CN106243243A - 一种透明质酸提纯工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:(1)絮凝过滤;(2)活性炭脱色;(3)乙醇沉淀;(4)络合沉淀:(5)解离沉淀;(6)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。本发明透明质酸提纯工艺,操作流程简单,解决了目前透明质酸钠提纯工艺复杂的问题,其生产易于控制,产品质量稳定,得率高,成本大幅下降,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物多糖提取技术领域,具体涉及一种透明质酸提纯工艺。
背景技术
透明质酸即玻璃酸(Sodium Hyaluronate),也称玻尿酸,简称HA,是人类于1934年首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种广泛存在于动物和人体***细胞外基质以及部分细菌中的一种高分子直链酸性粘多糖。目前,人们已从***、脐带、皮肤、关节滑液、脑、软骨、鸡冠、林蛙皮等组织中分离出HA。在生物体中,HA常与蛋白质相结合,并与其他粘多糖共存。在眼玻璃体和滑液中,HA以溶解形式存在,在鸡冠和脐带中,以凝胶形式存在。
HA是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1,4和β-1,3糖苷键反复交替连接而成的一种链状高分子聚合物,分子量在10万至400百万之间。分子中两种单糖按等摩尔比组成。由于HA分子中每一个双糖单位中均含有一个羧基,在生理条件下均可解离成负离子,等空间距离的负离子相互排斥,使其分子在水溶液中处于松散状,占据了大量空间,因此具有特殊的保水作用,保水能力理论上可高达500ml/g,被誉为理想的天然保湿因子。由于氢键作用,HA分子在水溶液中呈单螺旋状态的二级结构。当HA达到一定浓度时,HA分子之间产生相互作用,形成双螺旋结构,浓度达到0.1%时,HA分子即可互相缠绕,形成网状的三级结构,赋予HA溶液特异的流变学性质。该特性是HA具有粘弹性和发挥生理功能的基础。HA形成网状结构的特性赋予其广泛的生物学功能及应用开发前景。
目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状,不易溶解。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸提纯工艺。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
一种透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:
(1)絮凝过滤:将发酵液采用乙酸调节pH至4.5-5.5,加入絮凝剂,絮凝剂的添加量为18-22mg/L,絮凝温度为68-72℃,絮凝时间为42-48min,再过滤,得到滤液;
(2)活性炭脱色:将滤液采用活性炭脱色,活性炭的添加量为5.5-7.5g/L,脱色温度为68-72℃,脱色时间为42-48min,得到脱色液;
(3)乙醇沉淀:脱色液采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再经乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(4)络合沉淀:将乙醇沉淀物用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液溶解后,加入络合剂进行络合沉淀;
(5)解离沉淀:络合沉淀物用盐解离,过滤,滤液再经乙醇沉淀,最后将沉淀物经乙醇脱水,干燥;
(6)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。
所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠混合而成,所述海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
所述步骤(4)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十二烷基二甲基叔胺1-5份、十四烷基氯化吡啶1-5份、双十二烷基二甲基溴化铵1-5份、水80-100份。
优选地,所述步骤(5)中沉淀物用盐解离时,先用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次,然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。
优选地,所述干燥采用真空干燥,干燥温度为45-55℃,干燥时间为2-4小时。
本发明透明质酸提纯工艺,操作流程简单,解决了目前透明质酸钠提纯工艺复杂的问题,其生产易于控制,产品质量稳定,得率高,成本大幅下降,具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例中各原料介绍:
发酵液采用专利申请号:201310351005.4中实施例1的方法制备,其中发酵液中透明质酸含量为1.17g/L,透明质酸中蛋白质含量为0.025wt%。
乙酸,CAS号:64-19-7。
活性炭,CAS号:7440-44-0,采用巩义市北山口竹清活性炭厂提供的粒度为200目的食品级活性炭。
氢氧化钠,CAS号:1310-73-2。
乙醇,CAS号:64-17-5。
氯化钠,CAS号:7647-14-5。
海藻酸钠,CAS号:31581-02-9,采用珠海味佳食品添加剂有限公司提供的食品级海藻酸钠。
柠檬酸钠,CAS号:68-04-2,采用江苏科伦多食品配料有限公司提供的型号为K2814的食品级柠檬酸钠。
葡萄糖酸钠,CAS号:527-07-1,采用嘉兴市龙啸化工有限公司提供的食品级葡萄糖酸钠。
十二烷基二甲基叔胺,CAS号:112-18-5。
十四烷基氯化吡啶,CAS号:2785-54-8。
双十二烷基二甲基溴化铵,CAS号:3282-73-3。
实施例1
透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:
(1)絮凝过滤:取25L发酵液采用乙酸调节pH至4.7,加热至70℃后加入絮凝剂搅拌混合均匀进行絮凝,絮凝剂的添加量为20mg/L,絮凝温度为70℃,絮凝时间为45min,再进行真空抽滤,得到24L滤液;
(2)活性炭脱色:将24L滤液加热至72℃后添加144g活性炭,以转速为100转/分搅拌脱色45min后真空抽滤,得到24L脱色液;
(3)乙醇沉淀:脱色液用2.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5,加入72L 95%乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(4)络合沉淀:将乙醇沉淀物用25L 0.1mol/L氯化钠溶液溶解,在以转速为300转/分搅拌条件下加入络合剂,加入络合剂后搅拌5min,再静置1小时后母液上排,得络合沉淀物;
(5)解离沉淀:络合沉淀物用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤3次,每次洗涤0.1mol/L氯化钠溶液用量为1L,然后向沉淀中加入25L 0.5mol/L氯化钠溶液中以转速为150转/分搅拌解离16小时,真空抽滤,滤液再经75L 95%乙醇沉淀3小时,用无水乙醇脱水后,将沉淀物置于旋转式真空干燥器中,在干燥温度为50℃下真空干燥3小时,得到干燥后的沉淀物;
(6)将干燥后的沉淀物采用超细研磨机(超细研磨机为无锡市飞鸣机械有限公司生产的型号为CXM的超细研磨机)进行超细研磨至500nm。得到实施例1的纳米级透明质酸。
所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1:1:1搅拌混合均匀得到。
所述步骤(4)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十二烷基二甲基叔胺3份、十四烷基氯化吡啶3份、双十二烷基二甲基溴化铵3份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。
实施例2
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由柠檬酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的纳米级透明质酸。
实施例3
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的纳米级透明质酸。
实施例4
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的纳米级透明质酸。
实施例5
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十四烷基氯化吡啶4.5份、双十二烷基二甲基溴化铵4.5份、水91份。将十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例5的纳米级透明质酸。
实施例6
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十二烷基二甲基叔胺4.5份、双十二烷基二甲基溴化铵4.5份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例6的纳米级透明质酸。
实施例7
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十二烷基二甲基叔胺4.5份、十四烷基氯化吡啶4.5份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例7的纳米级透明质酸。
测试例1
将实施例1-7得到的纳米级透明质酸得率进行统计。计算方法:得率(%)=纳米级透明质酸质量/25L发酵液中透明质酸质量×100,具体测试结果见表1。
表1:得率结果表
得率,% | |
实施例1 | 97.0 |
实施例2 | 89.2 |
实施例3 | 92.1 |
实施例4 | 91.3 |
实施例5 | 91.2 |
实施例6 | 89.8 |
实施例7 | 90.6 |
比较实施例1和实施例2-4,实施例1(海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠复配)得率明显高于实施例2-4(海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠中任意二者复配)。比较实施例1与实施例5-7,实施例1(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵复配)得率明显高于于实施例5-7(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵中任意二者复配)。
Claims (3)
1.一种透明质酸提纯工艺,其特征在于,包括以下步骤:
(1)絮凝过滤:将发酵液采用乙酸调节pH至4.5-5.5,加入絮凝剂,絮凝剂的添加量为18-22mg/L,絮凝温度为68-72℃,絮凝时间为42-48min,再过滤,得到滤液;
(2)活性炭脱色:将滤液采用活性炭脱色,活性炭的添加量为5.5-7.5g/L,脱色温度为68-72℃,脱色时间为42-48min,得到脱色液;
(3)乙醇沉淀:脱色液采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再经乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(4)络合沉淀:将乙醇沉淀物用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液溶解后,加入络合剂进行络合沉淀;
(5)解离沉淀:络合沉淀物用盐解离,过滤,滤液再经乙醇沉淀,最后将沉淀物经乙醇脱水,干燥;
(6)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。
所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠混合而成,所述海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
所述步骤(4)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十二烷基二甲基叔胺1-5份、十四烷基氯化吡啶1-5份、双十二烷基二甲基溴化铵1-5份、水80-100份。
2.如权利要求1所述的透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(5)中沉淀物用盐解离时,先用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次,然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。
3.如权利要求1所述的透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述干燥采用真空干燥,干燥温度为45-55℃,干燥时间为2-4小时。
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