CN104839015B - 玉米质‑核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物育种技术领域，特别涉及玉米质‑核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用。目的是得到雄性不育的转基因受体材料，节省转化事件扩繁过程中的劳动成本，避免不同转化事件之间及转基因玉米对非转基因玉米栽培品种的污染。以现有的玉米质‑核互作雄性不育系为基础，用高转化效率的转基因受体材料(经测验为相应雄性不育系的保持系)为转育对象，经过多代回交并结合分子标记辅助选择，把高转化效率的转基因受体材料转育成雄性不育系。高转化效率的雄性不育系可用于遗传转化，得到转化事件后用保持系花粉在自然条件下授粉扩繁，进行性状筛选和遗传稳定性分析。

Description

玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在 遗传转化和后代扩繁中的应用

技术领域

本发明涉及农作物育种技术领域，特别涉及玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用。

背景技术

转基因玉米是通过转基因技术将外源基因导入到玉米基因组中，使其具备人类所期望的玉米品系。转化事件是指在把外源基因导入玉米基因组的过程中，特定的外源基因与玉米DNA在特定染色体、特定位点结合的事件，导入的基因不同或结合位点的不同均代表不同的转化事件，即使是相同的基因，导入到不同的染色体或同一染色体的不同位点，其结果也大不相同。为了得到外源基因表达量高、目的性状突出、遗传稳定的转化事件，就需要筛选大量的转化事件。

目前，玉米转基因受体是几个具有较高转化效率的正常自交系或杂交种，如综3和综31(杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究.农业生物技术学报，2001,9(4):334～337)、HiIIAB(Songstad D D,Armstrong C L,Peterson W L,etal.Production of transgenic maize plant s and progeny by bombardment of HiⅡimmature embryos.In Vitro Cellular&Developmental Biology,1996,32:179～183)、A188和B73(张荣，王国英，张晓红，赵虎基.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立.农业生物技术学报,2001,99(1):45～48)、齐319(马丽.玉米自交系幼胚高效再生***的建立.西北农业学报,2007,16(6):85～89)、P9-10(周逢勇，戴景瑞，王国英，谢友菊，崔洪志，郭三堆.玉米自交系P9-10遗传转化体系的建立.科学通报,1998,43(23):2517～2520)等，这些受体的转化事件的扩繁均采取自交或用正常自交系回交的方法，雌雄穗均需要套袋隔离，即在雌穗吐丝前用纸袋套住，防止其他植株的花粉散落到雌穗上，雄穗散粉前也用纸袋套住，防止花粉漂移到其他植株上。待雌穗吐丝，雄穗散粉后再取雄穗花粉或正常自交系花粉给雌穗授粉，完成授粉过程，操作步骤多且复杂。由于涉及到的转化事件较多，一方面工作量大，需要耗费大量的劳动成本，且质量难以保证；另一方面由于含有转基因成分的花粉不可避免的散落到环境中，就存在一个转化事件的花粉漂移到其他转化事件的雌穗上，造成不同转化事件之间的混杂，对后续评价分析带来巨***烦。同时，为了防止转基因玉米的花粉漂移到非转基因玉米雌穗上，造成对非转基因玉米栽培品种的污染，带来生产上的巨大损失，国家对转基因玉米种植区的隔离措施要求极其严格，除了要求有距离上的隔离，还要有物理上的隔离，这不仅增加了转基因种植基地的建设成本，加重了公司负担，同时由于满足隔离条件的基地较少，极大的限制了我国转基因玉米的研发进程。

因此，培育一种新的转基因受体材料，既能保证转化效率，又能免除繁重的授粉任务，节省劳动成本，节约资源，还能防止不同转化事件之间的污染和转基因玉米对非转基因玉米栽培品种的污染，将具有重要的经济意义和实用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用。该方法以现有的玉米质-核互作雄性不育系为基础，用高转化效率的转基因受体材料(经测验为相应雄性不育系的保持系)为转育对象，经过多代回交并结合分子标记辅助选择，在相对较短的时间内快速把高转化效率的转基因受体材料转育成雄性不育的转基因受体材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法，包括如下步骤：

1)以质-核互作雄性不育系为母本，以适合遗传转化且为雄性不育系保持系的材料为父本，杂交获得F1代果穗；

2)将步骤1)获得的所述F1代果穗的种子单粒播种，选择不育株为母本，以步骤1所述父本回交，获得BC1F1代果穗；

3)从BC1F1代开始，通过分子标记辅助选择，挑选获得背景接近步骤1所述父本的单株回交，得到下一代果穗，经过4～5代回交育成雄性不育的转基因受体材料。

雄性不育系，指雌雄同株植物中，雄蕊发育不正常，不能产生有功能的花粉，但它的雌蕊发育正常，能接受正常花粉而受精结实，并能将雄性不育性遗传给后代的植物品系，它能很好的避免由于花粉漂移导致的不同材料间的污染问题。质-核互作雄性不育是由细胞质基因与核基因互作而产生的雄性不育系，在中国专利CN201410190251、CN200510086942、CN200510011406、CN201210468807、CN201310751112中分别描述了水稻、油菜、甘蓝、棉花和玉米质-核互作雄性不育系的选育方法，为雄性不育系的利用奠定了很好的基础。玉米的质-核互作雄性不育胞质可分为S、T和C三种类型，T型细胞质雄性不育属于孢子体雄性不育，能被玉米小斑病T小种专化侵染，目前应用越来越少。S型细胞质雄性不育属于配子体雄性不育，不育稳定性较差。C型细胞质雄性不育也属于孢子体雄性不育，可分为CI、CII、CIII三个亚组，这种细胞质不育类型花粉败育时期早，败育彻底，且不育性稳定，目前应用越来越广泛，如有报道的C836G(罗红兵，黄璜，龙牧华，刘唐兴，杨友才.不同类型玉米细胞质雄性不育系恢复系选育.湖南农业大学学报，2002，28(3):202-205)、C48-2(许珂，曹墨菊，朱英国，潘光堂，荣廷昭.玉米C型细胞质雄性不育系C48-2及其保持系线粒体差异蛋白分析.作物学报，2008,34(2):232-237)、Cb37(邵思全，李琰聪.玉米C型雄性不育系的应用研究.农业科技通讯.2014，74-75)等均有过较多的研究和应用。

本发明将质-核互作雄性不育系的细胞质基因通过回交转育并结合分子标记辅助选择快速导入到具有较高转化效率的自交系中，得到具有较高转化效率的雄性不育系，该雄性不育系可用于遗传转化，得到的转基因后代可在隔离区内用保持系自然授粉繁殖后代，降低了转基因事件扩繁过程中繁重的工作任务和高额的劳动成本，避免了转基因事件之间的混杂和转基因玉米对非转基因玉米栽培品种的污染问题。

本发明的目的是提供培育玉米质-核互作雄性不育转基因受体的方法，利用该方法培育的转基因受体材料是雄性不育的，节省了转基因后代扩繁过程中人工授粉的劳动成本，更重要的是避免了不同转基因事件之间的污染及转基因玉米对非转基因玉米栽培品种的污染问题。

本发明的又一目的是提供质-核互作雄性不育转基因受体繁殖方法，用少量的劳动力和成本提供充足的转基因受体材料。

本发明的又一目的是提供转化事件的扩繁方法，用少量的劳动力和成本扩繁转基因后代用于性状分析和安全评价试验。

在本发明的一些具体实施方案中，培育方法中所述母本选自Maize GeneticsCooperation Stock Center中保藏号为C437B、C437E、C437H、C537B、C537E、C537H、C657A、C657D、C657F、C836G的雄性不育系或经过人工选育或自然突变得到的质-核互作雄性不育系。

在本发明的一些具体实施方案中，培育方法中所述父本为高转化效率的自交系，所述父本选自National Plant Germplasm System中保藏号为PI550473的B73或适合转化的材料。

在本发明的一些具体实施方案中，培育方法中所述适合转化的材料为综31。

本发明还提供了所述的培育方法获得的玉米质-核互作雄性不育转基因受体。

本发明还提供了所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体在玉米遗传转化和后代扩繁中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体在玉米遗传转化和后代扩繁中的应用中所述玉米遗传转化为将所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体的幼胚作为受体材料，将外源基因导入所述幼胚获得雄性不育的转基因后代。

本发明还提供了所述的玉米质-核互作雄性不育转基因受体的繁殖方法，将所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体和保持系在隔离区内同期播种，让所述保持系的花粉在自然条件下给所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体授粉来繁殖后代。

在本发明的一些具体实施方案中，转基因后代的繁殖方法将所述转基因后代和保持系在隔离区内同期播种，让所述保持系的花粉在自然条件下给所述转基因后代授粉。

本发明以C型质-核互作雄性不育系836(Maize Genetics Cooperation StockCenter保藏号C836G)和转基因受体材料B73(National Plant GermplasmSystem保藏号PI550473)为例，雄性不育系不仅限于836，玉米中其他的质-核互作雄性不育系，如MaizeGenetics Cooperation Stock Center中保藏号为C437B、C437E、C437H、C537B、C537E、C537H、C657A、C657D、C657F的雄性不育系或其它经过人工选育或自然突变得到的质-核互作雄性不育系也可以达到本发明的目的，因此也在本发明的保护范围内。转基因受体材料也不仅限于B73，玉米中其他转基因受体材料如综31等也可以达到本发明的目的，因此也在本发明的保护范围内。

本发明以C型质-核互作雄性不育系836为母本，基因型为S(rfrf)，以具有较高转化效率的自交系B73为父本，基因型为N(rfrf)，先进行杂交，然后用B73作为轮回亲本回交并结合分子标记辅助选择，快速将C型质-核互作雄性不育系836转育成具有较高转化效率的B73背景的雄性不育系并用于遗传转化及转化后代的扩繁，节省了劳动成本，解决了转基因事件之间的混杂及转基因玉米对非转基因玉米栽培品种的污染问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示正常玉米与C型质-核互作雄性不育系836的雄穗照片；

图2示回交后代部分籽粒分子标记检测电泳图；

图3示利用回交转育及分子标记辅助选择技术培育玉米C型质-核互作雄性不育转基因受体的技术路线图；

图4示部分转基因后代分子检测电泳图。

具体实施方式

本发明公开了一种玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

质-核互作雄性不育，不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rfrf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。如胞质基因为可育N，则不论核基因是可育(RfRf)还是不育(rfrf)，都表现为雄性可育。同样，如核里具有可育基因(RfRf)或(Rfrf)，则不论胞质基因是可育N还是不育S，也都表现为雄性可育。这种由核-质互作形成的雄性不育系，其遗传组成为S(rfrf)，不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。保持系N(rfrf)与不育系杂交，所产生的F1仍能保持雄性不育。

玉米C型质-核互作雄性不育系836[基因型为S(rfrf)]来自于美国MaizeGenetics Cooperation Stock Center，保藏号为C836G，玉米自交系B73来自于美国National Plant Germplasm System，保藏号为PI550473，经测试，B73为836的保持系。

表1标记名称、位置及序列

本发明提供的玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法及该受体在遗传转化和后代扩繁中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1玉米C型质-核互作雄性不育转基因受体的培育

本发明以B73S的培育为例，具体阐述实施方案。836[S(rfrf)]属于C型质-核互作雄性不育，是孢子体雄性不育，败育时期早，败育完全(图1)。错期播种不育系836[S(rfrf)]和自交系B73[N(rfrf)]，自交系B73[N(rfrf)]晚于不育系836[S(rfrf)]3天播种，各种2行，行长4米，株距20厘米，行距60厘米。出苗后进行正常的田间管理，包括浇水、施肥、除草、防治病害虫等，待不育系836[S(rfrf)]吐丝，自交系B73[N(rfrf)]散粉时，以836[S(rfrf)]为母本，以B73[N(rfrf)]为父本杂交并收获10个F1代果穗，果穗编号与收获籽粒数如表1所示。下季播种10个F1代果穗，并于3天后播种自交系B73[N(rfrf)]，每个F1代果穗种1行，自交系B73种2行，行长4米，株距20厘米，行距60厘米。待F1代吐丝，自交系B73[N(rfrf)]散粉时，以F1代为母本，以自交系B73[N(rfrf)]为轮回亲本回交，得到BC1F1代果穗，每个穗行收获5个BC1F1代果穗，每个果穗取50粒种子，用均匀分布于玉米染色体上的在836[S(rfrf)]和B73[N(rfrf)]之间存在多态性的SSR标记进行检测(图2)，标记名称、位置和序列见表2，PCR反应体系为(20μl)：模板DNA(836或B73基因组DNA)1μl，正向标记0.5μl，反向标记0.5μl，dNTP 0.5μl，10×PCR Buffer 2μl，Taq酶0.2μl，ddH2O 15.3μl。PCR反应条件：94℃5min，94℃30S，56℃30S，72℃30S，35个循环，72℃7min。每个BC1F1代穗行挑选出背景最接近B73的1穗(即检测种子的标记带型与B73带型相同最多的单穗)继续播种，每个穗行入选的单穗标记统计结果如表3所示，吐丝后用B73[N(rfrf)]回交。以后各代每个穗行均取5个单穗，每个单穗取50粒种子，用剩余的存在多态性差异的标记进一步检测，BC2F1、BC3F1、BC4F1代入选单穗标记统计结果如表4、表5、表6所示，回交4代，筛选出背景与B73完全相同的雄性不育单株5-1-2-4、8-3-3-5，1-2-1-3-5、2-1-1-3-4、6-2-5-1-1、10-4-1-2-5(图3)。

表2不育系836与自交系B73的F1代果穗编号与收获籽粒统计

果穗编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											收获籽粒	144	152	149	163	155	168	171	166	160	157

表3回交BC1F1代标记相似度统计

果穗编号	1-2	2-1	3-1	4-3	5-1	6-2	7-1	8-3	9-4	10-4
											BC1F1	79.1％	81.3％	80.7％	78.0％	82.6％	77.9％	81.3％	82.6％	78.8％	80.7％

表4回交BC2F1代标记相似度统计

果穗编号	1-2-1	2-1-1	3-1-4	4-3-2	5-1-2	6-2-5	7-1-3	8-3-3	9-4-3	10-4-1
											BC2F1	90.4％	91.8％	90.0％	88.8％	92.6％	89.0％	91.2％	92.8％	89.0％	90.2％

表5回交BC3F1代标记相似度统计

表6回交BC4F1代标记相似度统计

果穗编号	1-2-1-3-5	2-1-1-3-4	3-1-4-2-2	4-3-2-1-5	6-2-5-1-1	7-1-3-5-3	9-4-3-4-3	10-4-1-2-5
									BC3F1	100.0％	100.0％	96.2％	99.4％	100.0％	99.8％	98.0％	100.0％

实施例2实施案例1得到的雄性不育系用于遗传转化

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法进行遗传转化。将实施例1获得的雄性不育系5-1-2-4、8-3-3-5、1-2-1-3-5、2-1-1-3-4、6-2-5-1-1、10-4-1-2-5与保持系B73在隔离区内同期间隔播种，每3行不育系种1行保持系，行长4米，株距20厘米，行距60厘米。出苗后进行正常的田间管理，待不育系吐丝，保持系B73散粉时用保持系B73的花粉在自然条件下给不育系授粉，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，在室内进行农杆菌侵染，将被农杆菌侵染的幼胚放在选择培养基上进行多轮筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，得到转基因T0代植株。

通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法进行遗传转化的具体过程为：

一、剥离幼胚

1、材料准备。取授粉后9-11天的果穗，去掉前端发育不好的部分，用镊子从顶端***果穗，然后把果穗放入烧杯里。

2、向烧杯里加入70％的乙醇消毒20分钟，乙醇量最好没过果穗，消毒过程中要不时的移动果穗，让果穗与乙醇完全接触，达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并竖直放置，让果穗表面的乙醇流出，准备剥胚。

3、把消毒过的果穗一端放在培养皿上，另一端用***的镊子固定，用手术刀削掉籽粒的顶部，注意不要削到幼胚。

4、用手术刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，并用刀尖托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚浸于含有100μM AS高渗侵染液的2ml无菌离心管中，每管放幼胚100个左右。

二、农杆菌侵染

1、挑取农杆菌阳性克隆放入含有5ml YEP(50mg/L Kan和50mg/L Rif)培养基的50ml离心管中，在28℃温度下75rpm摇菌2-4小时。

2、将离心管中的幼胚用100μM AS的高渗侵染液洗涤2次，然后加入1ml OD＝0.3-0.4的农杆菌菌液，轻轻颠倒让幼胚与菌液均匀接触，黑暗培养10分钟，并确保幼胚全部浸泡在菌液里。

三、共培养

1、侵染结束后，将幼胚放到灭过菌的滤纸上，吸干胚表面的菌液，再把幼胚转移到共培养基上，使幼胚的平面接触培养基表面。

2、用封口膜封住培养皿，在22℃条件下暗培养3天。

四、延迟筛选

1、共培养3天后，把幼胚转移到延迟筛选培养基上，暗培养5天。

五、抗性筛选

1、延迟筛选5天后，把所有的幼胚转移到1mM草甘膦的选择培养基上暗培养两周，进行第一轮筛选，之后再转入2mM草甘膦的培养基上暗培养两周，进行第二轮筛选。

六、转基因植株的再生

1、将经过抗性筛选的玉米愈伤组织转入恢复培养基，黑暗条件下恢复培养20天。

2、将经过恢复培养后的抗性愈伤组织转入分化培养基，先在黑暗条件下培养3天，再在光照条件下进行培养。

3、将分化出的抗性植株转入生根培养基，单株培养至二级根系长出，然后移栽到温室，进行正常管理直至授粉结实。

对转基因再生植株进行目的基因的检测，并统计各个雄性不育系的转化效率，统计结果如表7所示，可见不育系2-1-1-3-4的转化效率较高，达到5.8％，且该系后代整齐一致，除雄性不育外，株高、穗位高、雄穗分支数、叶色、叶片夹角与B73表型最接近，且能稳定遗传，故将此系命名为B73S，是选育的稳定性最好且转化效率最高的雄性不育转基因受体材料。

表7各个雄性不育系幼胚转化效率统计

雄性不育系	5-1-2-4	8-3-3-5	1-2-1-3-5	2-1-1-3-4	6-2-5-1-1	10-4-1-2-5
							转化效率	3.1％	3.6％	4.0％	5.8％	4.4％	4.8％

实施例3实施例2中转基因再生苗的授粉结实

将实施案例2中的转基因再生苗先在温室进行3-5天的炼苗，炼苗结束后移栽到事先间隔栽种有保持系B73的隔离区中，通常按3行转基因再生苗1行保持系B73的间隔排列种植，行长4米，株距20厘米，行距60厘米，且保持系通常提前15天每5天播种一次，共播种三批，进行正常的田间管理，待转基因再生苗吐丝，保持系B73散粉时，用保持系B73的花粉对转基因植株完成自然授粉并结实。

通过对6个雄性不育系转基因后代的结实情况看，结实率较好，对每个系取10穗转基因后代进行籽粒数统计，平均每穗籽粒数如表8所示。

表8雄性不育系转基因后代10穗平均籽粒数统计

实施例4实施案例3中转基因后代的扩繁

将实施案例3中得到的转基因后代按转化事件分类与保持系B73在隔离区内同期间隔播种，按3行转基因后代1行保持系的间隔排列播种，行长4米，株距20厘米，行距60厘米。进行正常的田间管理，生长到5-6叶期时对转基因后代进行分子检测，部分检测结果如图4所示，检测出的转基因阳性植株保留，非阳性植株拔出，待转基因后代吐丝，保持系B73散粉时完成自然授粉并结实，得到大量的种子用于性状筛选和遗传稳定性分析。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种玉米质-核互作雄性不育转基因受体的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以质-核互作雄性不育系为母本，以适合遗传转化且为雄性不育系保持系的材料为父本，杂交获得F1代果穗；

2)将步骤1)获得的所述F1代果穗的种子单粒播种，选择不育株为母本，以步骤1所述父本回交，获得BC1F1代果穗；

3)从BC1F1代开始，通过分子标记辅助选择，挑选获得背景接近步骤1所述父本的单株回交，得到下一代果穗，经过4～5代回交育成雄性不育的转基因受体材料；

所述母本选自Maize Genetics Cooperation Stock Center中保藏号为C437B、C437E、C437H、C537B、C537E、C537H、C657A、C657D、C657F、C836G的雄性不育系；

所述父本为高转化效率的自交系，所述父本选自National Plant Germplasm System中保藏号为PI550473的B73或综31。

2.根据权利要求1所述的培育方法获得的玉米质-核互作雄性不育转基因受体在玉米遗传转化和后代扩繁中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述玉米遗传转化为将所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体的幼胚作为受体材料，将外源基因导入所述幼胚获得雄性不育的转基因后代。

4.根据权利要求1所述的培育方法获得的玉米质-核互作雄性不育转基因受体的繁殖方法，其特征在于，将所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体和保持系在隔离区内同期播种，让所述保持系的花粉在自然条件下给所述玉米质-核互作雄性不育转基因受体授粉来繁殖后代。

5.根据权利要求3所述的应用中获得的转基因后代的繁殖方法，其特征在于，将所述转基因后代和保持系在隔离区内同期播种，让所述保持系的花粉在自然条件下给所述转基因后代授粉。