimeric antigen receptor)是通过外源性的基因转导技术使T细胞获得新的特异性。CAR作为一种合成受体，是由能够识别肿瘤相关的特异性抗原scFV(由抗体中的VL区域氨基酸序列与VH区域氨基酸序列通过Linker相连组成)，通过其铰链结构与具有活化T细胞的功能的一个或者多个信号转导区域相关的靶向部位结合，使scFV由跨膜区域与T细胞中活化增殖的信号区域偶联，通过scFV来识别肿瘤的特异性抗原，产生活化T细胞的信号，再回输到患者体内，活化增殖的T细胞能够通过非MHC限制性模式展现较强的抗肿瘤能力。

第一代CAR技术的信号转导结构区域源自CD3zeta的细胞质部分区域或者Fc受体的γ链。然而，第一代的CAR受体中缺少T细胞共刺激信号，导致T细胞的激活只能发挥其瞬间效应，在体内具有存活时间较短、细胞因子的分泌少等不足。第二代的CAR在第一代的基础上增加了共刺激信号分子的细胞内结构区域，提供了能够活化T细胞的两种信号，包括CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB等，提高了CAR改造T细胞的存活率以及增殖率，并且增强了细胞因子的分泌功能，从而能够突破肿瘤的微环境中存在的免疫抑制。

CAR-T目前在血液***肿瘤中应用最为广泛，并且临床疗效确切(CD19，CD20)，但是在实体瘤上的临床研究相对较少，针对实体瘤的治疗，CAR-T细胞治疗技术遇到了的技术瓶颈为特异性靶点较少，T细胞无法有效浸润及肿瘤内部免疫抑制性。

CD46是一种具有跨膜结构的细胞调节蛋白，是肿瘤中较特异的标志物。其在多种实体肿瘤中都有较高的表达，如膀胱癌，卵巢癌，乳腺瘤，结直肠癌等。CD46的表达强度与肿瘤的恶性程度，上皮间质转化以及转移有关。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体的scFV区域有抗人的CD46特异性，能够特异性的结合在靶抗原上，从而发挥其针对结直肠癌细胞的细胞毒作用，所述的嵌合抗原受体同时能对T淋巴细胞进行修饰，T细胞经过修饰后可以用于癌细胞表面CD46阳性肿瘤治疗，尤其对结直肠癌细胞具有特异性的杀伤作用。本发明首次报道CD46在结直肠癌中特异性表达增加，CD46的表达强度与肿瘤的恶性程度相关，且在结直肠癌细胞表面高表达。因此，CD46是一种可以用于结直肠癌等肿瘤的免疫治疗的潜在靶抗原。而鼠源的抗体直接输入人体后会产生宿主抗移植物反应，严重影响修饰后T细胞针对CD46阳性的肿瘤细胞的杀伤能力。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的制备方法。

本发明解决的技术问题是靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的同时联合使用重组腺病毒，该重组腺病毒表达调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(regulated onactivation normal T cell expressed and secreted，RANTES，NM_002985.2)和白细胞介素-15(interleukin 15,IL-15，NM_000585.4)，RANTES和IL-15可促进T细胞的增殖及迁移，增强car-修饰T细胞在实体肿瘤中的功能。

本发明还要解决的技术问题是提供了靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体在制备检测CD46阳性的肿瘤试剂或治疗CD46阳性的肿瘤药物方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒，其包含所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，所述T细胞刺激信号转导结构为人CD8铰链区及CD8跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，所述单链抗体hCD46scFV与CD8铰链区通过连接肽连接。该靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体其结构如图1所示。

其中，上述单链抗体hCD46scFV中，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述重链和轻链通过GGGGSGGGGSGGGGS连接。

其中，上述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体由针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV、CD8铰链区及跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成hCD46scFV-CD8Hinge-CD8membrane-CD137-CD3zeta。

其中，上述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

其中，上述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

其中，上述单链抗体hCD46scFV的5’端含有信号肽CD8a，该信号肽的氨基酸序列为MALPVTALLLPLALLLHAARP所示。

一种含有所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。尤其是含有嵌合抗原受体hCD46scFV-CD8 Hinge-CD8 membrane-CD137-CD3zeta编码基因的表达载体。

一种含有所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒。

本发明内容还包括所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒的包装方法，包括以下步骤：

1)针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV的获得；

2)嵌合抗原受体hCD46-CAR抗人慢病毒质粒的构建；

3)慢病毒的包装、浓缩及滴度测定。

其中，上述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体制备检测CD46阳性的肿瘤试剂或治疗CD46阳性的肿瘤药物方面的应用。本发明所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于表面CD46阳性的肿瘤治疗。

其中，上述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体在制备检测直肠癌试剂或治疗结直肠癌药物方面的应用。

一种检测试剂盒，其包含所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。

鼠源的单链抗体在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(HAMA)，严重影响修饰后的T细胞对CD46阳性肿瘤细胞的杀伤作用，本发明针对抗鼠CD46单克隆抗体的scFV基因序列，采用框架置换及随机突变的方案，将CDR区氨基酸与人源的框架进行组合，构建人源化的抗体序列，并通过重叠延伸PCR技术加入linker形成抗人CD46特异性scFV，人源化的单链抗体hCD46LC2scFV将抗体中的框架区替换为人源的氨基酸序列，可以最大程度额避免HAMA。

其中，所述鼠源CD46单克隆抗体的scFV轻链氨基酸序列参见序列表中的SEQ IDNO.1和NO.2，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和NO.4。

本发明利用抗人CD46单链抗体构建出嵌合抗原受体即hCD46-CAR，并使用信号肽CD8a引导嵌合抗原受体跨膜表达将截短型的EGFR与嵌合抗原受体阅读框连接起来，可以通过检测EGFR的表达间接反映嵌合抗原受体的表达效率。表达该嵌合抗原受体的T细胞具有独特性，其具有肿瘤特异性杀伤功能，能够在临床中用于肿瘤表面CD46阳性的肿瘤治疗。

本发明还包括利用基因工程编辑技术获得编码嵌合抗原受体hCD46scFV-CD8Hinge-CD8 membrane-CD137-CD3zeta的融合基因，将该基因片段***慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。

本发明还通过流式细胞术、LDH细胞毒性分析实验、ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明经本发明的嵌合抗原受体修饰的T细胞对结直肠癌细胞具有特异杀伤作用，能够特异性识别并杀伤表面CD46阳性的肿瘤细胞，因此，本发明所述的嵌合抗原受体可应用于结直肠癌免疫治疗中。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明的靶向CD46的人源嵌合抗原受体，将有较强的免疫原性的鼠源框架区域替换为人源的氨基酸序列，尽可能的避免宿主抗移植物反应。人源化后的抗体具有抗人CD46的特异性，能够特异结合到靶抗原上，并发挥出针对结直肠癌细胞的细胞毒作用，经所述人源化抗体能够用于T淋巴细胞的修饰，T细胞经过修饰后可以用于癌细胞表面CD46阳性肿瘤治疗，尤其对结直肠癌细胞具有特异性的杀伤作用。

附图说明

图1为本发明的抗人hCD46-CAR的结构示意图；

图2为本发明实施例1的hCD46抗体表达载体的酶切电泳图；泳道1：pCAR-46-puro，

泳道2：pCAR-46-puro Digested with EcoRI/XbaI，泳道3：DNA Marker；

图3为本发明实施例1流式细胞仪检测hCD46LC1scFV抗体与SW620细胞表面的靶蛋白结合水平结果图；

图4为本发明实施例1流式细胞仪检测hCD46LC2scFV抗体与SW620细胞表面靶蛋白结合水平结果图；

图5为本发明实施例3荧光定量PCR结果WPRE基因标准曲线图；

图6为本发明实施例3荧光定量PCR结果ALB基因标准曲线图；

图7为本发明实施例5的CD46 CAR-T细胞对SW620细胞杀伤效靶比实验结果图；

图8为本发明实施例6的ELISA检测CAR-T细胞分泌细胞因子白介素2的水平；

图9为本发明荷瘤模型中CAR-CD46联合重组腺病毒对肿瘤细胞杀伤能力验证的实验流程图；

图10为本发明CAR-CD46联合重组腺病毒在NCG小鼠荧光活体中成像的检测图；

图11为本发明CART细胞处理NCG小鼠后的小鼠肿瘤体积图；

图12为本发明CART细胞处理NCG小鼠后的小鼠生存曲线图；

图13为本发明CART细胞处理NCG小鼠后的小鼠肿瘤组织免疫组化结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV的获得

通过生物信息分析手段对鼠源的抗体进行人源化设计，从而获取人源化抗体hCD46scFV编码核苷酸的序列，经过纯化单链抗体hCD46scFV，通过实验进行验证，具体如下：

1、设计人源化抗体序列

根据已有Anti-CD46鼠源抗体的基因序列(参见NCBI的genbank的NM_010778.4)通过框架置换以及随机突变方法，将CDR区域氨基酸与人源framework进行组合，设计出人源化抗体hCD46scFV序列，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2、构建人源化抗体的表达载体pFUSE-hIgG1-FC1-hCD46scFV和

pFUSE-hIgG1-FC2-hCD46scFV

将上述设计的人源化抗体的核苷酸序列信息进行基因合成，合成后分别将其克隆至表达载体pFUSE-hIgG1-FC1(Invivogen公司购买)和pFUSE-hIgG1-FC2(Invivogen公司购买)中，重组载体经过酶切鉴定确认无误后，送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序。载体经过酶切验证结果显示目的基因***片段大小正确，之后采用无内毒素的质粒大抽试剂盒，制备转染级别质粒pFUSE-hIgG1-FC1-hCD46scFV和pFUSE-hIgG1-FC2-hCD46scFV。

3、人源化单链抗体hCD46scFV的表达与纯化

具体步骤如下：

1)从液氮中复苏293T细胞，使用FreeStyle293培养基(Thermo Fisher公司购买)，在37℃含有5％CO2培养箱中进行培养。将细胞连续传5代。

2)进行细胞转染的前一天，给细胞更换新鲜的培养基，并将细胞密度调整至5×10⁵个/mL，再过夜培养；

3)-80℃冰箱中取出100μM步骤2制备得到的质粒pFUSE-hIgG1-FC1-hCD46scFV(Vector)和pFUSE-hIgG1-FC2-hCD46scFV(Vector)和聚乙烯亚胺(PEI)，室温解冻后按照PEI/Vector＝3:1配制转染复合物，质粒用量调整为2.5μg/mL，再将PEI分别加到质粒中，用移液器迅速吹打混匀，室温静置15min，将转染复合物轻柔逐滴加到293TBE细胞中，继续培养8小时。

4)分别向培养皿中加入1倍体积的新鲜培养基FreeStyle293培养基，摇匀后过夜培养。

5)由培养箱取出细胞，加入浓度为0.5％的胰蛋白胨Tryptone，摇匀后培养5天。

6)由培养箱取出细胞，4℃2000×g离心15分钟后将上清转移至新的50mL离心管，并加入相同体积pH7.4的PBS缓冲稀释。

7)从4℃冰箱取出Protein A柱子(金斯瑞生物科技公司，货号L00464)，设定流速为1mL/min，使用5倍体积PBS洗涤柱子，之后将上一步中的上清过柱子；全部过柱后，使用pH＝3.0的甘氨酸缓冲液将柱子上结合的抗体洗脱下来，并使用pH＝9.0的Tris缓冲液迅速中和。

8)分别将纯化抗体使用15kDa的半透膜透析过夜，使用的透析介质是PBS缓冲液。

9)将透析袋中液体转移到截留分子量为15KDa的离心过滤柱中，3000×g离心10分钟进行浓缩，最终分别获得人源化抗体hCD46LC1scFV(含有轻链1)和hCD46LC2scFV(含有轻链2)。

4、将人源化抗体hCD46LC1scFV和hCD46LC2scFV进行SDS-PAGE电泳

1)凝胶的制备

分离胶的制备：配制20mL10％聚丙烯酰胺溶液，混合均匀后使用细长头滴管将配置的溶液加至长短玻璃板间的缝隙内，至约8cm高，用1mL注射器取蒸馏水，沿着长玻璃板壁缓慢注入，至约3～4mm高进行水封。等待30min后，凝胶与水封层之间出现折射率不同的明显界线，倒去水封层蒸馏水，用滤纸条吸除多余蒸馏水。

浓缩胶的制备：配制10mL3％聚丙烯酰胺溶液，混合均匀后使用细长头滴管将浓缩胶加到已凝固的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约0.5cm处，将样品槽模板轻轻***到浓缩胶内，约50min后完全凝固。小心拔去上方的样品槽模板，将pH＝8.3的Tris-甘氨酸缓冲液倒入上下储槽，准备加样。

2)样品的处理

分别取步骤3中浓缩的抗体溶液100μL，并加入10μL 100×上样缓冲液后，在100℃沸水浴中放置5min后取出，待冷却后进行电泳。

3)加样

在电极槽中倒入pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液(内含0.1％的SDS)，在上样孔中加入约50μL样品，电泳最初开始时电流设定为10mA；待样品进入分离胶后改为30mA；待染料前沿到达距离硅胶框底边约1.5cm时关闭电源停止电泳。

4)显色

取下凝胶，加入染色液后染色过夜，次日蒸馏水漂洗数次，之后用脱色液脱色至蛋白条带清晰，得知纯化抗体条带清晰，无杂蛋白污染。

5、使用FACS检测人源化抗体hCD46LC1scFV和hCD46LC2scFV

步骤如下：

1)从液氮中复苏CHO-K1细胞(ATCC细胞库)，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养；连续传2代后将细胞调整至对数生长期。

2)使用PEI转染pFUSE-hIgG1-FC1-hCD46scFV及pFUSE-hIgG1-FC2-hCD46scFV质粒，6小时后更换完全培养，过夜培养；

3)更换无血清的培养基F12K培养基，连续培养72小时；

4)取上清与SW620细胞株共孵育，4℃1小时；

5)PBS洗涤3次后，加入PE-Anti-human IgG1二抗(Biolegend公司，HP6017)，孵育30min；

6)使用PBS洗涤细胞5分钟，共3次，之后加500μL PBS进行重悬得到人源化抗体hCD46scFv(hCD46LC1scFV(含有轻链1)和hCD46LC2scFV(含有轻链2))。

7)通过流式细胞仪分析，对人源化抗体hCD46scFv(hCD46LC1scFV(含有轻链1)和hCD46LC2scFV(含有轻链2))进行比较，分析结果如图3、图4所示。

由图3可见，以Light chain1(轻链1)构造的抗体hCD46LC1scFV与靶细胞SW620共孵育后，与细胞表面的靶蛋白结合不明显；由图4可以看出，以Light chain2(轻链2)构造的人源单链抗体hCD46LC2scFV可以显著结合细胞表面的靶蛋白。

实施例2构建人源化抗体CD46scFV-CD137-CD3zeta慢病毒质粒

根据实施例1中的人源化抗体hCD46scFV序列信息，构建CD46scFv-CD137-CD3Zeta慢病毒表达载体，并进行载体的制备，步骤如下：

由实施例1的流式细胞荧光分选技术FACS的结果选择与靶标蛋白结合的抗体序列(light chain2)作为模板，构建抗人hCD46嵌合抗原受体(hCD46-CAR，简称CAR，下同)，T细胞刺激信号转导结构为以人CD8铰链区及跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，获得的hCD46-CAR结构如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

使用信号肽(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)引导CAR的跨膜表达，将截短的EGFR与嵌合抗原受体阅读框架连接起来，从而能够通过检测EGFR的表达强度间接反映出嵌合抗原受体的表达效率。将合成的CAR序列***到慢病毒表达载体Lenti-EF1α-puro(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)，得到CAR慢病毒表达载体Lenti-EF1α-CAR，送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的hCD46scFV-CD8 Hinge-CD8membrane-CD137-CD3zeta序列进行比对，证实序列无误。

制备无内毒素的慢病毒包装质粒Lenti-EF1α-CAR质粒，其中CAR的表达由EF1α启动子驱动，并通过2A肽段与表皮因子生长受体进行连接，CAR序列中包括信号肽，人源化抗体scFv序列、CD137的胞内区域和CD3zeta的胞内区域。与参考序列进行比对，构建的Lenti-EF1α-CAR质粒慢病毒表达载体中pCAR-46-puro(hCD46scFV-CD8 Hinge-CD8 membrane-CD137-CD3zeta)，***的CAR序列准确无误。

测序使用引物序列为：5'-GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGC-3'及

5'-CCAAGAGCAGCAGGCTCTGC-3'。

将制备的CAR慢病毒表达载体pCAR-46-puro使用限制性内切酶EcoRI、XbaI进行双酶切鉴定，证明该重组载体中目的序列***正确。鉴定结果如图2所示。

实施例3包装慢病毒、浓缩以及滴度测定

生产hCD46scFV-CD8 Hinge-CD8 membrane-CD137-CD3zeta慢病毒(Lenti-CD46-CAR)，为制备重组CAR-T细胞做好准备。

1.制备慢病毒Lenti-CD46-CAR

在15cm细胞培养皿中接种5*10⁶个细胞/皿，加入完全培养基(含10％FBS的DMEM高糖培养基)，置于37℃含5％CO₂的培养箱过夜培养。

从冰箱中取出PEI(聚乙烯亚胺购买于PolyScience公司，货号为23966)及慢病毒包装质粒(Lenti-EF1α-CAR、Lenti-Mix，爱康得生物，货号LVPACKAGING50)，室温解冻后用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，使用前温热至室温。取2mLPBS至6孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-EF1α-CAR，11μg Lenti-Mix，移液枪上下吹打充分混匀后加入26μL 100μM PEI，立即用移液器再次上下吹打混匀得到DNA/PEI混合物，室温下静置10分钟。

将上述配制的DNA/PEI混合物缓慢逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿充分混匀。将培养皿置于37℃含5％CO₂培养箱中培养6～8小时，之后将含有转染试剂的培养基弃去，更换为新鲜的完全培养基，将培养皿重新放回培养箱中培养。

连续培养48小时之后收集皿中含病毒的培养基上清，使用0.45μm的滤膜进行过滤，滤液转至无菌离心管中，4℃50000×g离心2小时。离心结束后，在生物安全柜中小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬得到慢病毒Lenti-CD46-CAR，将慢病毒Lenti-CD46-CAR置于-80℃保存。

2.慢病毒滴度测定

1)从液氮中复苏HT1080细胞(ATCC细胞库)后将细胞培养至对数生长期。

2)在24孔板中按照每孔50000个细胞接种HT1080细胞，补充培养基至终体积为500μL，将24孔板置于37℃含5％CO₂培养箱中过夜培养。

3)将慢病毒按10^-2、10^-1、1、10μL的量分别加至上述24孔板中，同时加入浓度为6μg/mL的polybrene(聚凝胺，Sigma公司，货号H9268)。

4)将24孔板重新放入37℃含5％CO₂培养箱中，连续培养96小时。

5)培养结束后，用PBS缓冲液洗涤每孔中的细胞，然后使用Genomic DNAPurification Kit(Lifetech，CAT#K0512)提取基因组DNA，使用NanoDrop2000测定所提基因组DNA的浓度。

6)从冰箱中取出pUC-ALB和pUC-WPRE质粒(爱康得生物，CAT#LVTR12)，分别稀释10倍，制备荧光定量PCR所需的标准曲线样品。

7)按照表1中PCR反应体系配制PCR反应混合液，所用引物的序列以及荧光基团如表2所示。在96孔PCR板中每孔加入5μL基因组DNA样品或标准曲线样品，再向每孔中加入15μL上述配制的PCR反应混合液，使用封膜密封好后短暂离心约1分钟，根据表3中的PCR程序进行PCR反应。PCR反应结束后，使用荧光定量PCR仪配套的软件将所有样品的Ct值导出至电子表格中，采用下面的慢病毒滴度计算公式计算获取的慢病毒滴度。第一步将WPRE基因的Ct值和拷贝数的log值分别作为横纵坐标，绘制标准曲线(如图5所示)；然后将ALB基因的Ct和拷贝数的log值分别作为横纵坐标，绘制标准曲线(如图6所示)。

表1

表2

表3

使用浓缩后的慢病毒感染HT1080细胞，提取其基因组DNA后进行qPCR实验，获得的qPCR标准曲线如图5和图6所示，样品Lenti-CD46-CAR的Ct值如表4所示，

表4

由表4可知，HT1080细胞基因组中可扩增出已稳定整合在HT1080细胞基因组中的慢病毒序列。

Copy WPRE：WPRE基因的拷贝数；

Copy ALB：ALB基因的拷贝数；

Cell No:HT1080细胞的细胞数目；

Volume of virus：病毒液的体积；

由表4和上述公式计算可得，慢病毒滴度为1.87×10⁸TU/mL。

实施例4获得CAR-T细胞

分离得到健康供体的外周血淋巴细胞，进一步分离出其中的T细胞并制备重组CAR-T细胞。

1、原代T细胞的分离

1)上下颠倒T淋巴细胞分离液数次，将Lymphoprep试剂(LymphoPrep，Axis-shield公司，货号07801)充分混匀。

2)在生物安全柜中，向50mL离心管(或15mL离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mL Lymphoprep试剂，备用。

3)使用等体积含2％胎牛血清FBS的PBS缓冲液稀释血样。

4)用移液枪将稀释后的血样小心的沿管壁缓慢加到分离试剂的上层，过程中避免血样与分离试剂混合。

5)将离心机转速下降速度设置为最慢，室温800×g离心20分钟。

6)离心结束后，收集上层中浅黄色的血清至另一无菌离心管中，贮存于-80℃。

7)轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。

8)调整细胞密度至1×10⁸/mL(总体积不超过2.5mL)，重悬于5mL的圆底管中。

9)加入100μl/mL抗体cocktail(StemCell公司)并混匀充分，室温孵育15分钟。

10)用移液枪吹打至少5次，充分混匀，并取磁珠备用。

11)吸取50μl/mL的磁珠至上述样品中充分混匀，室温孵育10分钟。

12)添加完全培养基(Lonza公司，X-VIVO15)至管内液体总体积为2.5mL，将开盖的管子***磁极中，室温静置5分钟。

13)孵育完毕后管子继续留在磁极中，轻轻倒置，倒出管内的原代T细胞。

14)将原代T细胞重悬于含有10％FBS，300U/mL IL-2(Peprotech，货号96-200-02-100)，5ng/mL IL-15(Peprotech，货号96-200-15-10)和10ng/mL IL-7(Peprotec，货号96-200-07-10)X-vivo 15的培养基(Lonza，04-418Q)中。

2、激活原代T细胞与慢病毒感染

原代T细胞处于未激活状态，很难用慢病毒进行感染；激活后更易于被慢病毒感染。

1)调整原代T细胞密度至1×10⁶/mL，加入抗体复合物(Anti-CD3，Anti-CD28的混合物)以及细胞因子(300U/mLIL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3、2μg/mL Anti-CD28)，之后连续培养48小时。

2)按MOI＝20计算所需的病毒量，公式如下：

所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度

3)从-80℃冰箱取出实施例3制备的慢病毒后迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加6μg/mL的polybrene后充分混匀，使用封口膜将六孔板四边密封，800×g离心1小时。

4)离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养24小时。

5)250×g离心10分钟，去除含病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞，将其转移至新的六孔板中继续培养3至6天，获得CAR-T细胞。

实施例5 CAR-T细胞对靶细胞的裂解

通过CAR-T细胞与靶细胞SW620细胞的共培养，评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。

1)调整靶细胞SW620细胞(表达CD46的肿瘤细胞)至对数生长期，且在进行实验前细胞需连续传代2次；

2)用胰酶(Thermo公司，25300054)将贴壁靶细胞消化重悬于完全培养基，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，在新的96孔板中按100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔加入100μL无菌水，防止实验孔中水分蒸发。将96孔板置于含5％CO₂ 37℃培养箱中过夜培养。

3)离心收集实施例4中制备的CAR-T细胞，使用无血清1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中培养基吸出，用无菌PBS轻轻将靶细胞洗涤一遍后分别按照E/T比例(效应细胞和靶细胞的比例)1:1、5:1、10:1加入重悬的CAR-T细胞，并将终体积补至100μL/孔；Maxi lysis和Mini lysis孔(最大裂解孔和最小裂解孔)中接种同样数量的靶细胞，但不加CAR-T细胞。将孔板置于37℃含5％CO2培养箱中培养6小时，

4)培养结束后取出96孔板，向Maxi lysis孔加入LDH检测试剂盒(Promega，G1780)中的裂解液，将其中靶细胞完全裂解后室温1200×g离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出后从每孔中转移50μL至另一个新的96孔板中，加入LDH检测试剂，通过酶标仪检测OD值。

5)靶细胞裂解率计算公式：

上述公式中各参数意义如下所示：

Lysis％：CAR-T细胞对靶细胞的裂解百分比；

ODeach well：每样品孔的OD值；

ODmini lysis：空白对照孔的OD值；

ODmaxi lysis：最大裂解对照孔的OD值；

6)将上述靶细胞裂解数据使用GraphPad 6.0进行作图。

结果如图7所示，由图7可知，在靶效比为10：1时，未转染的T细胞对靶细胞存在一定程度非特异性杀伤，裂解率为30％，而本发明的CAR-T细胞能够特异性的识别并杀伤靶细胞，裂解率可达90％以上，裂解率增加了约300％，因此，本发明的CAR-T细胞能够对靶细胞产生显著的杀伤作用，且随着效靶比提高，杀伤作用更为明显。

实施例6 CAR-T细胞分泌细胞因子白介素2水平的检测

步骤如下：

1)调整靶细胞SW620细胞(表达CD46的肿瘤细胞)至对数生长期，且在进行实验前细胞需连续传代2次。

2)用胰酶将贴壁靶细胞消化重悬于完全培养基，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，在新的96孔板中按100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔加入100μL无菌水，防止实验孔中水分蒸发。将96孔板置于5％CO₂，37℃培养箱中过夜培养。

3)离心收集实施例4中制备的CAR-T细胞，使用无血清1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中培养基吸出，用无菌PBS轻轻将靶细胞洗涤一遍后按照实施例5的E/T比例加入重悬的CAR-T细胞，并将终体积补至100μL/孔；将孔板置于37℃含5％CO₂培养箱中培养6小时，同时设置对照T细胞组。

4)培养结束后取出96孔板，室温1200×g离心96孔板5分钟，轻轻将板取出，从每孔中转移50μL培养基上清，使用ELISA kit(IL2ELISA kit,R&D,D2050)检测IL-2的表达，通过酶标仪检测OD值，结果如图8所示。

由图8可见，与靶细胞共培养后CAR-T细胞产生大量的IL-2，并且随着靶细胞量的提高，IL-2分泌水平显著升高，且与靶细胞增加的比例呈现剂量效应，而对照T细胞对靶细胞虽然存在一定的非特异性杀伤，但是其IL-2分泌水平显著低于CAR-T细胞，且无明显剂量效应关系。因此，本发明的重组CAR-T细胞分泌IL-2的能力明显提高。

实施例7 RANTES-IL15过表达重组腺病毒

RANTES-IL15过表达重组腺病毒作用：刺激T细胞增殖，促进T细胞转移。

1、RANTES-IL15穿梭载体构建

根据RANTES(NM_002985.2)及IL15(NM_000585.4)参考序列信息，合成全长ORF区，并亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle(爱康得生物，VP1225)中，获得pShuttle-RANTESIRES-IL15，并制备转染级别的质粒。

2.重组腺病毒骨架载体制备

以上述制备的重组腺病毒穿梭载体为基础，结合腺病毒骨架质粒pADBackbone，通过体外重组，构建重组腺病毒质粒。对上述制备的表达载体进行质粒大抽，制备转染级别的质粒。

3.重组腺病毒制备

将上述制备的重组腺病毒载体分别使用PacI进行酶切线性化，纯化后使用脂质体转染至293A细胞(Thermo，R70507)中，待细胞出现CPE现象(细胞病理变化)后，收集细胞，并制备腺病毒种子。以此种子病毒为基础，进行大规模腺病毒制备。

4.重组腺病毒的纯化

将上述制备的重组腺病毒载体分别使用柱子进行纯化，使用PBS进行缓冲液置换，并对最终获得的病毒滴度进行测定(10¹⁰重组腺病毒，PBS重悬)。

实施例8荷瘤模型中CAR-CD46联合重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤能力

动物种类：NOD-prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju(NCG)小鼠

实验流程如图9：CAR-CD46组：NCG小鼠双侧腋下皮下接种结直肠癌细胞SW620(Luciferase ATCC细胞库)5×10⁵个/侧/只，第10天，瘤内注射30ul/侧/只重组腺病毒RANTES-IL15，刺激T细胞增殖并促进T细胞转移，第13天尾静脉注射感染CAR-CD46病毒即Lenti-CD46-CAR病毒的T细胞5×10⁶个/只，第18天同样再次注射30ul/侧/只重组腺病毒RANTES-IL15，第21天进行第二次同等量的CAR-T细胞注射，从第7天，12天，17天，23天进行小动物荧光活体成像的检测(图10)，同时设置同期对照组：NCG小鼠双侧腋下皮下接种结直肠癌细胞SW620(Luciferase ATCC细胞库)5×10⁵个/侧/只，第10天，瘤内注射30ul/侧/只重组腺病毒RANTES-IL15，刺激T细胞增殖并促进T细胞转移，第13天尾静脉注射未感染病毒的control T细胞5×10⁶个/只，第18天同样再次注射30ul/侧/只重组腺病毒RANTES-IL15，第21天进行第二次同等量的未感染病毒的control T细胞注射，从第7天，12天，17天，23天进行小动物荧光活体成像的检测(图10)。结果显示，CAR-CD46组小鼠的荧光强度明显低于对照组，显示CAR-CD46对荷瘤模型中的肿瘤细胞有较为显著的杀伤抑制作用。通过检测肿瘤生长速度发现CAR-CD46组小鼠的肿瘤体积生长较对照组缓慢(图11)，且CAR-CD46组小鼠的生存期明显延长(图12)。对不同组NCG小鼠的肿瘤组织做免疫组化(anti-CD31antibody，ab28364，Abcam；anti-CD3，ab5690，Abcam；anti-caspase3，ab13847，Abcam；anti-ki67 antibody，ab15580，Abcam)(CD31越高，肿瘤组织血管生成越多；CD3提示T细胞浸润；caspase3越高，肿瘤细胞凋亡越多；ki67越高，肿瘤细胞增殖越快)，结果显示(参见图13)，与对照组相比，CAR-CD46组小鼠的肿瘤组织中出现T细胞浸润，凋亡增加，增殖较少，血管生成减少。图13进一步说明CAR-CD46对荷瘤模型中的肿瘤细胞有较为显著的杀伤抑制作用。

本发明通过筛选与结直肠癌发生发展密切相关的有治疗潜力的标志物，提供了一种重组嵌合抗原受体基因CD46，转染该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体的病毒后的T细胞对高表达CD46的肿瘤细胞有明显的杀伤效果。在发明中，实验者通过调整试验方案，先将重组腺病毒注射入小鼠肿瘤组织内(促进T细胞增殖和转移)，然后进一步注射CART细胞，潜在性的提升CART细胞的治疗效果。NCG小鼠为IL2rg基因敲除小鼠，缺乏成熟的T、B和NK细胞，是目前国际公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

在本发明中CART组免疫组化结果显示，CAR-CD46组的小鼠肿瘤组织出现外源性T细胞的浸润，而对照组无此现象，进一步说明联合使用重组腺病毒的CAR-CD46组的T细胞能有效浸润肿瘤组织，从而实现杀伤效果，能有效改善实体瘤治疗中的靶点特异性较差，T细胞无法有效浸润及肿瘤内部免疫抑制性的缺点，与目前其他方案在实体瘤中无法有效应用形成对比。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Gly His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Gly His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Asn Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Gln Gly Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Asn Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Gln Gly Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 2568

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120

accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180

cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240

gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300

ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360

cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420

ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480

ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540

agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600

tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660

gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720

cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780

gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840

cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900

cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960

gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020

tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080

tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140

agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200

ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260

gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320

atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380

gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440

caggccctgc cgcctcggga gggcagaggc agcctgctga catgtggcga cgtggaagag 1500

aaccctggcc ccatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg gcactgtggc ctgcagcatc 1560

tctcgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt ggtgaattta aagactcact ctccataaat 1620

gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc acctccatca gtggcgatct ccacatcctg 1680

ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca catactcctc ctctggatcc acaggaactg 1740

gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa 1800

aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa 1860

catggtcagt tttctcttgc agtcgtcagc ctgaacataa catccttggg attacgctcc 1920

ctcaaggaga taagtgatgg agatgtgata atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca 1980

aatacaataa actggaaaaa actgtttggg acctccggtc agaaaaccaa aattataagc 2040

aacagaggtg aaaacagctg caaggccaca ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc 2100

gagggctgct ggggcccgga gcccagggac tgcgtctctt gccggaatgt cagccgaggc 2160

agggaatgcg tggacaagtg caaccttctg gagggtgagc caagggagtt tgtggagaac 2220

tctgagtgca tacagtgcca cccagagtgc ctgcctcagg ccatgaacat cacctgcaca 2280

ggacggggac cagacaactg tatccagtgt gcccactaca ttgacggccc ccactgcgtc 2340

aagacctgcc cggcaggagt catgggagaa aacaacaccc tggtctggaa gtacgcagac 2400

gccggccatg tgtgccacct gtgccatcca aactgcacct acggatgcac tgggccaggt 2460

cttgaaggct gtccaacgaa tgggcctaag atcccgtcca tcgccactgg gatggtgggg 2520

gccctcctct tgctgctggt ggtggccctg gggatcggcc tcttcatg 2568

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccc 63

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

Claims

1.一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，所述T细胞刺激信号转导结构为人CD8铰链区及CD8跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，所述单链抗体hCD46scFV与CD8铰链区通过连接肽连接，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.含有权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。

3.含有权利要求2所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒。

4.权利要求3所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒的包装方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV的获得；

2）嵌合抗原受体hCD46-CAR慢病毒质粒的构建；

3）慢病毒的包装、浓缩及滴度测定。

5.权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体制备检测CD46阳性的肿瘤试剂或治疗CD46阳性的肿瘤药物方面的应用。

6.权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体、权利要求2所述的表达载体，权利要求3所述的慢病毒在制备检测直肠癌试剂或治疗结直肠癌药物方面的应用。