CN1062140C - 从日本杜拉蚓中提取蚯吲素的方法 - Google Patents
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Abstract
从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法，a、将日本杜拉蚓洗涤后破碎，得到匀浆液；b、将匀浆液在4℃-8℃的低温下保持6-8小时，离心收集得粗提液；c、在粗提液中加入硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析或者用超滤膜超滤除盐得上清液；d、将上清液调pH值至6.1-6.8，取4＃或5＃超滤膜采用平板超滤法对上清液进得超滤，收集超滤液得精制液；c、将精制液经真空冷冻干燥或喷雾干燥得蚯蚓素。用这种方法可有效地从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素。
Description
本发明涉及从蚯蚓中提取一类多肽化合物的方法。
人民卫生出版社1986年出版的《生药学》记载：“蚯蚓体内含有地龙素、地龙解热碱、次黄票呤等”。实验表明地龙素和蚯蚓素是两种不同的组份，地龙素是一类大分子化合物，而蚯蚓素是一类小分子化合物。在药效学作用方面两者也相差甚远，地龙素有溶血作用，而蚯蚓素则具有消炎抗菌、抗病毒、抗过敏、改善微循环和降血压的作用。
OR1079902A，申请号93105054.5、申请日930518，公开了蚯蚓溶纤素的制备方法。0R1037345A公开了一种地龙溶栓酶的制备及其鉴定方法。蚯蚓溶纤素和地龙溶栓酶其药用功效主要是有溶血栓作用。
本发明的目的就是提供一种从蚯蚓中提取蚯蚓素的方法，用这种方法可有效地从日本杜拉蚓中提取所需的蚯蚓素。
从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法，包括蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于；
a、将日本杜拉蚓洗涤后，加入生理盐水进行破碎，得到匀浆液；
b、将匀浆液在4℃-8℃的低温下保持6-8小时，离心收集得粗提液；
c、在粗提液中加入0.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24-72小时或者用1#或2#超滤膜超滤除盐得上清液；
d、将上清液调PH值至6.1-6.8，取4#或5#超滤膜采用平板超滤法对上清液进行超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离，收集超滤液得精制液；
c、将精制液经真空冷冻干燥或喷雾干燥得蚯蚓素。
本发明的优点在于：用这种方法可有效地从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素，所提取的蚯蚓素对中枢神经***、循环***、呼吸***和消化***无明显影响。用蚯蚓素研制的产品系列用途广泛，可治疗哮喘、百日咳、带状疱疹、皮肤皲裂、过敏性皮炎以及烧烫伤多种疾病；还有降压作用。
实施例：
a、取活日本杜拉蚓清水漂洗至胃肠道中污物***干净，用蒸馏水反复冲洗2-3次，加入当量浓度为0.5mol/l的NaCl溶液，置高速组织捣碎机中制成组织匀浆。
b、将匀浆用搅拌机作轻微搅拌，放在4℃低温下保持6-8小时，4000转/分离心分离得粗提液。
c、将粗提液以0.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24小时后得上清液。
d、上清液调PH值至6.1-6.8，取5#超滤膜采用平板超滤法将上清液进行超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离得精制液。
e、将精制液经喷雾干燥得蚯蚓素。
以下实验可表明蚯蚓素是一类多肽化合物。
1、精确称取蚯蚓素0.001g，置100ml容量瓶中加水溶解至刻度。取该溶液用751-GW紫外分光光度计检测，在228na和253na处有特征吸收峰，最大吸收峰在253na处。
2、取上述溶液5ml于试管中，加双缩脲试剂5ml，摇匀，放置到85℃水浴中保温5-8分钟，试管底部出现有红色沉淀。
3、分别取上述蚯蚓素溶液5ml于试管中，费林试验阴性，双缩脲反应阳性；再取蚯蚓素溶液5ml，加0.5mol/l的Hcl溶液1ml，放置到85℃水浴中水解30分钟后，费林试验阴性，双缩脲反应阳性。
由以上实验分析：蚯蚓素不是蛋白质、核酸或多糖类，而是一类多肽化合物。
蚯蚓素毒性实验：
取小白鼠60只，按性别、体重均衡随机分成六组，每组10只。在Dmax(100％)致死量和Dmin (0％致死量)的范围内选择剂量，剂量的比值(1∶r)为1∶0.6，尾静脉注射给药，给药体积为0.15ml/10g体重，一次给药后，观察七天，记录动物中毒，死亡和存活的情况，按Bliss统计法测定LD50。
结果，蚯蚓素静脉注射给药后，可见动物出现不同程度的毒性反应：Dmax100％致死量即注射量为4687.5毫克/公斤时，动物出现精神萎糜不振，步态不稳，活动减少，倦缩，拱背，皮毛蓬松，嗜睡，进食停止，口鼻及尾部皮肤青紫等，于给药后立即-3小时内死亡；Djmn50％致死量即注射量为2950毫克/公斤时，毒轻者，动物活动减少，拱背，倦卧，但可进食，口鼻及尾部皮肤无青紫，于给药后30分钟内症状缓解，逐渐恢复正常，连续观察七天，动物的行为、活动、呼吸、饮食、粪尿、毛色及对外界刺激反应均正常，且无动物死亡。实验测得，LD50是2914.74±305.43，表明蚯蚓素安全无毒治疗宽度大。
一般药理实验；
一、对中枢神经***的作用
(一)镇痛作用
1、扭体法；取小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组：1组为蚯蚓素组(0.99g／kg)；2组为阿斯匹林组(0.3g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)。1、3组小鼠肌肉注射给药，2组小鼠灌胃给药，每天一次，连续三天，于末次给药30分钟后，用0.6％冰醋酸0.2ml/只腹腔注射致痛，计算15分钟内小鼠扭体次数，进行统计学处理，结果见表一。
2、热板法：取经过挑选的小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组：1组为蚯蚓素(0.09g/kg)。2组为阿斯匹林组(0.03g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)。1组、3组肌肉注射给药，2组灌胃给药，于末次给药后30分钟按热板法实验，结果见表二。
蚯蚓素肌肉注射0.03g／kg，从表一、表二可以看出，无论是扭体法还是热板法均无镇痛作用，而阿斯匹林则有显著的镇痛作用。
(二)镇静作用
取小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组：1组为蚯蚓素组(0.99/kg)；2组为养血安神片组(3g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)，1、3组小鼠肌肉注射给药，2组小鼠灌胃给药，每天一次，连续三天，于末次给药30分钟，小鼠腹腔注射戊巴比妥纳35mg/kg，以翻正反射消失为睡眠指标，观察各组小鼠睡眠时间的长短，进行统计学处理，结果见表三。
蚯蚓素对小鼠腹腔注射戊巴比妥纳引起的睡眠无协同作用，而养血安神片则有明显镇静作用。
二、对消化***的作用
(一)对大鼠原位肠(空肠)的作用；
取体重226-269g大鼠30只，每10只为一组，共分三组，即蚯蚓素组、阿托品组和生理盐水组。分别戊巴比妥纳35mg／kg剂量腹腔注射麻醉下，取大鼠空肠悬吊于拉力换能器上，换能器连接台式平衡仪，平衡15分钟，然后分别注射蚯蚓素、阿托品和生理盐水，观察3小时，记录3小时内大鼠空肠活动曲线，曲线记录速度为6mm／min。
1、蚯蚓素组大鼠空肠活动曲线见图1
蚯蚓素肌肉注射剂量112.5mg/kg，从图1不难发现，注射蚯蚓素前后，大鼠空肠收缩频率、振幅、肌张力均无明显改变。
2、阿托品组大鼠空肠活动曲线见图2
阿托品注射剂量为0.5mg/kg，从图2可以看出，注射阿托品后大鼠空肠收缩频率减慢，振幅低，肌张力下降。
3、生理盐水组大鼠空肠曲线见图3
生理盐水注射剂量为2mg/kg，注射前后，大鼠空肠收缩频率、振幅、肌张力均无明显变化。
(二)对豚鼠离体肠(回肠)的作用：
取体重240-280g豚鼠30只，每10只为一组，共为三组，即蚯蚓素组、阿托品组和生理盐水组。分别击头处死，取出回肠，剪取1.0-1.5cm段肠管，一端悬吊于麦氏浴槽中，另一端连接在拉力换能器上，换能器连接台式平衡仪，负重2g，平衡15-20分钟后，分别在浴槽中加入蚯蚓素、阿托品、生理盐水，观察3小时，记录3小时内豚回肠活动曲线。记录速度为4mm/min。
1、蚯蚓素组，蚯蚓素对豚鼠回肠活动曲线见图4
蚯蚓素溶液浓度为1×10-4g/l，由图4可看出豚鼠回肠收缩频率减慢，振幅降低，肌张力下降。
2、阿托品组，阿托品对鼠离体回肠的影响见图5
阿托品溶液浓度为1×10-4g/l，注入阿托品1小时后，豚鼠回肠收缩频率减慢，振幅降低，肌张力下降。
3、生理盐水组，生理盐水注入后豚鼠回肠活动曲线见图6
生理盐水注入前后，豚鼠回肠收缩频率、振幅、肌张力均无变化。
三、对大鼠血压、心电作用的影响
取大鼠30只，体重220-250克，雌雄均用。先取10只大鼠以戊巴比妥钠35mg/kg行腹腔注射麻醉，描记右侧颈总动脉血压及导程心电图，待血压稳定15分钟后，记录二次血压与心电(取其平均值)。然后肌肉注射112.5mg/kg蚯蚓素，每隔半小时记录一次血压和心电，连续3小时。结果比较；血压波动在26.66/23.99kpa之间，10只大鼠结果相似；导程心电频率、P波、DRS波、ST段和T波无明显差异。另取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次血压和心电，连续3小时。结果比较：血压波动在26.66/23.99之间；导程心电电频率、P波、CRS波、ST段和T波无明显差异。
再取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次血压的心电，连续3小时。结果比较：血压波动在26.66/23.99之间；导程心电频率、P波、ORS波、ST段和T波无明显差异。
四、对大鼠呼吸功能作用的影响
取大鼠30只，体重220-250克，雌雄均用，先取10只用戊巴经妥纳35mg/kg腹腔注射麻醉，在大鼠胸廓皮肤穿一缝线打结，另一端联于拉力换能器上，拉力换能器与台式平等记录仪相联，待呼吸平稳后，描记大鼠正常呼吸曲线。然后肌肉注射蚯蚓素112.5mg/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时，结果比较：9只大鼠呼吸频率无明显变化，1只大鼠于给药后至2小时内呼吸频率增快30％，深度变浅，2小时后逐渐恢复正常。
另取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射可刹米375mg/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时。结果比较：10只大鼠呼吸频率稍慢，呼吸度增加一倍，表现出呼吸兴奋现象。
再取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时。结果比较：呼吸频率和深度均无明显差异。
由一般药理实验可以看出：蚯蚓素对小鼠的中枢神经***和空肠无明显影响，对回肠则有减缓蠕动的作用。对大鼠的血压、心电频率、P波、QRS波、ST段和T波、呼吸的深度和频率无明显影响。
表一蚯蚓素对醋酸所致小鼠疼痛的影响(扭体法)
| 组别 | 剂量 | 动物数 | 扭体次数(X±SD) |
| 蚯蚓素组阿斯匹林组生理盐水组 | 0.09g/kg0.30g/kg10ml/kg | 101010 | 10.40±4.81*5.20±10.12**12.10±10.12 |
表二蚯蚓素对疼痛的影响(热板法)
| 组别 | 剂量 | 动物数 | 扭体次数(X±SD) |
| 蚯蚓素组阿斯匹林组生理盐水组 | 0.09g/kg0.30g/kg0.30g/kg | 101010 | 26.10±5.82*32.40±9.03**24.40±5.27 |
表三蚯蚓素对小鼠的镇静作用
| 组别 | 剂量 | 动物数 | 扭体次数(X±SD) |
| 蚯蚓素组养血安神片组生理盐水组 | 0.09g/kg3g/kg10ml/kg | 101010 | 48.40±19.03*64.60±9.69**45.70±23.19 |
与生理盐水组比较*P＞0.05 **P＜0.05
Claims (1)
1、从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法，包括蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于：
a、将日本杜拉蚓洗涤后，加入生理盐水进行破碎，得到匀浆液；
b、将匀浆液在4℃-8℃的低温下保持6-8小时，离心收集得粗提液；
c、在粗提液中加入0.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24-72小时或者用1＃或2#超滤膜超滤除盐得上清液；
d、将上清液调PH值至6.1-6.8，取4#或5#超滤膜采用平板超滤法对上清液进得超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离，收集超滤液得精制液；
c、将精制液经真空冷冻干燥或喷雾干燥得蚯蚓素。
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| CN1079902A (zh) * | 1993-05-18 | 1993-12-29 | 北京市心肺血管医疗研究中心 | 蚯蚓溶纤素的制备方法 |
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