CN106255698A - 用于减少发酵液的dna含量的方法 - Google Patents

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Abstract

披露了用于减少发酵液中DNA水平的方法，其中该方法包括加热步骤，其中加热该发酵液到至少70℃的温度。

Description

用于减少发酵液的DNA含量的方法
发明领域
本发明涉及用于从发酵液获得蛋白质产物的方法，其中该发酵液进行了非常有效的处理，用于去除宿主细胞DNA。
发明背景
通过发酵生产蛋白质产物是众所周知的方法，并且它用于以工业规模生产多种不同的感兴趣蛋白。在发酵期间，一些生产感兴趣蛋白产物的宿主细胞将破裂，并且包括DNA的细胞内含物将被释放到发酵液中。此外，在一些发酵中，感兴趣的蛋白作为细胞内产物进行生产。这意味着在发酵后，作为纯化过程的一部分，这些细胞必须裂解，并且这不可避免地导致了大量DNA释放到发酵液中。
针对一些类型的蛋白产物，例如出于环境或健康问题的考虑，所希望的是避免来自生产感兴趣蛋白的宿主细胞的残留DNA。此外，发酵液中的DNA可以增加黏度，导致更高的能量需要以用于搅拌和/或处理发酵液。
因此，存在用于去除或减少发酵液的DNA含量的方法的需要。
然而，从发酵液中去除所有残留的宿主细胞DNA是非常困难的，因此在本领域中迫切需要开发程序来克服DNA问题。
发明概述
出人意料地发现，使发酵液经过加热是一种非常有效的去除DNA的方法，所以本发明要求：
一种用于从发酵液中去除DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将发酵液加热到至少70℃的温度。
该方法优选地包括以下步骤：
b)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
c)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
根据本发明的方法将减少发酵液的DNA水平到低于1μg/ml或甚至更低的水平。在一个优选的实施例中，将DNA水平降低至低于检测限的水平。
附图简要说明
图1：以中试规模生产淀粉酶变体的地衣芽孢杆菌菌株的PCR-扩增的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳。在酶回收之前，使发酵液经过热处理和絮凝。只有未处理的发酵液具有由凝胶上条带所指示的阳性DNA信号(箭头)。阴性对照支持没有观察到假阳性结果。
图2：以中试规模生产天冬酰胺酶的枯草芽孢杆菌菌株的PCR-扩增的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳。在酶回收之前，使发酵液经过热处理和絮凝。只有未处理的发酵液具有由凝胶上条带所指示的阳性DNA信号(箭头)。阴性对照支持没有观察到假阳性结果。
图3：以中试规模生产天冬酰胺酶的枯草芽孢杆菌菌株的PCR-扩增的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳。在酶回收之前，使发酵液经过热处理和絮凝。未处理的发酵液和热处理的发酵液的上清液具有由凝胶上的条带所指示的阳性DNA信号(箭头)；所有其他过程流具有阴性信号。阴性对照支持没有观察到假阳性结果。
发明的详细说明
本发明涉及一种简单且非常有效的从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法。在本发明的范围之内，宿主细胞DNA被定义为包括来自生产菌株的基因组DNA和编码感兴趣的蛋白质的DNA片段。
能够产生感兴趣的蛋白质的微生物
该微生物宿主细胞可以是任何属的宿主细胞。所希望的蛋白质与能够产生感兴趣的蛋白质的宿主细胞可以是同源的或异源的。
术语“同源蛋白质”意指由源于其中产生它的宿主细胞的基因编码的蛋白质。
术语“异源蛋白质”意指由相对于其中产生它的宿主细胞为外来的基因编码的蛋白质。
如在此使用的，术语“重组宿主细胞”意指包含编码所希望的蛋白质的基因(一种或多种)并且能够表达所述基因(一种或多种)而产生该希望的蛋白质的宿主细胞。可以使用本领域熟知的技术经由转化、转染、转导或诸如此类的方法使所希望的蛋白质编码基因(一种或多种)进入重组宿主细胞中。
当所希望的蛋白质是一种异源蛋白质时，能够产生该希望的蛋白质的重组宿主细胞优选地是真菌或细菌来源的。重组宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该希望的蛋白质的基因和所述蛋白质的来源。
如在此使用的，术语“野生型宿主细胞”是指天然地包含编码所希望的蛋白质的基因(一种或多种)并且能够表达所述基因(一种或多种)的宿主细胞。
“其突变体”可以是一种其中一个或多个基因已经被缺失(例如，为了富集所希望的蛋白质制剂)的野生型宿主细胞。
在一个优选实施例中，该重组或野生型微生物宿主细胞是细菌或真菌。
该微生物宿主细胞可以是酵母细胞，例如假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酿酒酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属菌株。在另一方面，该菌株是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母菌株。
该微生物宿主细胞可以是丝状真菌菌株，如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属菌株。
在另一个方面，该菌株是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳霉(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳霉(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉菌株。
在一方面，该真菌宿主细胞是选自下组的菌株，该组由以下各项组成：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、支顶孢属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、蚀丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、和木霉属。
在一个更优选的实施例中，该丝状真菌宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：木霉属和曲霉属宿主细胞，具体地为哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉菌株，尤其是里氏木霉菌株。
在另一个优选实施例中，该重组或野生型微生物宿主细胞是细菌。微生物宿主细胞的实例包括选自下组的微生物宿主细胞，该组包括***，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属，或革兰氏阴性菌，如弯曲菌属、埃希氏杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属。
在一方面，该细菌宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
在另一方面，该细菌宿主细胞是似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌、或马链球菌兽疫亚种。
在另一方面，该细菌宿主细胞是鼠灰链霉菌、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌菌株。在另一方面，该细菌宿主细胞是大肠杆菌。
在另一方面，该细菌宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、布丘氏菌属(Buttiauxella)和假单胞菌属。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
感兴趣的蛋白质
根据本发明，感兴趣的蛋白质可以是肽或多肽。根据本发明的优选的肽包含从5至100个氨基酸；优选地是从10至80个氨基酸；更优选地是从15至60个氨基酸。根据本发明的有待回收的优选肽是一种抗微生物肽、脂肽或另一种功能肽，如布拉齐甜蛋白(brazzein)。
优选的多肽可以是可由微生物产生的任何蛋白质。
在一个优选的实施例中，该感兴趣的蛋白质是一种酶。在一个优选实施例中，该方法应用于一种水解酶(根据酶命名法(Enzyme Nomenclature)；国际生物化学联合会命名委员会的建议(Recommendations of the Nomenclature Committee of the InternationalUnion of Biochemistry)的EC 3类)。包括化学修饰的变体或蛋白质工程变体。
在特别优选的实施例中，选自下组的酶是优选的，该组由以下各项组成：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、角质酶、裂解酶、***糖酶、半乳聚糖酶、氧化酶、漆酶、过氧化物酶和天冬酰胺酶。
在另一个优选的实施例中，感兴趣的蛋白是一种蛋白，该蛋白对热灭活具有高稳定性并且结果是能够暴露于本发明的热处理而没有功能蛋白的不可接受的大量损失。因此，在一个具体优选的实施例中，该感兴趣的蛋白质是一种热稳定酶。该热稳定酶可以具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下为至少30分钟，优选地至少40分钟、优选地至少50分钟、优选地至少60分钟、优选地至少70分钟、优选地至少80分钟、优选地至少90分钟和最优选地至少100分钟。本发明方法适用的热稳定酶的实例包括披露于WO 2008/110513、WO 2014/027062和WO 2008/151807中的热稳定天冬酰胺酶。
淀粉酶：一种淀粉酶可以是根据本发明产生的所希望的酶。淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶以及麦芽糖淀粉酶。
α-淀粉酶可以来源于芽胞杆菌属，例如来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。其他α-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌属菌株NCIB12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶，所有的这些详细描述在WO 95/26397中，或Tsukamoto(冢本)等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(《生物化学和生物物理研究通讯》)，151(1988)，25-31页中描述的α-淀粉酶。
其他α-淀粉酶包括来源于丝状真菌、优选曲菌属菌株(例如米曲霉和黑曲霉)的α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，所希望的酶是来源于米曲霉的α-淀粉酶，如具有显示在WO 96/23874中的SEQ ID NO：10中的氨基酸序列的α-淀粉酶。
所希望的酶还可以是来源于黑曲霉的α-淀粉酶，尤其是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在原始登录号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”的α-淀粉酶。
所希望的酶还可以是β-淀粉酶，如在W.M.福格蒂(Fogarty)和C.T.凯利(Kelly)，工业微生物进展(Progress in Industrial Microbiology)，第15卷，第112-115页，1979中披露的任何植物和微生物β-淀粉酶。
所希望的酶还可以是一种麦芽糖淀粉酶。“麦芽糖淀粉酶”(葡聚糖l,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。一种感兴趣的麦芽糖淀粉酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048；4,604,355；以及6,162,628中。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、Termamyl SCTM、Termamyl UltraTM、StainzymeTM、NatalaseTM、NovamylTM和BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM(购自杜邦公司)。
所希望的酶还可以是普鲁兰酶，包括葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.41)，其作用于支链淀粉的非还原端以产生葡萄糖，也称为α-糊精6-葡聚糖水解酶或真普鲁兰酶或极限糊精酶；作用于支链淀粉中的α-(1,6)-糖苷键以产生麦芽三糖的普鲁兰酶；水解α-(1,4)-键以产生异葡糖基麦芽糖的异普鲁兰酶；以及作用于α-(1,4)-键以产生潘糖的新普鲁兰酶。
蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的变体或蛋白质工程变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
其他适合的蛋白酶是描述于例如WO 2005/115445中的用于胰酶替代的拟诺卡菌属蛋白酶。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、 Ultra、Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、和Excellenz P1000(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTm(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶或角质酶：一种脂肪酶是催化脂质水解或形成的酶。脂肪酶包括通过EC3.1.1.3定义的酶。合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)例如来自如在EP 258068和EP 305216中描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶；来自腐质霉属例如特异腐质霉属(H.insolens)(WO96/13580)的角质酶；来自假单胞菌属菌株(这些中的一些现在改名为伯霍尔德杆菌属)的脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌(P.sp.)菌株SD705(WO95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 12/137147))；来自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶；来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(US 5,389,536)的角质酶和来自褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WO 11/084412)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶可以是芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达托斯(Dartois)等人(1993)生物化学与生物物理学学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992，WO11/084599)、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、或短小芽胞杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM、LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)、Lumafast(最初来自杰能科公司)和Lipomax(最初来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体。
其他适合的脂肪酶是描述于例如WO 2006/136159中的用于胰酶替代的脂肪酶。
纤维素酶：纤维素酶包括直接对纤维素起作用的酶和有助于其他酶对纤维素的直接作用的辅助酶。适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些，如外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶、和/或内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这些不同类型的纤维素酶协同作用来将纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。纤维素酶还包括辅助酶，这些辅助酶包括GH61成员，如EG4、膨胀素、松驰素、CIP1以及类似物。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
可商购获得的纤维素酶包括CelluzymeTM、CarezymeTM、和CellucleanTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和PuradaxTMHA(杜邦公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(KaoCorporation))。
木聚糖酶：木聚糖酶包括1,4-(β)-D-木聚糖-木聚糖水解酶、(EC3.2.1.8)、4-木聚糖水解酶、内切-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-D-木聚糖酶、1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶、β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶、β-D-木聚糖酶，其将直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，由此分解作为植物细胞壁的主要成分之一的半纤维素。可商购获得的木聚糖酶的实例为EconaseTM(AB维斯塔公司(AB Vista))。
天冬酰胺酶：天冬酰胺酶也称为L-天冬酰胺酶和L-天冬酰胺酰胺基水解酶。(EC3.5.1.1)是一种催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶。
AcrylawayTM(诺维信公司)为可商购获得的天冬酰胺酶的实例。
甘露聚糖酶：甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)包括催化β-D-甘露糖苷(也称为甘露聚糖)中的末端非还原性β-D-甘露糖的水解的所有酶。
甘露聚糖酶的商业实例为MannawayTM(诺维信公司)。
植酸酶：在目前情况下，植酸酶是一种催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)它的单-，二-，三-，四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。
植酸酶包括3-植酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。
可商购获得的植酸酶的实例包括RonozymeTM(DSM营养产品)、NatuphosTM(BASF)、FinaseTM(AB Vista)、QuantumTM XT和Blue(AB Vista)、PhyzymeTM产品系列(杜邦公司)和AxtraTM PHY产品系列(杜邦公司)。其他优选的植酸酶包括描述于WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。
裂解酶：裂解酶可以是细菌或真菌来源的果胶酸裂解酶。包括化学修饰或遗传修饰的变体。在一个优选的实施例中，该裂解酶来源于芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或一种来源于这些来源中任一种的变体，例如，正如在US 6,124,127、WO 1999/027083、WO 1999/027084、WO 2002/006442、WO2002/092741、WO 2003/095638中所述的，可商购获得的果胶酸裂解酶包括爱派(XPect)；派克沃(PectawashTM)和派克威(PectawayTM)(诺维信公司)。
乙酰乳酸脱羧酶(EC 4.1.1.5)属于被称为裂解酶(具体地说，裂解碳-碳键的羧酸分解酶)的这组酶。商业化酶MaturexTM(诺维信公司)广泛用于酿造业。
木糖异构酶：可商购获得的木糖异构酶例如是SweetzymeTM(诺维信公司)或GenSweetTM(杜邦公司)。
乳糖酶：乳糖，一种葡萄糖与半乳糖的二聚体，是牛奶中的主要的糖，其在很大程度上是哺乳动物尤其是人类中牛奶不耐受的原因。β-半乳糖苷酶或乳糖酶(EC 3.2.1.23)水解个体碳水化合物中的二聚体，由此增加在消费期间对牛奶的耐受性和消化牛奶的能力。乳糖酶的替代名称还包括外切-(1,4)-β-D-半乳聚糖酶。
可商购获得的乳糖酶例如包括Lactozyme PureTM(诺维信公司)和GODO-YNL2乳糖酶(杜邦公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
其他过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
在一个具体的实施例中，本发明不涵盖通过加热而被破坏的酶。在一个更具体的实施例中，本发明不包括由高于65℃、70℃、80℃、90℃和/或100℃的温度而被破坏的酶。
发酵液
本发明对于工业规模的任何发酵可以是有用的，例如用于具有至少50升、优选至少500升、更优选至少5,000升、甚至更优选至少50,000升的培养基的任何发酵。
可以通过本领域中任何已知的方法来发酵产生感兴趣的蛋白质的微生物。发酵培养基可以是如描述于例如WO 98/37179中的基本培养基，或者该发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中该复合氮源可以如WO 2004/003216中所述被部分水解。
该发酵可以按照分批、重复分批、补料分批、重复补料分批或连续发酵工艺来进行。
在补料分批工艺中，在开始发酵之前，不添加包含一种或多种营养素的化合物或者将其一部分添加到培养基中，并且对应地，在发酵过程中，将全部或剩余部分的包含一种或多种营养素的化合物进行补料。被选定为补料的这些化合物可以一起补料或分开补料到该发酵工艺中。
在重复补料分批或连续发酵工艺中，在发酵过程中另外补入完全起始培养基。起始培养基可与结构元素补料(一种或多种)一起或分开补入。在重复补料分批工艺中，以规律的时间间隔去除包含生物质的发酵液的一部分，而在连续工艺中，连续进行发酵液的一部分的去除。由此，发酵工艺补充有相应于撤出的发酵液量的一部分新鲜培养基。
在本发明的优选实施例中，来自补料分批发酵工艺的发酵液是优选的。
温度
出人意料地发现，将发酵液加热至高于65℃如高于70℃是一种有效在发酵液中减少DNA的方法。
可以将发酵液加热至至少或高于65℃、70℃、75℃、80℃或甚至高于85℃的温度。
为了不致于使感兴趣的蛋白质如酶变性，重点是保持发酵液温度低于蛋白质的变性温度。
该温度可以被保持在低于110℃、100℃、95℃或甚至低于90℃。
可以将温度增加到65℃至110℃、65℃至100℃、70℃至110℃、70℃至100℃、75℃至110℃、75℃至100℃、75℃至95℃或80℃至90℃之间。
在优选的实施例中，发酵液的加热导致蛋白质稳定性或活性的无或非显著性损失，例如，少于1％、2％、5％、10％、15％、20％或25％的所希望蛋白的活性损失。蛋白质稳定性或活性的损失可以在热处理之前或紧接着热处理后，通过测量发酵液中存在的感兴趣蛋白的量来确定。
与此相关，典型地使用针对感兴趣蛋白质的标准测定来测量蛋白质损失或活性，并且不限于测定的具体类型。因为用于本发明的适合的测定的实例可以是针对酶活性提及的测定，ELISA方法和免疫测定。如果感兴趣的蛋白质是一种酶，那么用于测量活性损失的测定优选地是测量酶的酶活性的测定。
时间
可以将发酵液加热至少5、10、20、30、40、60、90、120、150、180或甚至长达240min或长达6小时。
在一个优选的实施例中，将该发酵液加热少于240、200、180、150、120或甚至少于90min。
在一个具体的实施例中，可以将该发酵液加热介于20和120min之间，如介于30和90min之间。
用于加热的设备
任何适合的设备可以用于加热该发酵液，并且以下不应被看作限制。
发酵液的温度可以通过蒸汽注射或使用预热套来增加。其他可能的加热溶液包括被动式加热(微生物热)、随后的保持在容器或管路回线、外环和流通池中的热交换器。
本发明的方法可应用于未处理的发酵液或者已经初步进行(但不限于)例如pH调节的发酵液。
稀释
根据本发明，可以用水将该发酵液稀释高达2000％(w/w)；优选地可以用水将该发酵液稀释10％-2000％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释100％-1500％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释100％-1000％(w/w)；更优选地可以用水将该发酵液稀释200％-800％(w/w)。
根据本发明，用水稀释意指该稀释介质可以是水，或者它可以是来自感兴趣的蛋白质生产的超滤渗透物，或者它可以是来自感兴趣的蛋白质生产的再循环水，或者它可以是来自加热器的冷凝物或者它可以是以上提及的任何组合，例如水和超滤渗透物的混合物。
絮凝
为了絮凝该发酵液，可以将二价盐添加到该发酵液中，特别是钙盐和/或镁盐，例如，氯化钙或氯化镁。优选实施例为钙盐，尤其是氯化钙。
可以按照0.01％-10％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；优选0.5％-10％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；更优选1％-9％(w/w)每千克发酵液(未稀释)；尤其是2％-8％(w/w)每千克发酵液(未稀释)的浓度将该盐添加至该发酵液中。
聚合铝化合物
为了进一步改进从发酵液中去除DNA，可以将聚合铝化合物添加到该发酵液中。已知许多种铝化合物改进絮凝，例如，Al2(SO4)3、NaAlO2、K2Al2O4、AlCl3、Al(NO3)3、Al-乙酸盐、和Al-甲酸盐。
特别有用的聚合氯化铝包括具有化学式Aln(OH)mCl(3n-m)的化合物和聚合氯化铝以及具有CAS号：1327-41-9的氯化羟铝(aluminium chlorohydrate)。
有用的聚合氯化铝的实例包括羟铝基氯化物(luminum chlorohydrate)、可获自古尔布兰德森公司(Gulbrandsen)的GC850TM(Al2(OH)5Cl)、或者NordPac 18(可获自诺沃挪第克公司(Nordisk Aluminat A/S)，丹麦)，其为具有经验式(brutto formula)Al(OH)1, 2Cl1,8的铝配合物。具有化学式Al(OH)1,2Cl1,8的有用的聚合氯化铝的另一个实例是PAX-XL100(可获自凯米拉公司(Kemira))。有用的聚合氯化铝的另外两个实例是PAC(可获自上海浩天水处理设备有限公司(Shanghai Haotian Water Treatment Equipment Co.,Ltd)，以固体形式供应)或PAC(可获自天津市凯瑞特科技有限公司(Tianjin Kairuite technologyLtd.)，以液体形式供应)。具有化学式Al(OH)1,2Cl1,8的有用的聚合氯化铝的另一个实例是PAX18(可获自凯米拉水处理公司(Kemira Water Solutions)。
聚合氯化铝的浓度将通常处于以每千克发酵液(未稀释)计0.1％-10％(w/w)的范围内；优选以每千克发酵液(未稀释)计0.5％-5％(w/w)的范围内。
在添加聚合氯化铝之后，可以调节pH。pH可以调节至在pH 2到pH 11范围之内的pH。可以用本领域中已知的任何酸或碱调节pH。
也可以在已经将该微生物从该发酵液中分离之后添加聚合氯化铝。
还可以按照两个步骤或更多个步骤添加聚合氯化铝，例如在将该微生物从该发酵液中去除之前；然后再次在已经去除该微生物之后，比如在后续下游工艺液体中。
聚合物
聚合物广泛用于颗粒凝聚。阴离子和阳离子聚合物是优选的。有用的阳离子聚合物可以是聚胺，并且有用的阴离子聚合物可以是聚丙烯酰胺。有用的聚合物浓度将通常处于以每千克发酵液(未稀释)计0.5％-20％(w/w)的范围内；优选以每千克发酵液(未稀释)计1％-10％(w/w)的范围内。
有用的阴离子聚合物的实例是SuperflocTM A 130(凯米拉公司)。有用的阳离子聚合物的实例是PolycatTM(凯米拉公司)、C521(凯米拉公司)、和C591(凯米拉公司)。
后续下游操作
可以通过本领域已知的方法，例如但不限于过滤，例如滚筒过滤、膜过滤、压滤机终端过滤、交叉流动过滤、或离心来去除絮凝的细胞。
然后可以通过本领域已知的方法将得到的蛋白质溶液进一步加工或精制。例如，可以通过常规程序回收该蛋白质，所述程序包括但不限于进一步过滤(如超滤和透析过滤)、提取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶。然后，分离的蛋白质可用本领域已知的各种程序进一步纯化和/或修饰，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析及大小排阻层析)和/或电泳程序(例如制备型等电聚焦电泳)和/或溶解度差异(例如硫酸铵沉淀)和/或萃取。
残留宿主细胞DNA的检测
术语残留宿主细胞DNA包括来自生产菌株的基因组DNA和编码感兴趣的蛋白质的DNA片段。
可以通过本领域已知的各种方法来完成微量残留宿主细胞DNA的检测和定量。开发了许多方法来测定特异性单个靶序列。方法实例为：
-利用斑点印迹的用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于杂交的方法、以及使用随机六聚物来产生覆盖这些宿主细胞的全基因组的代表性探针的放射性同位素标记的DNA探针的杂交。
-用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于定量PCR的方法，该特异性DNA靶向特异性基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。
-用于检测具有定义起源的特异性DNA的定性PCR方法，该特异性DNA靶向特异性基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。基于可以使用该方法检测的基因组DNA的最低量来确定阈值。
根据本发明，微量DNA的纯化是通过使用FastDNATM Spin试剂盒(安倍生物医疗(MPBiomedicals))来完成的。然后，使用针对该宿主细胞上的染色***点的特异性引物，可以使该洗脱的样品经历PCR反应。包括多个阳性对照，其中已知量的宿主DNA以不同的浓度添加到PCR反应中。在PCR反应之后，使这些样品经历凝胶电泳，并比较这些DNA条带的强度以便估计在初始样品中的宿主DNA的浓度。在英尼斯(Innis)等人(1990)的PCR规程：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)(纽约学术出版公司(Academic Press inc.)中提供了PCR的详细规程。
使用本方法处理发酵液或其他蛋白制品导致发酵液中存在的DNA的量显著减少，并且优选地，该DNA含量减少至不可检测的水平。如果在单倍体基因组中以单拷贝存在的基因组DNA的任何区段的PCR扩增在溴化乙锭染色后没有给出可见条带，那么水平被认为是不可检测的。
优选地，将发酵液中的DNA水平降低至低于1μg/ml的水平，优选地低于500ng/ml、优选地低于200ng/ml、优选地低于100ng/ml、优选地低于50ng/ml、优选地低于20ng/ml、优选地低于10ng/ml、优选地低于5ng/ml、优选地低于2ng/ml、优选地低于1ng/ml、并且最优选地低于500pg/ml。
在一个典型的监管环境的实例中，例如在1、5、10或20ng/mL酶制品的检测限的情况下，没有可检测到的DNA可以使用基于PCR的测定来确定。
此外，还考虑使用即刻法，与从发酵液中去除DNA的常规方法或其他蛋白制品组合。
在以下各段中进一步概述本发明：
1.一种用于从发酵液中去除DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将发酵液加热到至少70℃的温度。
2.根据段落1所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
b)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
c)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
3.根据段落1或2所述的方法，其中该感兴趣的蛋白是一种肽或一种多肽。
4.根据段落3所述的方法，其中该感兴趣的蛋白是一种包含从5至100个氨基酸的肽。
5.根据段落4所述的方法，其中该感兴趣的蛋白是一种包含从10至80个氨基酸的肽。
6.根据段落5所述的方法，其中该感兴趣的蛋白是一种包含从15至60个氨基酸的肽。
7.根据段落3所述的方法，其中感兴趣的蛋白质是一种抗微生物肽、脂肽或布拉齐甜蛋白。
8.根据段落3所述的方法，其中感兴趣的蛋白质是一种酶。
9.如段落8所述的方法，其中该酶选自以下各项中：水解酶、裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、纤维素酶、木聚糖酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶、角叉菜聚糖酶、黄原胶酶、葡聚糖内切酶、几丁质酶、天冬酰胺酶、脂肪酶、磷脂酶、角质酶、溶菌酶、植酸酶、过氧化物酶、乳糖酶、葡糖异构酶、木糖异构酶、酯酶和磷酸二酯酶。
10.根据段落8或9所述的方法，其中该酶是一种热稳定酶。
11.根据段落10所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少30分钟。
12.根据段落11所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少40分钟。
13.根据段落12所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少50分钟。
14.根据段落13所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少60分钟。
15.根据段落14所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少70分钟。
16.根据段落15所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少80分钟。
17.根据段落16所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少90分钟。
18.根据段落17所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少100分钟。
19.根据段落10至18中任一项所述的方法，其中该热稳定酶是一种淀粉酶或一种天冬酰胺酶。
20.根据以上段落中任一项所述的方法，其中该微生物是一种细菌或真菌。
21.根据段落20所述的方法，其中该微生物是一种选自下组的真菌，该组由以下各项组成：木霉属和曲霉属宿主细胞。
22.根据段落21所述的方法，其中该真菌是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉的菌株。
23.根据段落20所述的方法，其中该微生物是选自下组的细菌，该组包括***，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属，或革兰氏阴性菌，如弯曲菌属、埃希氏杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属。
24.根据段落23所述的方法，其中该细菌宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
25.根据以上段落中任一项所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到至少75℃。
26.根据段落25所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到至少80℃。
27.根据段落1至24中任一项所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到70℃和110℃之间的温度。
28.根据段落27所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到70℃和100℃之间的温度。
29.根据段落28所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到70℃和90℃之间的温度。
30.根据段落27所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到75℃和110℃之间的温度。
31.根据段落30所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到75℃和100℃之间的温度。
32.根据段落31所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到75℃和90℃之间的温度。
33.根据以上段落中任一项所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续在2min和150min之间的一段时间。
34.根据段落33所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续在5和135min之间的一段时间。
35.根据段落34所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续在10和120min之间的一段时间。
36.根据段落35所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续在20和100min之间的一段时间。
37.根据段落1至32中任一项所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少10min的一段时间。
38.根据段落37所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少20min的一段时间。
39.根据段落38所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少30min的一段时间。
40.根据段落39所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少40min的一段时间。
41.根据段落40所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少50min的一段时间。
42.根据段落41所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少60min的一段时间。
43.根据段落42所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少70min的一段时间。
44.根据段落43所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度，持续至少80min的一段时间。
45.根据以上段落中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝是以每千克发酵液计0.1％-10％(w/w)的量添加的。
46.根据以上段落中任一项所述的方法，其中除了聚合氯化铝之外，还添加了一种或多种絮凝剂。
47.根据段落46所述的方法，其中这些絮凝剂选自下组，该组由盐和聚合物组成。
48.根据段落47所述的方法，其中该聚合物是一种阴离子聚合物或阳离子聚合物。
49.根据以上段落中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的分离是通过离心或过滤进行的。
50.根据段落2所述的方法，其中在添加聚合氯化铝之后将pH调节到在pH 2到pH11范围之内的pH。
51.根据以上段落中任一项所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于1μg/ml的水平。
52.根据段落51所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于500ng/ml的水平。
53.根据段落52所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于200ng/ml的水平。
54.根据段落53所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于100ng/ml的水平。
55.根据段落54所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于50ng/ml的水平。
56.根据段落55所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于20ng/ml的水平。
57.根据段落56所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于10ng/ml的水平。
58.根据段落57所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于5ng/ml的水平。
59.根据段落58所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于2ng/ml的水平。
60.根据段落59所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于1ng/ml的水平。
61.根据段落60所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于500pg/ml的水平。
62.根据段落61所述的方法，其中该DNA是低于检测限的。
63.根据段落62所述的方法，其中通过在单倍体基因组中以单拷贝存在的基因组DNA的任何区段的PCR扩增，随后通过凝胶电泳和溴化乙锭染色来确定检测限，其中该染色并没有披露任何可见条带。
64.根据以上段落中任一项所述的方法，其中在步骤b)之后每克发酵液存在少于10ng的宿主细胞DNA。
65.根据以上段落中任一项所述的方法，其中该发酵液可以用水稀释高达2000％(w/w)。
在下列实例中进一步阐明本发明，这些实例并不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实例
材料与方法
实例1：
以中试规模通过热处理和絮凝的组合，从淀粉酶变体的发酵液中去除DNA
如本领域中已知的进行表达α-淀粉酶变体的地衣芽孢杆菌菌株的深层发酵。
该发酵液包含感兴趣的蛋白质，并且产生的发酵液具有所证实的DNA含量。
在标准发酵结束时，在槽中借助受控的蒸汽注射升高该发酵液的温度。提高温度以达到80℃，并且维持发酵液在该温度持续约30min。一旦进行热处理，在混合并借助槽周围的外壳冷却/加热热容的情况下，将该发酵液转移到另一个槽中；将该发酵液冷却以达到35℃，并且在进一步处理前以恒定混合维持在该温度。
根据以下说明，将发酵液进行分批絮凝：
将发酵液用热自来水稀释，保持35℃的温度通过酶回收的第一部分。在添加聚合铝酸盐GC850TM之后用乙酸和/或氢氧化钠溶液调节pH，以便达到所希望的pH 10.5设定点。
然后将絮凝的材料提交到一个回收过程，该回收过程类似于用于标准生产的回收过程但是规模缩小至中试规模。根据各个制造商的说明和/或根据本领域中已知的方案操纵所有的设备部件。该过程包括：
-在一次性HS2000滤板上的初滤(帕尔，隆德，瑞典(Pall,Lund,Sweden))，
-在一次性EKS过滤模块上的细菌过滤(帕尔，隆德，瑞典)，
-在半透UFX10膜上的超滤(UF)(阿法拉伐，隆德，瑞典(Alfa Laval,Lund,Sweden))。通过超滤获得的酶浓度等于在标准生产中观察到的浓度。
-用蔗糖、pH控制与调节稳定UF浓缩物。用于稳定的蔗糖的量与在标准生产中所使用的量相同。
在上文提及的所有流处取得样品并将其交付以进行残留DNA分析(FastDNATM Spin试剂盒和PCR)。在热处理之前收集发酵液样品，与过程流样品平行分析其DNA含量。
只有未处理的培养液具有由琼脂糖凝胶上PCR条带的存在所指示的阳性DNA信号。(参见图1中的箭头)。所有其他样品具有由相同琼脂糖凝胶上的PCR条带的不存在指示出的阴性DNA信号。添加阴性对照(水)来评估DNA分析的质量。
为了进行比较，针对其对应的超滤酶浓缩物中残留DNA的存在，检查至少两个独立的、标准生产批次。所有样品均显示出包含大量的残留的宿主DNA(数据未示出)。
结论：
这些结果指示出发酵液的热处理和后续絮凝的组合对于从淀粉酶变体的生产菌株中去除残留宿主DNA具有积极作用。
实例2：
以中试规模和生产规模通过热处理和絮凝的组合，从天冬酰胺酶的发酵液中去除 DNA
如本领域中已知的进行表达天冬酰胺酶的枯草芽孢杆菌菌株的深层发酵。
该发酵液包含感兴趣的蛋白质(天冬酰胺酶)，并且产生的发酵液具有所证实的DNA含量。
在标准发酵结束时，在槽中借助受控的蒸汽注射升高该发酵液的温度。提高温度以达到80℃，并且将发酵液在该温度下孵育80min。一旦进行热处理，在混合并借助槽周围的外壳冷却/加热热容的情况下，将该发酵液转移到另一个槽中：将该发酵液冷却以达到约15℃，并且在进一步处理前以恒定混合维持在该温度。
根据以下说明，以中试规模，将发酵液进行分批絮凝：
组分 量 浓度 供应商
热处理的发酵液 330kg -
自来水 1460kg -
CaCl2 8.05kg 100％ 泰特拉，赫尔辛堡，瑞典
GC850TM 8.15kg 100％ 凯米拉水，哥本哈根，丹麦
Superfloc C591TM 56.7kg 10％ 凯米拉水，哥本哈根，丹麦
Superfloc A130TM 17.9kg 0.01％ 凯米拉水，哥本哈根，丹麦
将发酵液用热自来水稀释，以达到35℃的温度通过酶回收的第一部分。在添加聚合铝酸盐GC850TM之后用乙酸和/或氢氧化钠溶液调节pH，以便达到所希望的pH 9.0设定点。
然后将絮凝的材料提交到一个回收过程，该回收过程类似于用于标准生产的回收过程但是规模缩小至中试规模。根据各个制造商的说明和/或根据本领域中已知的方案操纵所有的设备部件。该过程包括：
-在转筒真空过滤机上的滚筒过滤，
-在离心排气过滤器上的精细过滤，
-在一次性EKS过滤模块上的细菌过滤(帕尔，隆德，瑞典)，
-在半透UFX10膜上的超滤(阿法拉伐，隆德，瑞典)，
-在一次性EKS过滤模块上的最终细菌过滤。
在上文提及的所有流处取得样品并将其交付以进行残留DNA分析(FastDNATM Spin试剂盒和PCR)。在热处理之前收集发酵液样品，与过程流样品平行分析其DNA含量。
只有未处理的培养液具有由琼脂糖凝胶上PCR条带的存在所指示的阳性DNA信号。(参见图2中的箭头)。所有其他样品具有由相同琼脂糖凝胶上的PCR条带的不存在指示出的阴性DNA信号。添加阴性对照(水)来评估DNA分析的质量。
作为对照，根据上文描述的技术回收类似的发酵液，但是没有初步的热处理。所有的过程流的分析表征证实在所有步骤在超滤浓缩物样品中具有浓度具体增加的残留DNA的存在(数据未示出)。
实例3：
如实例2中描述所制备的天冬酰胺酶产生菌的一个额外的发酵液以中试规模借助蒸汽注射来进行热处理，并且用类似配方进行絮凝，该类似配方如上文描述的并且针对化学品剂量进行略微修改以获得令人满意的细胞分离(数据未示出)。以中试规模使用如上文描述的相同方法进行酶回收。在培养液自身和热处理发酵液的上清液之外，在整个回收过程执行中所收集的所有过程流样品被证明是没有残留DNA的(图3)。
该测试特别强调组合热处理和絮凝的益处。
实例4：
以产生规模，在生产相关设备上并且根据本领域中已知的说明，借助蒸汽注射执行如实例2中描述所制备的天冬酰胺酶发酵液的热处理连同热处理的发酵液的后续絮凝。在这里同样，将絮凝配方针对化学药品剂量进行略微修改以获得令人满意的细胞分离；联机并且不分批进行絮凝。在整个回收过程执行中，以一式三份收集过程流样品；其分析证明，DNA在超滤装置以外的大部分浓缩酶溶液中不能检测到(数据未示出)。
该测试证实了上文描述的技术能以生产规模成功地扩大规模。在生产中使用的连续絮凝相比中试规模中使用的分批地絮凝没有给出不同的结果，表明当与发酵液的热处理组合时，这两种技术都可以成功地执行。
来自实例2、3和4的结论：
这些结果大力支持如下：热处理与絮凝的组合对于以中试规模并且最重要的是，以生产规模从天冬酰胺酶生产菌株中去除残留宿主DNA具有积极作用。

Claims (22)

1.一种用于从发酵液中去除DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
a)将该发酵液加热到至少70℃的温度。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
b)将一种聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
c)从该发酵液中分离该絮凝的微生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中感兴趣的蛋白质是一种肽，如抗微生物肽、脂肽或布拉齐甜蛋白；或一种多肽如一种酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中感兴趣的蛋白质是选自以下中的一种酶：水解酶、裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、纤维素酶、木聚糖酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶、角叉菜聚糖酶、黄原胶酶、葡聚糖内切酶、几丁质酶、天冬酰胺酶、脂肪酶、磷脂酶、角质酶、溶菌酶、植酸酶、过氧化物酶、乳糖酶、葡糖异构酶、木糖异构酶、酯酶和磷酸二酯酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该酶是一种热稳定酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该热稳定酶具有被测量为如下半衰期的热稳定性：在70℃和pH 7.0下至少30分钟，优选地至少40分钟、优选地至少50分钟；优选地至少60分钟、优选地至少70分钟、优选地至少80分钟、优选地至少90分钟、优选地至少100分钟。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中该热稳定酶是一种淀粉酶或一种天冬酰胺酶。
8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该微生物是一种细菌或真菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该微生物是一种选自下组的真菌，该组由以下各项组成：木霉属和曲霉属宿主细胞；优选地来自哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。
10.根据权利要求8所述的方法，其中该微生物是来自下组的一种细菌，该组包括一种革兰阳性菌，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属，或一种革兰氏阴性菌如弯曲菌属、埃希氏杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属，如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到至少75℃，优选地至少80℃。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中将该发酵液的温度加热到70℃和110℃之间的温度。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中将该温度保持在高于70℃的温度下持续至少10min的一段时间，优选地至少20min、优选地至少30min、优选地至少40min、优选地至少50min、优选地至少60min、优选地至少70min、优选地至少80min。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝是以每千克发酵液计0.1％-10％(w/w)的量添加的。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中除聚合氯化铝之外，添加优选地选自下组的一种或多种絮凝剂，该组由以下各项组成：盐和聚合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中该聚合物是一种阴离子聚合物或阳离子聚合物。
17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的分离是通过离心或过滤进行的。
18.根据权利要求2所述的方法，其中在添加聚合氯化铝之后将pH调节到在pH 2到pH11范围之内的pH。
19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中将该DNA水平降低至低于1μg/ml的水平，优选地低于500ng/ml、优选地低于200ng/ml、优选地低于100ng/ml、优选地低于50ng/ml、优选地低于20ng/ml、优选地低于10ng/ml、优选地低于5ng/ml、优选地低于2ng/ml、优选地低于1ng/ml、优选地低于500pg/ml。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该DNA是低于检测限的。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过在单倍体基因组中以单拷贝存在的基因组DNA的任何区段的PCR扩增，随后通过凝胶电泳和溴化乙锭染色来确定检测限，其中该染色并没有披露任何可见条带。
22.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该发酵液可以用水稀释高达2000％(w/w)。
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