CN101999525B - 一种复合益生素饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合益生素饲料添加剂，所述添加剂包含益生素、填充料和聚谷氨酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0.005∶1。其中益生素是枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和啤酒酵母。其中聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)是由谷氨酸(Glu)的α-氨基和γ-羧基缩合而成的一种高分子量聚合物钙盐，具有优良的水溶性和超强的保水性和吸附性，它不但能提供动物容易吸收的有机钙，还能显著提高益生素菌体的存活率，增加添加剂和饲料间的粘合作用，提高益生素的利用率，从而提高动物的抗病能力，促进动物生长，提高养殖经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种饲料添加剂，尤其涉及一种复合益生素饲料添加剂。
背景资料：
近年来，畜牧业生产中大多采用抗生素来防治疾病，这不但使动物肠道正常菌群失调，而且在畜禽产品中出现大量的药物残留。随着人们生活水平的不断提高和健康意识的增强，饲用抗生素的药残副作用日益受到人们关注。益生素是通过动物消化道生物竞争性排斥作用，抑制有害菌群的生长，形成优势菌群或者增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进了动物生长、提高了饲料的转化率。益生素饲料添加剂是一种天然的生物活性制剂，具有无毒、无抗药性、无副作用的特点，作为安全、高效、可替代饲用抗生素又无药残的产品已成为饲用添加剂的一个发展方向。
益生素是具有活性的生物制剂，使用益生素的关键是保证这些微生物被混入饲料后，能保持活性，直至进入动物肠道的相应位置繁殖。影响益生素活性的因素很多，对于固体干燥的添加剂而言，其中水分含量稳定在一定的水平至关重要。这样既可以保持其活性，甚至稍作繁殖，又不至于使其大量繁殖而争夺营养以及代谢物相互拮抗。而且，益生素制剂在加工过程中，要求菌体与饲料添加剂有一定的粘附能力，这样才便于这些活菌随着添加剂的加入而被动物采食。
动物钙质不足时，会导致生长迟缓、骨骼发育不良，轻者骨脆易折、变形弯曲，形成软骨症，重者可发展成佝偻病，其临床症状与维生素D缺乏症相似。如能在益生素饲料添加剂中增加动物易于吸收的有机钙，则可在保留益生素饲料添加剂优点的同时，给动物体补充钙质。
如何能使益生素饲料添加剂中既富含动物容易吸收的有机钙，同时又能使益生素菌体保持稳定的活性，增强与饲料间的粘合作用而易于被动物采食，从整体上提高益生素饲料添加剂的功效？象中国专利申请CN200810136835.4益生素饲料中添加的磷酸氢钙，仅是单纯补充钙质，并不能从整体上提高益生素饲料添加剂的利用率。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种新型复合益生素饲料添加剂，该添加剂不但富含动物容易吸收的有机钙，同时益生素菌体能保持稳定的活性，与饲料间的粘合作用强而易于被动物采食，从而提高益生素的利用率，促进动物生长，提高养殖经济效益。
本发明的另一目的是提供所述复合益生素饲料添加剂的制备方法。
本发明提供的一种复合益生素饲料添加剂，所述添加剂包含益生素、填充料和聚谷氨酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0.005∶1。
其中的聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)γ-PGA-Ga是聚谷氨酸(γ-PGA)与钙盐鳌合而生成的。聚谷氨酸是由谷氨酸(Glu)的α-氨基和γ-羧基缩合而成，分子量分布在100kDa到1000kDa之间。γ-PGA的生产可以利用纳豆通过生物技术提取，也可以由微生物发酵技术获得，还可以利用生化法进行人工合成。本发明中所用的聚谷氨酸是通过微生物发酵法生产而得。2007年第28卷第5期《食品研究与开发》，18-20页报道有《γ-聚谷氨酸的微生物发酵法生产及其表征初步分析》。
本发明通过在复合益生素饲料中添加重量比0.001-0.005∶1的聚谷氨酸钙，成功的发明了一种新型复合益生素饲料添加剂，它不但富含动物容易吸收的有机钙，又因聚谷氨酸钙优良的水溶性和超强的保水性和吸附性，能够显著提高益生素菌体的存活率，增加添加剂和饲料间的粘合作用，提高益生素的利用率，从而提高动物的抗病能力，改善动物消化机能，促进动物生长而提高养殖经济效益。
进一步，所述聚谷氨酸钙纯度大于90％。
进一步，所述益生素干粉与填充料的重量比为1∶0.2～1.8。
进一步，所述的益生素为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
进一步，所述三种固体菌粉的重量比为：1∶0.8-1.2∶0.8-1.2。
进一步，所述填充料为沸石。
本发明还提供所述复合益生素饲料添加剂的制备方法，包括：(1)将益生素菌种进行分离纯化后保藏，并对保藏菌种传代；(2)对保藏的菌种活化，先进行摇瓶培养，再经过液体发酵罐培养，然后进行固体发酵培养，将固体发酵菌种干燥至水分含量8％-15％，(3)各干燥菌粉按比例混合后加入重量比1∶0.2～1.8的填充料混匀，混合物中再加入重量比1∶0.001-0.005的聚谷氨酸钙，(4)混合均匀，分装。
进一步，所述益生素菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用营养琼脂培养基进行纯化、保藏及活化，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用黄豆芽汁培养基纯化、保藏及活化，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)利用MRS改良培养基纯化、保藏及活化。
其中，营养琼脂培养基为：牛肉膏3.0克，蛋白胨10克，氯化钠5.0克，琼脂15克，水1000毫升，调整pH值到7.2-7.6，分装，121℃灭菌30分钟。黄豆芽汁培养基为：黄豆芽100克，琼脂15克，葡萄糖20克，水1000毫升；洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，121℃灭菌20分钟。MRS改良培养基为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15-17g，水1000mL；灭菌前pH调至6.12-6.2，121℃灭菌20分钟。
进一步，在摇瓶培养中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS改良培养基，摇瓶培养温度分别为：枯草芽孢杆菌31-33℃，啤酒酵母28-30℃，植物乳杆菌36-38℃；摇床转速为140-150r/min；当摇瓶培养菌数达到所需活菌数后接种到液体发酵罐培养，液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇床培养温度相同。
其中肉汤培养基为：牛肉膏3.0克，蛋白胨10克，氯化钠5.0克，水1000毫升，调整pH值到7.2～7.6，分装，121℃灭菌30分钟；改良黄豆芽汁培养基培养基为：黄豆芽120克，葡萄糖25克，水1000毫升，洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，121℃灭菌20分钟；MRS改良培养基如上述。
通常，当摇瓶培养菌数达到109cfu/mL后接种到液体发酵罐进行培养。
进一步，在固体发酵培养时将所述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的发酵液分别接种于固体培养基上进行固体发酵，固体发酵所用的培养基均为：重量百分比浓度0.20-0.15％的尿素溶液中加入麸皮，所述尿素溶液与麸皮的重量比为：1∶1.1-1.3，121℃灭菌45-50分钟，三种菌的固体发酵温度均与摇瓶培养温度相同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结束；所述三种菌粉干燥后按重量比：1∶0.8-1.2∶0.8-1.2混合。
三种菌粉干燥后，酵母活菌数应达到：1.0×108cfu/g(检测方法见附录C)以上，枯草芽孢杆菌的活菌数应达到：1.0×109cfu/g(检测方法见附录A)以上，植物乳杆菌的活菌数应达到：1.0×107cfu/g(检测方法见附录B)以上。
本发明的有益效果在于：
(1)通过给益生素添加剂中加入具有微环境保水作用的聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)，以及添加剂中以麸皮为主原料的营养物质，使益生菌在保存期内能有水分和营养稳定的生长环境，提高了菌体的存活率。
(2)所加入的聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)螯合有动物易于吸收的有机钙，显著改善动物因缺钙而引发的疾病，提高养殖动物的抗病能力，降低死亡率，提高出栏率，提高了养殖效益。
(3)所加入的聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)具有的超强粘附性，增强了益生菌与饲料间的粘合作用，提高了添加剂的利用率。
具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1：
对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用营养琼脂培养基进行纯化、保藏及活化，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用黄豆芽汁培养基纯化、保藏及活化，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)利用MRS改良培养基纯化、保藏及活化。进一步摇瓶培养，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS改良培养基，摇瓶培养温度分别为：枯草芽孢杆菌33℃，啤酒酵母28℃，植物乳杆菌37℃；摇床转速为140-150r/min；当药瓶培养菌数达到109cfu/mL时接种到50L液体发酵罐培养，液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇床培养温度相同。
将上述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的发酵液分别接种于固体培养基上进行固体发酵，培养基均为：重量百分比浓度为0.2％的尿素溶液中加入麸皮，尿素溶液与麸皮的重量比为：1∶1.3，121℃灭菌45-50分钟，三种菌的固体发酵温度均与摇瓶培养温度相同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结束，实验室用干燥箱58℃吹风干燥到水分含量为13.5％，各自得到固体菌粉100kg。
将三种固体菌粉按照1∶1∶1的比例混合后，用稀释涂布法分别对三个菌种计数，酵母活菌数为：2.0×108cfu/g(检测方法见附录C)，枯草芽孢杆菌的活菌数为：2.0×109cfu/g(检测方法见附录A)，植物乳杆菌的活菌数为：1.6×107cfu/g(检测方法见附录B)。将混合后的固体菌粉按照1∶1的比例加入300kg沸石粉，再加入纯度为90％的聚谷氨酸钙(购自浙江省嘉兴市海宁紫金港生物科技有限公司)3.0kg，混合均匀，得到本发明的复合益生素饲料添加剂。
实施例2
与实施例1基本相同，所不同之处在于枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌50L发酵液作为一级种子按10％的比例分别接种于500L液体发酵罐。将上述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的500L发酵液分别接种于固体培养基上进行固体发酵，培养基均为：重量百分比浓度为0.2％的尿素溶液中加入麸皮，尿素溶液与麸皮的重量比为：1∶1.2，121℃采用诸城市强大机械厂生产的单锅卧式全不锈钢700型杀菌锅，灭菌50分钟，再各自接种后，转入固体发酵池，发酵池为固体通风制曲池，发酵池体积为：宽1.2m×长3m×高1.5m，固体发酵结束，采用无锡市轻大化工机械设备厂生产的DGS2000型低温干燥机58℃干燥到水分含量13.0％，各自得到固体菌粉1吨。
将三种固体菌粉按照1∶1∶1的比例混合后，用稀释涂布法分别对三个菌种计数，酵母活菌数为：1.8×108cfu/g(检测方法见附录C)，枯草芽孢杆菌的活菌数为：1.5×109cfu/g(检测方法见附录A)，植物乳杆菌的活菌数为：1.2×107cfu/g(检测方法见附录B)将混合后的固体菌粉按照1∶1的比例加入3吨沸石粉，再加入纯度为90％的聚谷氨酸钙(购自浙江省嘉兴市海宁紫金港生物科技有限公司)12kg，用江苏东台粮油输送机械德州总部生产的型号为DSH/SLH 6的混合机混合均匀，得到复合益生素制剂，分装。
实施例3：
将实施例2中的产物与按照实施例2中方法制备但不加入聚谷氨酸钙的益生素饲料添加剂对照组在18℃下贮存，定期取样测定菌体活菌数。枯草芽孢杆菌采用营养琼脂稀释培养计数法(见附录A)，植物乳杆菌采用MRS稀释培养计数法(见附录B)，啤酒酵母采用孟加拉红稀释培养计数法测定活菌数(见附录C)。结果见下表：
结果表明，三种菌的存活率随保藏时间延长，加入聚谷氨酸钙一组明显高于对照组。这也证明了聚谷氨酸钙对益生素具有提高存活率的作用。
实施例4：
将实施例2中的产物与按照实施例2中方法制备但不加入聚谷氨酸钙的益生素饲料添加剂对照组作饲喂验证分析。
材料：试验用鸡品种为大骨鸡。分组：将同时购进的1500只鸡苗分为三组：第一、二组各500只鸡苗为试验组，饲喂按照实施例1中的方法制备的加入聚谷氨酸钙的益生素，第三组500只鸡苗为对照组，饲喂按照实施例1中的方法制备但不加入聚谷氨酸钙的益生素。饲喂方法为：按照日粮的0.5％的比例与普通饲料混匀喂鸡。
试验过程中，在技术人员的指导下，分别详细记录进鸡只数、料号、死亡只数、耗料量等情况，以便作统计分析。
试验结果与分析：历经120天的饲喂试验结果，发现试验组的死亡率明显比对照组低。
从上表数字看出，3个组相比，对照组的死亡率最高。从此可以认为，利用新型益生素饲料添加剂饲养鸡，可以降低鸡的死亡率，提高出栏率，直接增加饲养效益。
实施例5：
将添加实施例2中产物的饲料与不添加该产物的饲料对照组作应用效果验证。通过在育猪日粮中添加0.35％的实施例2中产物，猪生产性能如下表：
| 处理 | 对照组 | 实验组 |
| 试验仔猪头数 | 200 | 200 |
| 平均日增重(g/d) | 940.3 | 1098.5 |
| 平均日采食量(g/d) | 3002.8 | 3218.4 |
| 料肉比 | 3.2 | 2.9 |
应用结果显示：本发明饲料添加剂能显著提高饲料的利用率，节约了饲料资源，降低了养殖成本，提高了养殖效益。
尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
附录A
枯草芽孢杆菌总数的测定
A.1原理
将试样稀释10后，在80℃恒温水浴中杀死不耐热的细胞，再稀释至适当的浓度，用特定的培养基，在30±1℃下好氧培养72±3小时，计数平板上长出的菌落数，计算每克试样中的枯草芽孢杆菌总数。
A.2试剂
A.2.1营养琼脂
A.2.2无菌水
A.3仪器设备
A.3.1高压灭菌锅
A.3.2恒温培养箱
A.3.3振荡机
A.3.4恒温水浴锅
A.3.5实验玻璃仪器。
A.4操作步骤
A.4.1营养琼脂和无菌水的制备
A.4.1.1营养琼脂
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g蒸馏水1000mL
配制方法：将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15％的氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2-7.4。加入琼脂煮沸，使琼脂溶化。分装试管，121℃高压灭菌20min，取出备用。
A.4.1.2无菌水
将225mL蒸馏水装入500mL三角瓶内，再装9mL蒸馏水到稀释试管内，121℃高压灭菌20min，取出备用。
A.4.2采样
按GC/T 14699.1采样。
A.4.3试样稀释及培养
A.4.3.1无菌称取试样25.0g，放入盛有225mL无菌水的三角瓶中(瓶内预先放入一定数量的玻璃珠)。放在振荡机上振荡15min，将三角瓶放入80℃恒温水浴锅内，精确计时5min，制成1∶10的稀释液。
A.4.3.2用1mL灭菌移液管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁注入含有9mL无菌水的试管内(注意移液管尖端不要触及管内稀释液)，制成1∶100的稀释液。
A.4.3.3另取一支移液管，吹吸十次上面的稀释液，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增一次，即更换一支移液管。
A.4.3.4选取1∶106，1∶107，1∶108三个稀释级别，分别在作递增稀释的同时，即以吸取该稀释级的移液管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释级别作两个平皿。
A.4.3.5稀释液移入平皿后，应及时将晾至46±1℃(提前熔开后放入46℃水浴锅内)的营养琼脂培养基注入平皿约15mL，转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过20min。
A.4.3.6待琼脂凝固后，将平皿倒置于30±1℃恒温培养内培养72±3h.
A.4.4菌落计数方法
A.4.4.1作平板菌落计数时，可用肉眼观察菌落，必要时借助放大镜检查，以防遗漏。
A.4.4.2稀释级别的选择
A.4.4.3以平板上出现的20-300个菌落数的稀释级为有效计数平板。
当只有一个稀释级别，其平均数落在20-300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
A.4.4.4若有两个稀释级别的平均数落在20-300之间，应按两者菌落总数之比值来决定，若其比例小于2应计数两者的平均值，若大于2则计数其中的稀释较小的菌落总数。
A.4.4.5若三个稀释级别的平均菌落数均不在20-300之间，则以最接近的30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。
A.5计算
统计算出同一稀释级别两个平皿上的菌落平均数。
枯草芽孢杆菌总数/(CFU/g)＝菌落平均数×稀释倍数
附录B
植物乳杆菌总数的测定
B.1原理
将试样稀释至适当的浓度，用特定的培养基，在特定温度下厌氧培养48±3h，计数平板上长出的菌落数，计算每克试样中的植物乳杆菌总数。
B.2试剂MRS培养基
B.3仪器设备
B.3.1高压灭菌锅
B.3.2恒温培养箱
B.3.3振荡机
B.3.4恒温水浴锅
B.3.5实验玻璃仪器。
B.4操作步骤
B.4.1MRS琼脂和无菌水的制备
B.4.1.1MRS琼脂
酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，土温80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15-20g蒸馏水1000mL
配制方法：将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH至6.7-6.9，加入琼脂煮沸，使琼脂溶化。分装三角瓶，121℃高压灭菌20min，取出备用。
B.4.1.2无菌水
将225mL蒸馏水装入500mL三角瓶内，再装9mL蒸馏水到稀释试管内，121℃高压灭菌20min，取出备用。
B.4.2采样
按GB/T 14699.1采样。
B.4.3试样稀释及培养
B.4.3.1无菌称取试样25.0g，放入盛有225mL无菌水的三角瓶中(瓶内预先放入一定数量的玻璃珠)。放在振荡机上振荡15min，将三角瓶放入80℃恒温水浴锅内，精确计时5min，制成1∶10的稀释液。
B.4.3.2用1mL灭菌移液管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁注入含有9mL无菌水的试管内(注意移液管尖端不要触及管内稀释液)，制成1∶100的稀释液。
B.4.3.3另取一支移液管，吹吸十次上面的稀释液，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增一次，即更换一支移液管。
B.4.3.4选取1∶106，1∶107，1∶108三个稀释级别，分别在作递增稀释的同时，即以吸取该稀释级的移液管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释级别作两个平皿。
B.4.3.5稀释液移入平皿后，应及时将晾至46±1℃(提前熔开后放入46℃水浴锅内)的MRS培养基无菌注入平皿约15mL，转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过20min。
B.4.3.6待琼脂凝固后，将平皿倒置于37±1℃恒温培养内培养72±3h.
B.4.4菌落计数方法
B.4.4.1作平板菌落计数时，可用肉眼观察菌落，必要时借助放大镜检查，以防遗漏。
B.4.4.2稀释级别的选择
B.4.4.3以平板上出现的20-300个菌落数的稀释级为有效计数平板。
当只有一个稀释级别，其平均数落在20-300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
B.4.4.4若有两个稀释级别的平均数落在20-300之间，应按两者菌落总数之比值来决定，若其比例小于2应计数两者的平均值，若大于2则计数其中的稀释较小的菌落总数。
B.4.4.5若三个稀释级别的平均菌落数均不在20-300之间，则以最接近的30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。
B.5计算
统计算出同一稀释级别两个平皿上的菌落平均数。
植物乳杆菌总数/(BFU/g)＝菌落平均数×稀释倍数
附录C
啤酒酵母菌总数的测定
C.1原理
将试样稀释至适当的浓度，用酵母选择培养基，在特定温度下培养72±3h，计数平板上长出的菌落数，计算每克试样中的啤酒酵母菌总数。
C.2试剂孟加拉红培养基
C.3仪器设备
C.3.1高压灭菌锅
C.3.2恒温培养箱
C.3.3振荡机
C.3.4恒温水浴锅
C.3.5实验玻璃仪器。
C.4操作步骤
C.4.1孟加拉红培养基和无菌水的制备
C.4.1.1孟加如红培养基
蛋白胨：5g，葡萄糖：10g，磷酸二氢钾：1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：0.5g，琼脂：15-20g/，1/3000孟加拉红溶液：00mL，蒸馏水：1000mL，氯霉素：0.1g。配制方法：上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min，取出备用。
C.4.1.2无菌水
将225mL蒸馏水装入500mL三角瓶内，再装9mL蒸馏水到稀释试管内，121℃高压灭菌20min，取出备用。
C.4.2采样
按GC/T 14699.1采样。
C.4.3试样稀释及培养
C.4.3.1无菌称取试样25.0g，放入盛有225mL无菌水的三角瓶中(瓶内预先放入一定数量的玻璃珠)。放在振荡机上振荡15min，将三角瓶放入80℃恒温水浴锅内，精确计时5min，制成1∶10的稀释液。
C.4.3.2用1mL灭菌移液管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁注入含有9mL无菌水的试管内(注意移液管尖端不要触及管内稀释液)，制成1∶100的稀释液。
C.4.3.3另取一支移液管，吹吸十次上面的稀释液，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增一次，即更换一支移液管。
C.4.3.4选取1∶105，1∶106，1∶107三个稀释级别，分别在作递增稀释的同时，即以吸取该稀释级的移液管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释级别作两个平皿。
C.4.3.5稀释液移入平皿后，应及时将晾至46±1℃(提前熔开后放入46℃水浴锅内)的孟加拉红培养基无菌注入平皿约15mL，转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过20min。
C.4.3.6待琼脂凝固后，将平皿倒置于37±1℃恒温培养内培养72±3h.
C.4.4菌落计数方法
C.4.4.1作平板菌落计数时，可用肉眼观察菌落，必要时借助放大镜检查，以防遗漏。
C.4.4.2稀释级别的选择
C.4.4.3以平板上出现的20-300个菌落数的稀释级为有效计数平板。
当只有一个稀释级别，其平均数落在20-300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
C.4.4.4若有两个稀释级别的平均数落在20-300之间，应按两者菌落总数之比值来决定，若其比例小于2应计数两者的平均值，若大于2则计数其中的稀释较小的菌落总数。
C.4.4.5若三个稀释级别的平均菌落数均不在20-300之间，则以最接近的30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。
C.5计算
统计算出同一稀释级别两个平皿上的菌落平均数。
啤酒酵母菌菌总数/(CFU/g)＝菌落平均数×稀释倍数。
Claims (5)
1.一种复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂包含益生素、填充料和聚谷氨酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0.005∶1，所述聚谷氨酸钙纯度大于90％，所述益生素与填充料的重量比为1∶0.2～1.8，所述复合益生素饲料添加剂制备方法包括：(1)将益生素菌种进行分离纯化后保藏，并对保藏菌种传代，所述的益生素为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；(2)对保藏的菌种活化，先进行摇瓶培养，再经过液体发酵罐培养，然后进行固体发酵培养，将固体发酵菌种干燥至水分含量8％-15％，(3)各干燥菌粉按比例混合后加入重量比1∶0.2～1.8的填充料混匀，混合物中再加入重量比1∶0.001-0.005的聚谷氨酸钙，(4)混合均匀，分装。
2.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述三种固体菌粉的重量比为：1∶0.8-1.2∶0.8-1.2。
3.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述填充料为沸石。
4.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，在摇瓶培养中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS改良培养基，摇瓶培养温度分别为：枯草芽孢杆菌31-33℃，啤酒酵母28-30℃，植物乳杆菌36-38℃；摇床转速为140-150r/min；当摇瓶培养菌数达到所需活菌数后接种到液体发酵罐培养，液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇床培养温度相同。
5.按照权利要求4所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，在固体发酵培养时将所述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的发酵液分别接种于固体培养基上进行固体发酵，三种菌的固体发酵温度均与摇瓶培养温度相同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结束；所述三种菌粉干燥后按重量比：1∶0.8-1.2∶0.8-1.2混合，固体发酵所用的培养基均为：重量百分比浓度0.2-0.15％的尿素溶液中加入麸皮，所述尿素溶液与麸皮的重量比为：1∶1.1-1.2，121℃灭菌45-50分钟。
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