CN1079902A - 蚯蚓溶纤素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蚯蚓溶纤素的制备方法。本方 法将赤子爱胜蚓经洗涤混合破碎后加蒸馏水提取，离 心收取提取液，对提取液进行透析、超滤或化学脱水 浓缩得到灭菌的浓缩液，再经冷冻干燥制得溶纤素粗 品。该粗品活性达8500mm2/mg，可直接入药。

Description

本发明涉及一种用蚯蚓提取物制备溶解纤维蛋白药物的方法。该方法制备的溶纤素可以有效地溶解血栓，并有明显的抗凝作用。
公知的溶栓药物，如链激酶和尿激酶，一般通过静脉给药，并有产生全身溶血的危险性，其制备方法也较为复杂，尿激酶的制备需要大量的男性新鲜尿液为原料，收集较为困难。中药中也有一些活血化瘀的药物，如红花、丹参、川芎等，但其溶栓效果不明显。市售的蛇毒溶栓剂不能口服，并有明显的毒性反应。
近年来，国内外有不少关于蚯蚓提取物溶栓作用的文献报道，主要是关于蚯蚓溶纤酶提取、溶栓作用的药理研究，对该类药物的开发应用报道不多。
日本和南朝鲜合作开发出用蚯蚓提取溶纤药物，取名“龙心”，并用于临床。在GB2116565A中公开了该药物的制备方法及部分药理、疗效。该方法主要是将活蚯蚓（或某部分组织）加溶剂打碎成悬浮液，在37℃左右的温度下，保温72-100小时，然后过滤或分离得到提取液，经超滤或真空蒸发成浓缩液，再进行干燥（真空或冷冻）制成粗制的溶纤粉，此粗品活性仅为142mm2/mg-350mm2/mg，无法入药，用该粗品再经过精制工艺来提高纯度和活性，精制过程需加入极性有机溶剂，然后经沉淀→溶解→透析→离子交换→凝胶过滤（或亲合层析）→冷冻干燥等工艺步骤得到具有较高活性的药物制品。该方法制得的粗品活性较低，不能入药，必须经过精制工艺，因此生产工艺复杂，生产周期长，工业化规模生产成本高。此外，用该方法制得的悬浮液在37℃下保温长达72-100小时，易变质。该方法制备的药物虽然进行了溶纤实验，但对溶栓实验未见实际数据。
日本专利平2-215724公开了一种真空干燥法制备蚯蚓干粉的方法，该方法将蚯蚓放入含有机或无机微酸度溶液中放养，待内腔中有菌的粪土充分排出后，粉碎得到悬浮液，再经冷冻干燥、真空干燥或负压脱水、真空回转干燥，得到蚯蚓干粉粗品，将该粗品在粉碎机下粉碎成细粉即成。
该方法工艺简单，但是真空干燥设备及工艺条件要求高，为了制得无菌的粗品，其冷冻干燥温度在-10℃--60℃，真空干燥温度-60℃-+80℃，真空度10-100mmHg以下，在此工艺条件下操作时间最长达100小时。即使采用真空回转干燥的方法，也要在10mmHg下保温操作50小时，才可得到干粉，真空回转干燥设备要求也较高。
本发明的目的：调整普通提取工艺，使制备的蚯蚓溶纤素粗品即具无毒、无菌、活性高的特性，可直接入药，从而提供一种工艺、设备简单，生产周期短，适于工业规模生产的蚯蚓溶纤素的制备方法。
本发明的要点：
本方法选用赤子爱胜蚓为原料，用清水洗涤去泥，再用新鲜蒸馏水洗涤3-5次，用组织捣碎机制成匀浆，加蒸馏水稀释提取，PH6.8-7.0，置4℃-6℃温度下放8-12小时，用离心方法收集上清液，沉渣再以同样方式提取3-4次，合并上清液，分装在透析袋中，透析24-72小时。这样可以去掉无机离子及小分子色素，提高纯度、降低毒性，然后用超滤或化学脱水方法脱水，得到浓缩液。其中适当选取超滤膜可以灭菌，如中孔纤维或5000-10000超滤膜等，也可以用聚乙二醇6000脱水。除菌后的浓缩液经过冷冻干燥，温度-20℃-60℃，时间8-16小时，即得蚯蚓溶纤素粗品，该粗品呈微黄色，活性达8500mm2/mg，可研磨后直接用药，也可用凝胶过滤等方法进一步精制再提纯。
本发明的效果：本方法将普通工艺进行调正，在粗品制备时即加入透析、超滤等工艺，使粗品的活性及纯度提高2-5倍，可直接入药，从而提供一种工艺设备简单，工艺条件易于掌握、适于规模生产的蚯蚓溶纤素的制备方法。该溶纤素粗品可制备口服、针剂、静滴等各种药剂，安全可靠、溶栓效果显著。
1、从下列系列实验证明其安全可靠性。
（1）溶纤素动物药理实验：
用本发明制备的溶纤素对家猫分组试验，观察溶纤素对心血管***及呼吸***的影响，测试指标为心电图、血压、心率、呼吸频率及呼吸深度。结果表明：经给药前后与对照组比较均无显著差异（P＞0.05）详见表1、表2。
用本发明制备的溶纤素对小白鼠神经***的影响进行试验，测试小鼠的自由活动数及对戊巴比妥阈下催眠剂量的影响，结果表明与对照组无显著差异（P＞0.05），即对小鼠中枢神经***无明著显影响。详见表3、表4。
（2）溶纤素长期毒性实验
用本发明制备的溶纤素对狗进行长期毒性实验，连续口服三个月，观察指标为：动物行为、外周血相、肝、肾功能和心电图等。结果表明：各种指标无异常，动物在整个给药期间纳食正常、活泼，体重平均增长3.5Kg，说明本药口服安全、无明显副作用。详见表5、表6。
（3）溶纤素的急性、亚急性毒性实验。
用本发明制备的溶纤素对小白鼠进行急性亚急性毒性试验。
a、对小白鼠静脉LD50的测定：得到溶纤素致死率数据（见表7）。由表7数据得到50%死亡点引出垂直线得LD50＝172mg/Kg。
b、口服溶纤素毒性：口服后观察7天，结果没有动物死亡，自主活动无改变，连续15天对外周血液红、白血球和血小板及肝、脾、肾功能与对照组动物比较无明显影响（见表8）。
c、大小鼠生长曲线表明，生长发育与对照组比较无明显影响。
附图1为大鼠生长曲线对比表。如图1所示：1为口服溶纤素500mg/kg的大鼠生长曲线，2为对照组生长曲线。
附图2为小鼠生长曲线对比表。如图2所示：3为口服溶纤素100mg/Kg小鼠生长曲线，4为口服200mg/Kg小鼠生长曲线，5为小鼠对照组生长曲线。
除上述实验数据外，本发明制备的溶纤素得到北京市卫生药检部门的许可证（见附件）。
（2）本方法制备的药物用于临床，效果明显，不但对体内纤维蛋白有溶解作用，溶栓作用更为明显，特别是对陈旧性血栓也显示出意想不到的疗效。病例如下：
a、患者女性，诊断为左髂股静脉血栓形成，用尿激酶5天（共100万单位）无效，停药15天后，改口服本发明制备的胶囊，1g/次，3次/日，口服14人，治愈出院。
b、患者为男性，61岁，因安装起博器引起左锁骨下静脉血栓形成，经尿激素治疗4天无效，停药一天，改口服本发明制备的溶纤素胶囊，每天8克，分三次服用，10天后改用每天4克，分4次服用，用11天后（共21天），血栓溶解出院。上两例病人前后均有造影根据。
c、二例眼科病人，均为男性，年龄分别为62岁、73岁，诊断为右眼眼底视网膜静脉血栓和左眼视网膜下方静栓血栓，入院时病眼视力分别为0.04和0.02，其中1例口服溶纤素1克，每天2克，用药12天，另一例先用川芎嗪和低分子右旋糖苷静脉滴无效，停药5天，改口服溶纤素胶囊，1g/次，2次/日，共服21天，二例病人治疗后视力达到0.2出院。
经过实际应用，本发明制备的溶纤素，有口服、静注、肌注等多种给药途径。可用于治疗脑血栓、脑栓塞、心肌梗塞、肢体劫脉、静脉、眼底动、静塞等各种塞性疾病。
下面结合实施例对本发明详细说明。
附图3是本发明的工艺流程图。
如图3所示：将鲜蚯蚓（赤子爱胜蚓）200克，用清水洗涤去泥，再用新鲜蒸馏水洗涤3-5次，加新鲜蒸馏水（PH6.8-7.0）100毫升混合，用组织捣碎机破碎成匀浆液，加蒸馏水稀释提取，置4℃冰箱8-12小时，用3000rpm×15′离心收集上清液，沉渣以同样方式提取3-4次，合并上清液，总体积为500ml，残渣弃之。将提取液分装在透析袋中，透析2-3天后，用中孔纤维超滤（或聚乙二醇6000）脱水，浓缩提取液约200毫升，冷干燥，温度-20℃--60℃。得蚯蚓溶纤素粗品，取出少量溶纤测其活性，剩余部分或碾细直接制药，或进一步精制提纯。
其中活性测定：取10ml粗品，加在2.5ml生理盐水中测得每10ul含0.04mg活性，面积大小为324-361mm2，即约8500mm2/mg活性。
实施例2：用例1制得的溶纤素200-500mg碾成细粉，装入胶囊，得到口服胶囊。
实施例3：用例1制得的溶纤素10-12mg，加注射水5ml，直接肌注。
实施例4：用例1制得的溶纤素按12-18mg/Kg加生理盐水静滴。
Figure 931050545_IMG3
表3 溶纤素对小鼠自主活动的影响
组    别 剂    量 动物数（只） 小鼠自主活动次数X±SD
对照组 25ml/kg 10 137±56
溶纤素 120mg/kg 10 139±32
溶纤素 240mg/kg 10 128±70
表4 溶纤素对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响
组    别 剂    量 动物数（只） 发生睡眠的动物数（只）
对照组 25ml/kg 10 6
溶纤素 120mg/kg 10 5
对照组 25ml/kg 10 8
溶纤素 240mg/kg 10 9
表5 血色素、红细胞、白细胞测定结果
动物编号 溶纤素剂量mg（万U）/kg 血色素（g） 白细胞（1×10/mm） 红细胞（1×10/mm）
给药前 给药后 给药前 给药后 给药前 给药后
12 对照 12.313.0 11.013.0 1.91.3 1.41.4 756806 739724
34 500(15.63) 11.012.0 12.013.0 1.41.1 1.31.1 665754 733630
56 800(25.00) 12.012.0 12.011.0 1.21.3 1.11.2 883748 769694
表6 给药前后SGPT、BUN测定结果
编号 龙宝  剂量mg（万U）/kg SGPT U/L BUN   MG%
给药前 给药后 给药前 给药后
12 对照 31.044.0 42.734.8 13.214.0 12.813.7
34 500(15.63) 33.332.9 40.535.7 11.414.5 10.813.7
56 800(25.00) 35.731.0 40.532.8 15.311.4 13.812.0
表7 蚯蚓溶纤素致死量数据
组  别 剂    量mg（万U）/kg 死亡率 机率
123456 124.6(3.89)150.0(4.69)180.6(5.64)217.4(6.79)315.2(9.85)379.5(11.86) 2/8(25%)4/8(50%)5/8(62.5%)6/9(66.7%)7/9(77.8%)9/9(100%) 4.325.005.305.435.78
Figure 931050545_IMG4

Claims (3)

1、一种蚯蚓溶纤素的制备方法，包括将活蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于：将赤子爱胜蚓经洗涤后混合破碎，得到匀浆液，加入蒸馏水提取，PH值为6.8-7.0，置于4℃-6℃下保温8-12小时，离心收集上清液，将上清液透析24-72小时后，进行超滤或化学脱水浓缩灭菌，得到的浓缩液冷冻干燥8-16小时制得溶纤素。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超滤膜采用中孔纤维或5000-10000的超滤膜。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化学脱水用聚乙二醇6000脱水
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