CN106260517A - 一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法及饲料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法，将所述的约氏乳杆菌菌剂与饲料混合，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10⁴～10⁸cfu，调整含水量20％-40％，密封，20-30℃条件下，发酵3-7天。本发明的发酵饲料制备工艺简单，操作方便，易于各类养殖户、生产饲料企业操作；且制备的固态发酵饲料效果显著，不仅能够提高采食量，降低料比，促进动物生长，而且还能提高动物抗病力，增加经济效益。

Description

一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法及饲料

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法及饲料。

背景技术

约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)。欧盟食品***(EFSA)会分别于2009年和2011年三次发布了针对约氏乳杆菌的健康申明，申明指出约氏乳杆菌具有减少肠道内病原菌的微生物，增强天然防御和免疫***和保持皮肤健康。并且欧盟对约氏乳杆菌进行了安全资格认定(qualified presumption of safety,QPS)批准其在饲料和食品中使用。2010年我国***办公厅将约氏乳杆菌收录到《可用于食品的菌种名单》中，批准其作为具有益生功能的食品添加剂使用。

乳酸菌发酵饲料是利用乳酸菌自身的繁殖、代谢等活动，一方面将饲料中大分子营养转化为小分子营养，降解饲料中的抗营养因子和有毒物质，释放饲料中难被动物利用的营养素，以提高饲料的营养价值和消化吸收率；另一方面经过乳酸菌发酵后，饲料中含有大量的乳酸菌、乳酸及乳酸菌素等抑菌物质，可抑制饲料中或畜禽肠道中病原菌的生长，保障发酵饲料的安全性，提高饲料适口性，还有助于促进动物的消化吸收，防止下痢；乳酸菌发酵后，还产生了丰富的功能性小肽，促生长因子等，提升动物免疫力，减少疾病，促进动物生长。

目前在国内尚未见有约氏乳杆菌发酵的饲料产品面世，其在动物畜禽养殖上的应用也鲜见报道，利用约氏乳杆菌生产乳酸菌发酵 饲料，对促进我国畜禽养殖水平，保证我国的健康养殖意义重大，可在畜禽养殖中发挥更大作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法及发酵饲料。

首先，本发明提供一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法，将所述的约氏乳杆菌菌剂与饲料混合，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10⁴～10⁸cfu，调整含水量20％-40％，密封，20-30℃条件下，发酵3-7天。

本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株均有潜在益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.4926，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学委员会普通微生物保藏中心。

其中，所述的约氏乳杆菌YS-12的筛选过程如下：

(1)收集菌种

截取健康猪结肠后半段，用生理盐水冲洗三次，用牙签多次挂取肠道上皮上的附着物，放入10mL的生理盐水中，作为样品原液，对原液进行10倍梯度稀释。

(2)菌种培养

将每个稀释度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培养24小时。

(3)菌种鉴定

挑取平板上的单菌落进行对其16S rRNA进行菌落PCR鉴定，通过在数据库中进行序列比对，发现其16S序列(GenBank登录号：HQ641209)，进一步通过理化实验证实其为约氏乳杆菌。

(4)菌种筛选

1)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升0.3％的胆盐溶液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

2)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升pH3.0的缓冲液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

3)将酸处理过的菌液继续稀释至10^-5，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度(对照组稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6)各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培养48小时。挑取耐受性菌株进行反复筛选，得到耐酸和耐胆盐性能优良的约氏乳杆菌。

(5)菌种保藏

将筛选得到的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，获得保藏号为 CGMCC No.4926。

在本发明的一个实施方案中，将所述的约氏乳杆菌菌剂与饲料混合，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10⁶cfu，调整含水量25％，密封，22℃条件下，发酵5天。

在一个优选的实施方案中，所述的约氏乳杆菌为约氏乳杆菌CGMCC No.4926。其中，所述的约氏乳杆菌制剂可为本领域常规制剂，优选为约氏乳杆菌发酵液。

其中，所述约氏乳杆菌发酵液的制备培养基为MRS液体培养基。

其中，所述饲料包括单一饲料、浓缩饲料、配合饲料和/或精料补充料。

其中，所述约氏乳杆菌发酵液的制备方法如下：

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；

2)以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹⁰cfu/ml以上的发酵液；

本发明中所制备的发酵饲料可以能显著提高断奶仔猪生产性能，对腹泻有较好防治效果，应用于生产猪可增加采食量，提高日 增重，降低料肉比。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1约氏乳杆菌CGMCC No.4926发酵液的制备

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；

2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液。

实施例2约氏乳杆菌发酵单一饲料——粗粉碎玉米粉

1、发酵准备

设备：密封性好的干净容器，如塑料桶、塑料袋、发酵池、发酵罐等；喷洒菌液用的喷雾器。

2、操作流程

(1)喷洒菌液：将约氏乳杆菌发酵液与调配饲料水分的清水混合，再与饲料混合均匀，加清水调整含水量为25％。

(2)压实密封：喷洒菌液后的饲料要快速装入塑料袋内压实，排净空气，密封严实。

(3)发酵完成：放置在25℃的环境中发酵，5天后即制成发酵饲料。发酵结束后测得每克发酵饲料中含有约氏乳杆菌3.2×10⁸个，饲料pH值为3.6。

实施例3发酵粗粉碎玉米对仔猪生产性能的影响

试验动物与设计：试验采用单因子随机区组设计，选取30日龄三元杂交(杜×长×大)仔猪72头，按性别、基因型、体重一致的原则随机分成4组(对照组和试验1、2、3组)，每组3个重复，分别饲喂含0％、2％、4％、6％发酵的日粮，试验为期6周。

试验日粮组成与营养成分见表1。

表1：试验日粮组成与营养成分

注：每千克预混料中舍：维生素A842600IU，维生系D₃16800IU，维生素E1310IU，维生素Bl 34.5mg，维生素B₂560.5mg，维生素B₁₂1.7mg，维生素K₃275mg，烟酸2469mg，叶酸91.2mg，泛酸1210mg，生物素1.6mg，铁135000mg，锌14500mg，锰5200mg，碘56.3mg，硒49.5mg

饲养管理：仔猪按照断奶仔猪饲养管理规范进行饲养。自由饮 水，自由采食，防疫按常规程序进行，注重温度、湿度、光照、通风等环境条件控制。预试期4d，正试期为35～70日龄。

按常规方法测定日均采食量、平均日增重、饲料增重比。从试验第1天开始，每日18：00记录仔猪粪便情况，统计时粪便条形或粒形为0分，软粪成形为1分，稠状成形粪水分离为2分，液状不成形粪水分离为3分。腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数。

实验结果：由表2可知，试验2、3组与对照组相比日均采食量分别提高13.43％、13.05％(P<0.05)，试验2、3组与对照组相比日增重分别提高18.36％、15.13％(P<0.05)，各试验组饲料增重比较对照组均有所降低，但效果不显著(P>0.05)。试验1、2、3组与对照组相比腹泻指数分别降低了42.52％、59.01％、51.97％(P<O.05)。结果表明，4％～6％发酵玉米能显著提高断奶仔猪生产性能和腹泻防治效果。

表2发酵玉米对断奶仔猪生产性能的影响

注：同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，相隔小写字母者表示差异极显著(P<O.01)。

实施例4约氏乳杆菌发酵配合饲料

1、发酵准备

设备：密封性好的干净容器，如塑料桶、塑料袋、发酵池、发酵罐等；喷洒菌液用的喷雾器。

2、操作流程

(1)喷洒菌液：将约氏乳杆菌发酵液与调配饲料水分的清水混合，再与饲料混合均匀，调整含水量为35％。

(2)压实密封：喷洒菌液后的饲料要快速装入大塑料桶中压实，排净空气，密封严实。

(3)发酵完成：放置在21℃以上的环境中发酵，7天后即制成发酵饲料。发酵结束后测得每克发酵饲料中含有约氏乳杆菌2.1×10⁸个，饲料pH值为3.8。

实施例5发酵配合饲料对生产猪生产性能的影响

(1)饲料配方及发酵前后营养成分变化

表3饲料配方及发酵前后营养成分表

由表3可以看出，发酵之后饲料中粗蛋白增加了21.63％，粗脂肪增加8％，粗纤维减少了12％，其他成分无较大变化。

(2)实验设计：将54头平均体重(30.88±0.47)kg的杜长大三元杂交生长猪，随机分为3个处理，每个处理3个重复，每个重复6头猪。对照组直接饲喂基础日粮，试验1组饲喂“90％基础日粮+10％发酵饲料”，试验2组饲喂“80％基础日粮+20％发酵饲料”。每天准确记录各重复的采食量，以计算其全期平均采食量。试验开始和结束时以重复为单位对每圈生长猪进行称重，计算其平均日增重。通过全期的平均采食量和平均日增重计算全期的料肉比。试验期30天。

(3)试验结果：从表4可知，试验2组与对照组相比日增重提 高了46.15％(P<0.05)、采食量提高了20.79％(P<0.05)、料肉比降低了17.39％(P<0.05)。试验1组与对照组相比日增重提高了27.73％(P<0.05)、采食量提高了14.09％(P<0.05)、料肉比提高10.72％(P>0.05)。

表4发酵饲料对生产猪生长性能的影响

注：表内同行肩注字母不同表示差异显著(P<0.05)，有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。所有数据均为干物质基础下计算。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种约氏乳杆菌发酵饲料的方法，其特征在于，将所述的约氏乳杆菌菌剂与饲料混合，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10⁴～10⁸cfu，调整含水量20％-40％，密封，20-30℃条件下，发酵3-7天。

2.根据权利要求1所述的方法，将所述的约氏乳杆菌菌剂与饲料混合，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10⁶cfu，调整含水量25％，密封，22℃条件下，发酵5天。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的约氏乳杆菌为约氏乳杆菌CGMCC No.4926。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的约氏乳杆菌菌剂为约氏乳杆菌发酵液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述约氏乳杆菌发酵液的制备培养基为MRS液体培养基。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述饲料包括单一饲料、浓缩饲料、配合饲料和/或精料补充料。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法发酵制得的发酵饲料。