CN106248937A - 一种检测犬副流感病毒抗体的间接elisa试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了犬副流感病毒核衣壳蛋白在制备检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒中的应用，本发明还公开了一种检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒可用于快速检测临床犬血清样品中犬副流感病毒抗体和免疫犬的抗体监测，具有检测特异性、敏感性和重现性高等特点。

Description

一种检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于动物病毒学与免疫学技术领域，具体涉及犬副流感病毒核衣壳蛋白在制备检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒中的应用，本发明还涉及一种检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
背景技术
犬副流感是由犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV，下文称之为CPIV)引起犬的一种传染性疾病。该病流行广泛，病毒侵害犬呼吸***，引起呼吸***炎症，临床表现为发热、咳漱、流涕，常和细菌、支原体及其他病毒混合感染，使犬病情加重。犬副流感是目前养犬业，尤其是宠物犬的主要传染病之一。
CPIV是腮腺炎病毒属，副黏病毒科成员，病毒基因组为单链，不分节段，负链RNA病毒，长约15kb，包含编码8个结构蛋白(NP、P、V、M、SH、HN、F、L)的7段基因。其中，核衣壳蛋白(NP)为病毒核衣壳的主要组成成分，含量最高，与病毒RNA结合，高度保守，与病毒粒子的组装、复制和刺激机体产生免疫应答等密切相关。NP蛋白在病毒感染初期即可诱导机体产生强烈的抗体反应并产生高滴度的特异性抗体。
随着国民生活水平的提高，宠物犬饲养量逐年上升，因此对犬和犬主人的健康保驾护航，加强犬副流感的检测及防治非常重要。迄今，国际上用于犬副流感检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定，RT-PCR，胶体金试纸条等。而针对抗体的检测方法有免疫荧光法，中和实验和血凝抑制试验等，这些方法都需要专业昂贵的实验设备和专业操作人员，检测周期长，操作繁琐，对实验条件要求严格，不适用于临床快速检测和大规模检测。因此建立一种快速、简便、特异、灵敏的抗体检测方法，并能够同时应用于临床患犬的诊断和免疫犬的抗体监测，就成为了犬副流感防治技术研究中的一项重要课题。
目前，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬副流感抗体的方法报道很少，只有利用CPIV HN蛋白建立的间接ELISA方法(宋彩玲等，犬副流感病毒HN基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立.中国预防兽医学报.2015,37(8):615-618)。但CPIV HN蛋白为病毒膜蛋白，基因易发生变异，随之抗原表位也会发生变化，没有CPIV NP蛋白保守，稳定。因此，建立一套快速、灵敏并面向基层的犬副流感抗体检测方法也就成为了防控犬副流感课题中的重要内容。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用犬副流感病毒核衣壳蛋白建立的检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒可用于快速检测临床犬血清样品中犬副流感病毒抗体和免疫犬的抗体监测。
本发明通过以下技术方案实现：
1.犬副流感病毒核衣壳蛋白的原核表达
1)以犬副流感病毒感染vero细胞后提取的总RNA为模板，RT-PCR扩增犬副流感病毒核衣壳蛋白NP基因(基因登陆号：NC_006430.1)，并将其克隆到表达载体pGEX-6p-1上，NP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将构建得到的原核表达载体pGEX-6p-1-NP转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选单个重组菌，该菌株经诱导可以特异性地表达犬副流感病毒核衣壳蛋白NP；
2)将步骤1)所述的表达的NP蛋白进行亲和层析和分子筛纯化。
2.本发明的试剂盒的组装
本发明制备的试剂盒由下列部分构成：原核表达的犬副流感病毒核衣壳蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶标记的羊抗犬酶标抗体，标准阳性对照血清，标准阴性对照血清，洗涤液，显色底物液A、显色底物液B和显色终止液，其中所述的洗涤液，显色底物液A、显色底物液B和显色终止液的组分及配比如下：
洗涤液(工作液)：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.27g，Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，Tween200.5mL，加双蒸水至1000mL；
显色底物液A：将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶解于DMSO中，使其终浓度为11mg/mL，加入1/10体积的甘油，再加入终浓度为0.5mg/mL的L-半胱氨酸盐酸盐；
显色底物液B：重量百分比为：0.15％柠檬酸，0.25％磷酸氢二钠，0.01％亚硫酸钠，0.002％EDTA，0.001％Tween20，0.02％过氧化氢脲，余量为水，调pH至5.5；
显色终止液：2mol/L氢氟酸溶液。
3.犬副流感病毒抗体检测的间接ELISA方法
包括以下步骤：
1)将待测血清样品用稀释液稀释；
2)加样：向犬副流感病毒核衣壳蛋白包被的酶标板微孔中加入待测血清样品稀释液100μL，37℃恒温孵育90min；
2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液200μL，洗涤5次并拍干；
3)加酶标二抗：每孔中加入辣根过氧化酶标记的羊抗犬酶标抗体100μL，37℃恒温孵育30min；
4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液200μL，洗涤5次并拍干；
5)加底物液：将显色底物液A用显色底物液B稀释50倍混匀后每孔加100μL，避光显色15min；
6)加终止液：每孔中加入显色终止液50μL；
7)测定：用酶标仪在630nm处测定每孔的吸光光度值。
所述犬副流感病毒核衣壳蛋白的最佳包被浓度为0.95μg/mL，包被液的组分及配比为：1.59g NaCO3，2.93g NaHCO3，加双蒸水至1000mL，pH9.6。
所述酶标抗体的最佳稀释倍数为1：5000。
更详细的技术方案如实施例所述。
本发明的有益效果是：
1.构建了检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，为犬副流感病毒抗体的检测奠定了基础。目前针对犬副流感抗体的检测缺乏成熟的适合临床应用的快速、简便、稳定、高效的方法，且不能对免疫犬进行抗体监测，本发明首次通过探索影响因素，摸索实验条件，建立了有效检测犬副流感病毒抗体的试剂盒和方法。
2.为临床上犬副流感病毒感染情况的快速检测提供了有效的工具。ELISA方法实验操作简便易行，检测快速敏感，同时不需要精密的仪器设备，是一种面向基层并适用于大批量检测的有效方法。本发明根据实际应用需要所构建的犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒解决了临床上犬副流感病毒抗体无可靠实用方法的问题。
3.建立的间接ELISA试剂盒不仅可以用于病犬的快速、早期诊断，也可以对免疫犬进行免疫监测，从而提供了更加广阔的应用空间。
4.建立的间接ELISA试剂盒和方法具有较高的特异性、敏感性和重现性，检测效果优于现有试剂盒和方法。
具体实施方式
实施例1 犬副流感病毒NP蛋白的表达与纯化
1.CPIV NP基因的克隆
根据NCBI上(NCBI Reference Sequence:NC_006430.1Parainfluenza virus 5,complete genome)已发表的NP蛋白的基因序列，结合pGEX-6p-1载体用primer 5.0软件设计一对特异性引物(NP-F：CCGGAATTCATGTCATCCGTGCTTA，NP-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGATGTCAAGATCACCCA)，以实验室保存的pET-28a-NP质粒为模版克隆CPIV NP基因全长(primer star，50μL)，反应体系和程序如下：
反应体系加好后进行短暂离心，按以下程序进行PCR扩增：
PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行分离，回收(胶回收具体操作步骤参照试剂盒说明书；BioSpin Gel Extraction Kit，Bioer Technology Co.,Ltd.)。PCR回收产物用分光光度计测定浓度与质量后保存于-20℃备用(短暂保存可于4℃冰箱)。
2.pGEX-6p-1-NP表达载体的构建与鉴定
将pGEX-6p-1载体和胶回收得到的NP基因片段分别用EcoR Ⅰ、Not Ⅰ限制性内切酶进行双酶切(37℃、3h)，双酶切体系为：
酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶分离，回收。酶切片段16℃连接过夜，连接体系如下：
将连接产物全量加入至50μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90sec后迅速冰浴2-3min。加入1mL的无抗生素LB液体培养基轻轻吹打混匀后，37℃摇培60min。摇培的菌液1000rpm离心10min后，将上清液弃至100μL左右，与沉淀轻轻吹打混匀后全量转移到含有氨苄(100μg/mL)的LB平板上(LB平板从4℃冰箱取出后先放置37℃恒温培养箱烘烤10min以除去水分后再用，但时间不能太长，以免LB平板过度干燥影响菌液的均匀涂布)，涂布均匀并正面放置5-10min，使菌液完全被培养基吸收。37℃培养16-24h至单菌落出现。
随机挑取5个单菌落接种到含有氨苄的LB液体培养基中摇培12h后提取质粒(质粒提取具体操作参照试剂盒说明书；Plasmid Mini Kit Ⅰ,OMEGA BIO-TEC)。对提取的质粒进行双酶切鉴定(EcoR Ⅰ、Not Ⅰ)，将酶切鉴定正确的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
3.NP蛋白的诱导表达
将鉴定正确的pGEX-6p-1载体转化Rosetta大肠杆菌株感受态，挑取单菌落接种到含有100μg/mL氨苄的LB液体培养基中摇培12h，按1:100将菌种接种到氨苄培养基中37℃摇培至A600为0.6-0.8(约3h)。加入终浓度为1mM IPTG，30℃，诱导表达10h。
4.NP蛋白的纯化
将诱导表达结束的菌液5000rpm 4℃离心10min，收集菌体沉淀，PBS洗涤后用适量PBS重悬。用压力破碎仪(压力为1000)，破碎4个循环后8000rpm 4℃离心20min收集上清。用0.45μm滤膜过滤后进行GST-Tag亲和层析和分子筛纯化。纯化的NP融合蛋白用BCA法测定蛋白浓度后分装保存于-80℃备用。
最终得到浓度含量为1.52mg/mL的NP-GST融合蛋白。SDS-PAGE鉴定显示纯的NP-GST融合蛋白纯度较高，western blot鉴定显示纯化的蛋白纯度较高，可与犬抗血清发生特异性反应，满足后续试验需求。
实施例2 犬副流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立
1.犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒最佳反应条件的确定
以本发明制备的NP蛋白包被酶标板作为抗原，HRP标记羊抗犬二抗体与犬血清一抗结合，并催化TMB底物显色。通过方阵滴定确定蛋白的最佳包被浓度为0.95μg/mL，酶标抗体的最佳稀释倍数为1:5000。
2.犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒阴阳临界值的确定
检测经间接免疫荧光(IFA)检测为犬副流感病毒抗体阴性的37份犬血清样品，同时设标准阳性对照及阴性对照，经多次重复检测OD630值(OD630)，最终确定本方法的阴阳性临界值判定标准如下：
实验成立条件：
阳性对照平均OD值(PC)：大于2.0；
阴性对照平均OD值(NC)：小于0.2；
SP计算方法：
阴阳性界线判定标准：
阳性 阴性
SP≥1.29 SP＜1.29
结果见表1。
表1 37份犬副流感病毒阴性样品间接ELISA检测结果
3.犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒特异性试验
用建立的间接ELISA方法对已知犬细小病毒(CPV)阳性血清，犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)阳性血清，狂犬病毒(RABV)阳性血清进行特异***叉试验，同时设标准阴阳性对照。结果显示所建方法与常见犬病毒抗血清无交叉反应性，说明本发明方法的特异性良好。本发明试剂盒的特异性试验结果见表2。
表2 犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒特异性试验结果
抗血清 CPV CRCoV RABV 阳性对照 阴性对照
OD630 0.225 0.368 0.687 2.509 0.099
4.犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒敏感性试验
将CPIV阳性血清分别进行1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000倍稀释，用所建立的方法进行检测，测定OD630。结果显示CPIV阳性血清500倍到16000倍稀释时仍检测为阳性，32000到64000倍稀释时检测为阴性，表明所建方法具有较好的敏感性。结果见表3。
表3 犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的敏感性试验结果
5.犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒重复性试验
用同期包被的酶标板对6份血清进行检测，统计分析得其变异系数(CV％)为0.49％-7.7％，小于10％(如表4所示)。用不同时期包被的酶标板对6份血清进行检测，统计分析得其变异系数(CV％)为1.1％-9.8％，小于10％(如表5所示)。批内变异系数和批间变异系数均小于10％，说明本发明的试剂盒具有良好的重复性。
表4 利用同批包被ELISA酶标板对6份样品的检测结果
表5 利用3批包被ELISA酶标板对6份样品的检测结果
实施例3 犬副流感病毒抗体间接ELISA抗体检测试剂盒的组装
1.ELISA试剂盒组装
(1)96孔酶标板，包被有犬副流感NP蛋白；
(2)标准阳性对照：犬副流感阳性血清；
(3)标准阴性对照：犬副流感阴性血清；
(4)辣根过氧化物酶标记的羊抗犬酶标抗体；
(5)洗涤液(10×浓缩)：NaCl 80.0g，KH2PO4 2.7g，Na2HPO4 14.2g，KCl 2.0g，Tween20 5ml，加双蒸水至1000ml；
(6)显色底物液A：将TMB溶解于DMSO中，使其终浓度为11mg/mL，加入1/10体积的甘油，再加入终浓度为0.5mg/mL的L-半胱氨酸盐酸盐；
(7)显色底物液B：0.15wt％柠檬酸，0.25wt％磷酸氢二钠，0.01wt％亚硫酸钠，0.002wt％EDTA，0.001wt％Tween20，0.02wt％过氧化氢脲，余量为水，调pH至5.5；
(8)显色终止液：2mol/L氢氟酸溶液。
2.酶标板的制备
用包被液将犬副流感病毒NP蛋白稀释至0.95μg/mL，每孔加100ul，4℃过夜，倾去孔内液体，用洗涤液洗5次，拍干，然后用封闭液封闭，37℃孵育45min，倾去孔内封闭液，洗涤液洗涤5次，拍干，用铝膜真空封闭保存、备用。
包被液：1.59g NaCO3，2.93g NaHCO3，加双蒸水至1000ml，pH 9.6。
实施例4 犬副流感病毒抗体间接ELISA抗体检测试剂盒的测定程序
1.试剂的配制
洗涤液：将实施例3的试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用；
2.测定步骤
1)将待测血清样品用稀释液稀释；
2)加样：向犬副流感病毒核衣壳蛋白包被的酶标板微孔中加入待测血清样品稀释液100μL，37℃恒温孵育90min；
3)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液200μL，洗涤5次并拍干；
4)加酶标二抗：每孔中加入辣根过氧化酶标记的羊抗犬酶标抗体100μL，37℃恒温孵育30min；
5)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液200μL，洗涤5次并拍干；
6)加底物液：将显色底物液A用显色底物液B稀释50倍混匀后每孔加100μL，避光显色15min；
7)加终止液：每孔中加入显色终止液50μL；
8)测定：用酶标仪在630nm处测定每孔的吸光光度值(OD630值)。
3.结果判断
以标准阳性对照孔平均OD值(PC)大于2.0，标准阴性对照孔平均OD值(NC)：小于0.2判定为本次测定成立的条件。按照公式 以待检测样品的SP≥1.29判定为阳性；SP＜1.29判定为阴性。
实施例5 犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的临床应用
分别使用所发明的犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒和CPIV IFA方法对临床收集的122份犬血清进行检测，并对检测结果进行统计分析。结果显示间接ELISA方法和IFA方法的总符合率为82.8％，说明本发明的间接ELISA方法与对照IFA方法具有较高的符合率。检测结果见表6。
表6 犬副流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与IFA方法的符合率比较

Claims (4)

1.犬副流感病毒核衣壳蛋白在制备检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒中的应用。
2.一种检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括犬副流感病毒核衣壳蛋白包被的酶标板，辣根过氧化酶标记的羊抗犬酶标抗体，标准阳性对照血清，标准阴性对照血清，洗涤液，显色底物液A、显色底物液B和显色终止液，其中所述的洗涤液，显色底物液A、显色底物液B和显色终止液的组分及配比如下：
洗涤液：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.27g，Na2HPO4 1.42g，KCl 0.2g，Tween20 0.5mL，加双蒸水至1000mL；
显色底物液A：将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶解于DMSO中，使其终浓度为11mg/mL，加入1/10体积的甘油，再加入终浓度为0.5mg/mL的L-半胱氨酸盐酸盐；
显色底物液B：重量百分比为：0.15％柠檬酸，0.25％磷酸氢二钠，0.01％亚硫酸钠，0.002％EDTA，0.001％Tween20，0.02％过氧化氢脲，余量为水，调pH至5.5；
显色终止液：2mol/L氢氟酸溶液。
3.如权利要求2所述的检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述犬副流感病毒核衣壳蛋白的包被浓度为0.95μg/mL，包被液的组分及配比为：1.59g NaCO3，2.93g NaHCO3，加双蒸水至1000mL，调pH至9.6。
4.如权利要求2所述的检测犬副流感病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体的稀释倍数为1:5000。
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