CN106177176B - 一种保健品组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强人体免疫力的保健品组合物，该组合物由以下重量份的原料制成：黄芪450～550重量份、山茱萸300～400重量份、枸杞子300～400重量份、绞股蓝150～250重量份和人参100～200重量份。该组合物中黄芪、山茱萸、枸杞子、绞股蓝和人参五味合用，阴阳气血双补，益精生血，滋补肝肾，对增强免疫力具有确切的效果。本发明还公开了该组合物的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种增强人体免疫力的保健品组合物及其制备方法和用途，属于保健品领域。
背景技术
人体的免疫功能是一道防线，护卫着人体健康；又是一种祛病能力，在人患病之后可促进康复，这就成为人体强身抗病的根本所在。然而，在日常生活中，有许多因素使人体免疫力下降或出现免疫紊乱。比如，膳食不合理，蛋白质、维生素、微量元素摄入不足；生活不规律，睡眠不足；缺少运动锻炼，对环境的适应能力较差；精神紧张，过度劳累；使用激素、抗生素等药物的不良反应，抑制了免疫力；患急性病时暂时降低了免疫力，患慢性病时则长期处于免疫力低下状态等等。若长时间免疫力低下，人体就会出现健康和疾病的中间状态－亚健康状态。而亚健康状态是不断变化发展的，如不能及时得到改善，很有可能向疾病状态转化。所以，提高人体自身免疫功能，是远离亚健康，走向健康的根本方法。我国相关的调查资料显示，有60％以上的人群处于亚健康状况，仅仅依靠药物对症治疗已经很难恢复到正常健康状态。
疲劳是一种提示机体已经超过正常负荷的信号。疲劳大多由于工作、学习任务繁重，生活节奏紧张所致。疲劳包括生理和心理两方面。生理疲劳主要表现为肌肉酸痛、全身疲乏等；而心理疲劳主要表现为心情烦躁、注意力不集中、思维迟钝等。20世纪80年代中期，医学界提出了“慢性疲劳综合症”这一概念，指出疲劳也是一种病。慢性疲劳综合症是指疲劳引起的一种长期疲乏无力状态，不能通过卧床休息而缓解的全身不适、精神萎靡、手足酸软、记忆力不集中、工作效率低等一系列症候群而言。近年来，由于疲劳诱发突发性疾病，导致已有疾病病情加重，甚至威胁到生命的例子越来越多，人们对于疲劳危害的认识也愈加深刻。现代医学通过实验表明，“疲劳”不可能治愈或根除，因为它不是疾病而是一种不健康的身心状态，但如果在“疲劳”未发展成“慢性疲劳综合症”之前就采取有效的干预措施，并改善生活习惯，便可以有效的缓解疲劳并消除“慢性疲劳综合症”的威胁。
随着现代社会生活节奏的加快，人们不仅要承受学习、工作、生活等各方面的多重压力，而且由于环境污染日益严重，许多人处于“亚健康”状态，主要表现为机体免疫力下降，易感疲劳等。医学研究表明，人类99％的疾病都与免疫***有关，因此，要想预防疾病的发生，保持健康的体魄，提高免疫力是关键，同时经常处于疲劳状态下的人群机体免疫***功能会不断减退，如何减轻和消除疲劳也成为提高免疫力的重要问题。由于免疫力低下、易疲劳状态的各类人群数量仍在不断增加，针对性较强的增强人体免疫力及缓解疲劳的保健品的市场需求在不断增大。然而，安全、有效、低成本、适于长期服用的增强人体免疫力及缓解疲劳的保健品仍然缺乏。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种能有效增强人体免疫力的保健品组合物；
本发明的目的之二在于提供该保健品组合物的制备方法；
本发明的目的之三在于提供以该保健品组合物为活性成分的制剂；
本发明的目的之四在于提供该保健品组合物在制备增强人体免疫力的保健品中的用途。
为实现上述目的之一，本发明提供了一种增强人体免疫力的保健品组合物，所述组合物的原料包括：黄芪、山茱萸、枸杞子、绞股蓝和人参。
其中，黄芪，为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。味甘，性温。归肺、脾经，具有补气固表等功效。始载于《神农本草经》，是祖国医学中最常用的“扶正固本、补中益气”药之一。
山茱萸，为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。味酸、涩，性微温。归肝、肾经。山茱萸具有补益肝肾，涩精固脱之功效，临床用于治疗眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳萎遗精等症。
枸杞子，为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实。性味甘平，归肝，肾经。作为传统的药食两源物质，具有“滋补肝肾，益精明目”之功效。《本草备要》记载：枸杞润肝清肝，滋肾益气，生精助阳，补虚劳，强筋骨，祛风明目，利大小便。
绞股蓝，为葫芦科植物绞股蓝的干燥全草。味苦，性寒，归肺、脾、肾经。具有益气补脾的功效。主要含皂苷成分、氨基酸类、黄酮类化合物、微量元素及多糖类等。
人参，为五加科植物人参的干燥根及根茎。甘、微苦，平。归脾、肺、心经。人参是我国特产珍贵药材之一,古代医药学书籍中始见于《神农本草经》“补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸”，列为上品。
上述组合物的配方中枸杞子善补肝肾精血、心肺脾阴液，人参善补元气，有补阴生津作用。二药一补阴一补阳，一补精血一补元气，阴阳气血双补，五脏六腑皆益，相使互补，补气培元，益精生血。山茱萸甘酸温润，主入肝肾，既能益精，又可助阳，长于固涩下焦，为肝肾亏虚、下元不固之要药，配以人参补气养阴滋补肝肾；绞股蓝和枸杞子配伍益气补脾，滋补肝肾；人参和黄芪配伍，一则温煦全身，鼓舞气血，激发机体生命活力；二则补气，气旺则血生，气旺则血行，既可增强体质，又可扶正以祛邪。五味合用，扶正固本，补气健脾，滋补肝肾，达到增强免疫力及提高易疲劳者生活质量的目的。
作为优选，该组合物的原料的重量份为：黄芪450～550重量份、山茱萸300～400重量份、枸杞子300～400重量份、绞股蓝150～250重量份和人参100～200重量份。
作为更优的选择，该组合物的原料的重量份为：黄芪480～520重量份、山茱萸320～370重量份、枸杞子320～370重量份、绞股蓝180～220重量份和人参150～180重量份。
在本发明的一些具体实施例中，该组合物的原料的重量份为：黄芪500重量份、山茱萸350重量份、枸杞子350重量份、绞股蓝200重量份和人参170重量份；
或者黄芪480重量份、山茱萸370重量份、枸杞子320重量份、绞股蓝180重量份和人参180重量份。
作为优选，该组合物中黄芪、山茱萸、枸杞子、绞股蓝和50～90重量份的人参制备为提取物，余量人参制备为细粉；更进一步地，优选将70或80重量份的人参制备为提取物，余量人参制备为细粉。
本发明所述的余量人参是指，除用于制备人参提取物外剩余的人参，余量人参与用于制备提取物的人参之和为配方的人参总量。人参为方中名贵药材，制备成有机溶剂提取物可增加组合物中有效成分，如人参皂苷、糖类、氨基酸类等的含量；同时，人参的粉性较好，人参部分打粉入药可兼作赋型剂，避免组合物吸潮、结块，对成型工艺有利，并可减少大量辅料的使用；而且，如果将人参全部制备为有机溶剂提取物会损失人参中不溶于有机溶剂的组份，造成浪费，而这些组分能够激增脾细胞，并产生活化吞噬细胞，对增强人体免疫力，特别是增强癌症患者的免疫力有极大益处。
作为优选，黄芪、枸杞子提取物为水煎提取物；山茱萸、绞股蓝和人参的提取物为有机溶剂提取物；所述有机溶剂包括能有效提取并符合安全要求的所有有机溶剂，如乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯和丙酮等，这些溶剂可以单独使用，也可以组合使用；较优地选为乙醇。
在本发明的一个具体实施例中，黄芪、山茱萸、枸杞子、绞股蓝和人参各占50、35、35、20、17重量份，且人参7重量份用于制备醇提取物，余量人参制备成细粉，使所含溶于有机溶剂和溶于水的有效成分达到最佳的比例，使等量的人参发挥最大的效用，相较于只有提取物或只有细粉的产品，保健效果最优化。
为实现上述目的之二，本发明还提供了该组合物的制备方法，包括以下步骤：
A、将山茱萸、绞股蓝、人参用有机溶剂回流提取适宜时间，多次提取，提取液滤过，合并滤液，浓缩滤液回收有机溶液，得到清膏，备用；
B、将黄芪、枸杞子加水煎煮，煎煮多次，煎液滤过，合并滤液，滤液减压浓缩得到清膏，备用；
C、将步骤A余量的人参粉碎，过筛，得细粉，备用；
D、合并A、B步骤制得的两种清膏，减压干燥，所得干膏粉碎成细粉，过筛，再与步骤C制得的细粉混匀，即得。
本领域的技术人员应当知道，步骤C是制备本发明一些优选的组合物时才需要的，是可选择的步骤，这些组合物具体是指包括人参细粉的组合物。当制备的组合物不包括人参细粉时，步骤C是可以省略的，步骤D也只需将步骤A和B的清膏合并，减压干燥，所得干膏粉碎成细粉，过筛，即可。
作为优选，步骤A用于制备提取物的人参为50～90重量份；更优地，步骤A用于制备提取物的人参为70或80重量份。
作为优选，步骤A的有机溶剂可以选择乙醇、***、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等中的一种或多种，较优地选择为乙醇；有机溶剂可以选择适宜的使用量，优选为5至10倍量，在本发明的一些具体实施例中选择6、7或者8倍量；乙醇浓度优选60％～80％；提取的时间根据不同溶剂的溶解能力进行选择，优选为0.5至5小时，较优地为1至2小时；提取的次数与浸膏的收率相关，也会影响浸膏有效成分和杂质的含量，优选的提取次数为1至5次，在本发明的一些具体实施例中，提取次数为1至3次。
作为优选，步骤B煎煮时水的用量为黄芪、枸杞子的6～8倍量，优选煎煮时间为1～2小时，优选煎煮次数为1～3次。
作为优选，步骤C所述过筛的目数为100目，步骤D所述过筛的目数为80目。
为实现上述目的之三，本发明还提供了以该保健品组合物为活性成分的制剂。可按常规制剂工艺加入常规制剂辅料制备成常用的口服剂型，其中，所述剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂；优选为胶囊剂。
本发明所述常规制剂辅料，包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。
为实现上述目的之四，本发明还提供了该保健品组合物在制备增强人体免疫力和缓解疲劳的保健品中的用途。
本发明的有益效果在于：黄芪、山茱萸、枸杞子、绞股蓝和人参五味合用，阴阳气血双补，益精生血，滋补肝肾，鼓舞气血，激发机体生命活力增强体质，扶正祛邪，增强免疫力及提高易疲劳者生活质量，对增强人体免疫力具有较好的效果，尤其是采用优选的重量份组份得到的组合物效果更加突出；将部分人参制备为提取物，余量人参制备为细粉，得到的组合物兼具有易成型、节约辅料、减少浪费和有效成分充足的优点，能降低工业生产的成本。
具体实施方式
以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。
实施例1
1.1粉碎工艺考察
方法：称取人参净药材3份，各100g,于60℃低温干燥后，粉碎成细粉，过100目筛，称量，计算出粉率，结果见表1。
表1药材粉碎工艺考察结果
试验结果表明，人参粉碎的平均出粉率为96.42％。
1.2乙醇提取工艺考察
(1)试验目的及考核指标的确定
通过多因素的正交试验，优选乙醇提取工艺的各项参数。以醇提取干膏得率及总皂苷含量作为考核指标，以选择最佳的工艺参数。
(2)正交试验的设计
①因素与水平的选取及正交表的选择：影响醇提取的因素有乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)和提取次数(D)，在此4因素的基础上每个因素设计3个水平，因素与水平见表2。为了***的、全面的、具体的考察醇提取的工艺参数，选择L9(34)正交方式进行设计研究，L9(34)正交表见表3。
表2醇提试验因素水平表
②试验方法与结果：称取山茱萸35g、绞股蓝20g、人参7g，共计62g，平行9份，随机取样编为1-9个试验号。按正交表L9(34)中每个试验号要求进行试验，合并提取液，滤过，滤液供计算干膏得率、测定总皂苷含量用。
表3醇提L9(34)正交表及正交试验结果
(备注：K，各因素水平对指标的总影响；k，各因素水平的平均影响；R(极差)＝kmax-kmin，代表因素的主次顺序)
③分析与结论：根据表3的数据进行分析，醇提干膏得率方差分析结果见表4，醇提总皂苷含量方差分析结果见表5。
表4醇提干膏得率方差分析结果
(F0.05(2.2)＝19.0，F0.01(2.2)＝99.0)
表5醇提总皂苷含量方差分析结果
(F0.05(2.2)＝19.0，F0.01(2.2)＝99.0)
由以上数据分析可知，以干膏得率为考察指标时，A1>A2>A3，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1，D因素影响最大，C、A因素次之，B因素最小。结合表4干膏得率方差分析，各因素作用主次为D>C>A>B，其中D因素有显著性差异(P<0.05)，A、B、C因素均无显著性差异(P>0.05)，因此醇提取工艺应为A1B3C3D3。
以总皂苷含量为考察指标时，A2>A1>A3，B3>B2>B1，C2>C3>C1，D2>D3>D1，D因素影响最大，A、C因素次之，B因素最小。结合表5总皂苷含量方差分析，各因素作用主次为D>A>C>B，其中D因素有显著性差异(P<0.05)，A、B、C因素均无显著性差异(P>0.05)，因此醇提取工艺应为A2B3C2D2。
综合上述分析，考虑到本工艺的目的旨在提取出药材中的有效成分，同时从缩小制剂体积，减小服用量，降低成本，节约能源等因素出发，故醇提取最佳工艺优选为A2B3C2D2。，即加入8倍量70％乙醇回流提取2次，每次提取1.5小时。1.3水煎提取工艺考察
(1)试验目的及考核指标的确定
通过多因素的正交试验，优选水提取工艺的各项参数。以水提干膏得率及粗多糖量作为考核指标，以选择最佳的工艺参数。
(2)正交试验的设计
①因素与水平的选取及正交表的选择：影响水煎煮提取的主要因素有煎煮次数(E)、加水量(F)和煎煮时间(G)，在此因素的基础上，每个因素设计3个水平，因素与水平见表6。为了更具体的考察水提取的工艺参数，我们选择L9(34)正交方式进行设计研究，L9(34)正交试验表见表7。
表6水提试验因素水平表
②试验方法与结果：称取黄芪50g、枸杞子35g，共计85g,平行9份,随机取样编为1～9个试验号。按表7中每个试验号要求进行试验，煎液滤过，合并滤液，滤液浓缩并定容至一定体积，供以下试验(干膏得率、粗多糖含量测定)用。
表7水提L9(34)正交表及正交试验结果
(备注：K，各因素水平对指标的总影响；k，各因素水平的平均影响；R(极差)
＝kmax-kmin，代表因素的主次顺序)
③分析与结论：根据表7的数据进行分析，水提干膏得率及粗多糖含量方差分析结果见表8。
表8水提干膏得率及粗多糖含量方差分析
(F0.05(2.2)＝19.0，F0.01(2.2)＝99.0)
由表7的K值及R值直观分析，以干膏得率为考察指标时，A2>A3>A1，B3>B1>B2，C3>C2>C1，且根据表8可知C因素影响最大，A、B因素次之，各因素作用主次为C>A>B，其中C因素有显著性差异，A、B因素均无显著性差异，因此水提工艺应为A2B3C3。
以粗多糖含量为考察指标时,A2>A3>A1,B3>B2>B1,C2>C3>C1,且A、B、C各因素影响依次为C>A>B，其中C因素具影响最显著，有显著性差异；A、B因素影响较小，无显著性差异，直观分析最佳工艺为A2B3C2。
从上述指标的结果分析，应综合考虑本工艺的目的旨在提取出药材中的有效成分、缩小制剂的体积、减小服用量，同时从降低成本，节约能源及提高生产效率出发，确定本工艺的水煎部分最优工艺条件为A2B3C2，即称取药材，加水煎煮2次，每次加入8倍量水，各煎煮2小时。
组合物制备实施例
表9配方
实施例2
根据表9中的第1组配方。
(1)将山茱萸、绞股蓝、人参加8倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，提取液滤过，合并滤液(药渣弃)，滤液回收乙醇(-0.065～-0.075Mpa，65℃)，并浓缩至相对密度为1.30-1.35(60℃测)的清膏，备用。
(2)取黄芪、枸杞子加水煎煮2次，每次加8倍量水，煎煮2小时，煎液滤过，合并滤液(药渣弃)，滤液减压浓缩(-0.065～-0.075Mpa，75℃)至相对密度为1.30-1.35(60℃测)的清膏，备用。
(3)合并上述两种清膏，减压干燥(-0.085Mpa，65℃)，所得干膏粉碎成细粉，过80目筛，得组合物。
实施例3～5
分别根据表9的第2～4组配方按实施例2方法制备组合物。
实施例6
原料组分见表9中的第1组配方，按以下步骤制备：
(1)将山茱萸、绞股蓝、人参(7g)加8倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，提取液滤过，合并滤液(药渣弃)，滤液回收乙醇(-0.065～-0.075Mpa，65℃)，并浓缩至相对密度为1.30-1.35(60℃测)的清膏，备用。
(2)取余量人参(10g)，干燥(60℃)后粉碎，过100目筛得细粉，用5kGy剂量的60CO辐照灭菌，备用。
(3)取黄芪、枸杞子加水煎煮2次，每次加8倍量水，煎煮2小时，煎液滤过，合并滤液(药渣弃)，滤液减压浓缩(-0.065～-0.075Mpa，75℃)至相对密度为1.30-1.35(60℃测)的清膏，备用。
(4)合并上述步骤(1)和(3)的两种清膏，减压干燥(-0.085Mpa，65℃)，所得干膏粉碎成细粉，过80目筛，与步骤(2)的人参细粉混匀，得组合物。
实施例7
原料组分见表9中的第1组配方，12g人参制备提取物，余量人参用于制备细粉，按实施例6方法制备组合物。
实施例8
根据表9的第2组配方，8g人参用于乙醇提取，余量人参用于制备细粉，按实施例6方法制备组合物。
实施例9
根据表9的第3组配方，5g人参用于乙醇提取，余量人参用于制备细粉，按实施例6方法制备组合物。
实施例10
根据表9的第4组配方，9g人参用于乙醇提取，余量人参用于制备细粉，按实施例6方法制备组合物。
制剂制备实施例
实施例11
将实施例2的组合物用85％乙醇制软材，16目筛制粒，60℃以下干燥，14目筛整粒，装入0号胶囊，抛光，检验，包装，即得保健品胶囊剂，每粒含组合物约0.34g。
实施例12-18
取实施例3～10的组合物，用同于实施例11的方法制备。
实施例19增强免疫力功能试验
1.1样品：根据实施例6和实施例11的方法制备的批号为20070902的样品1进行毒理学试验，根据实施例2、7和实施例11的方法制备的样品2和样品3进行功能学试验。样品置阴凉干爽通风处保存。人口服推荐用量为每人(成人)每日2次，每次3粒，成人体重按60kg计算，折合给药剂量为34mg/kg。取胶囊内容物进行试验。
1.2实验动物与分组：清洁级健康昆明种雄性小鼠，体重为18—22克，由广西医科大学医学实验动物中心繁殖，实验动物质量合格证号：N0.0000902。每个剂量组10只小鼠。免疫I组，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；免疫II组，进行迟发型***反应实验；免疫III组，进行脏/体比值测定，血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；免疫Ⅳ～Ⅵ组，分别进行碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定。
1.3实验环境条件：实验动物室温度：22—25℃，相对湿度：55—70％。实验动物使用许可证号：SYXK桂2007-0003。
1.4剂量选择与受试物给予方式：根据人口服推荐用量，设样品低、中、高剂量组分别为170、340、680mg/kg(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)，设一个阴性对照组，每组10只动物。分别称取样品850、1700、3400g，各加蒸馏水至100mL，混匀、配成8.5、17.0、34.0mg/mL浓度的混悬液，按0.2mL/10g的体积给予相应剂量组动物灌胃，阴性对照组予以等体积的蒸馏水，每天灌胃一次，连续灌胃30天。
1.5主要仪器与试剂：动物台秤、电子分析天平、离心机、洁净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、显微镜、半自动生化仪、酶标仪等。
无菌手术器械、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、载玻片、试管、200目筛网、计时器血色素吸管等。
绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank's液(pH 7.2—7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、ConA、1％冰醋酸、1mol/L的HCL溶液、异丙醇、MTT、DNFB、PBS缓冲液(pH7.2—7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、YAC-1细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液、1％的NP40、印度墨汁、0.l％的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Gimsa染液等。
1.6实验方法
1.6.1脏器/体重比值测定：称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。
1.6.2ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)：
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank's液洗2次，每次离心l0min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3*106个/mL.。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加入75uL ConA液(相当于7.5uL/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃二氧化碳孵箱中培养72h。培养结束前4h轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50uL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
1.6.3二硝基氟苯诱导的小鼠DTH实验(耳肿胀法)：
实验结束前5天将小鼠腹部皮肤脱毛约3cm×3cm范围，用50uL DNFB溶液均匀涂抹致敏，5天后将10uL DNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下8mm直径的耳片、称重，以左右耳重量之差值表示DTH的程度。
1.6.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心l0min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。将免疫后5天的小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用Hank's液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在5mL Hank's液中。将表层培养基(lg琼脂糖加双蒸水至l00mL)加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量pH7.2—74、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加用SA液配制的10％SRBC50uL(v/v)、25uL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待凝固后，将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。
1.6.5血清溶血素的测定(血凝法)
取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心l0min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置约1h，2000r/min离心l0min，分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔l00uL，再加入100u L 0.5％(V，v)的SRBC悬液，均匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。按下式计算抗体积数：
抗体积数＝(S1+2S2+3S3…～nSn。)
式中1、2、3……n为对倍稀释的指数，s为凝集程度的级别。
1.6.6小鼠碳廓清实验
经尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每l0g体重注射0.lmL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、l0min，分别从眼内眦静脉丛取血20u L，加入到2mL0.l％Na2CO3溶液中，摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照，用半自动生化仪以600nm波长测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝、脾脏，称重。按下式计算吞噬指数a。
a＝K1/3×体重/(肝重+脾重)式中K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
1.6.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞实验(半体内法)
给小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)的压积鸡红细胞悬液，每鼠1mL，间隔10min，颈椎脱臼处死小鼠，正中剪开腹壁皮肤，腹腔注入2mL生理盐水，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵片，取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，用甲醇：丙酮(1:1)溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗、晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数，计数的巨噬细胞数
1.7实验数据统计：应用SPSS统计软件进行方差分析统计处理。
1.8结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能三方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
2.结果
2.1样品1对小鼠体重的影响
表10样品1增强免疫力功能试验小鼠体重
由上表可见，实验初期、中期和末期样品1各剂量组的小鼠体重及实验期间小鼠的体重增长与阴性对照组比较，差异无显著性(P>0.05)，表面该样品对小鼠的体重增长无明显影响。
2.2样品1对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
表11样品1增强免疫力功能试验小鼠的免疫器官脏器/体重比值
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的样品1 30天，小鼠的胸腺/体重及脾脏/体重比值与阴性对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)，表明该样品1对小鼠的免疫器官重量无明显影响。
2.3样品对小鼠的细胞免疫的影响
2.3.1样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响
表12样品对小鼠脾淋巴细胞转化实验结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
从上表可以看出，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，3个样品各剂量组的淋巴细胞转化能力均高于阴性对照组，且除了样品3的中、低剂量组外差异均具有显著性(P<0.05)，表明具有促进小鼠的淋巴细胞增殖、转化能力的作用，特别是样品1各剂量组差异具有非常显著性。
2.3.2样品对小鼠迟发型***反应(DTH)的影响
表13样品对小鼠迟发型***反应(DTH)实验结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
由上表可见，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，各剂量组的左右耳片重量差值均高于阴性对照组，其中样品1、2、3的高、中剂量组与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05)，且样品1高剂量组差异非常显著(P<0.01)，表明样品1、2和3具有促进小鼠的迟发型***反应的作用。
2.4样品对小鼠的体液免疫的影响
2.4.1样品对小鼠的抗体生成细胞数的影响
表14样品对小鼠的抗体生成细胞检测实验结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
从上表可见，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，各剂量组的抗体生成细胞数明显高于阴性对照组，且各剂量组与阴性对照组比较差异均具有显著性(P<0.05)，其中，样品1、2各剂量组差异均非常显著(P<0.01)，3个样品都具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。
2.4.2样品对小鼠血清溶血素的影响
表15小鼠溶血素测定结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
从上表可见，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，各剂量组的抗体积数均高于阴性对照组，且各剂量组与阴性对照组比较差异均具有显著性(P<0.05)，表明3个样品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。
2.5样品对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
2.5.1样品对小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清的影响
表16样品对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清实验结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
从上表可见，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，各剂量组的吞噬指数均高于阴性性对照组，但只有样品1、2的中、高剂量组与对照组比较差异具有显著性(P<0.05)，表明样品1、2具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。
2.5.2样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
表17样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果
注：*与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01
从上表可见，经口给予小鼠不同剂量的3个样品30天，仅样品1的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数显著高于阴性对照组，且各剂量组的吞噬率和吞噬指数与阴性对照组比较差异具有非常显著性(P<0.01)，表明样品1对小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有明显的促进作用。
3.小结
经口给予小鼠170、340、680mg/kg(相当于人体推荐用量5、10、20倍)剂量的3个样品30天，能促进小鼠的脾淋巴细胞增殖、转化作用，促进小鼠的抗体生成细胞增殖，提高小鼠的血清溶血素水平，促进小鼠的迟发型***反应，样品1促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓请功能和腹腔巨噬细胞吞噬功能，对小鼠的体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值无明显影响，3个样品均具有较好的增强免疫力的功能，特别是样品3效果最为显著。
Claims (8)
1.一种增强人体免疫力的保健品组合物，所述组合物由以下重量份的原料制成：黄芪500重量份、山茱萸350重量份、枸杞子350重量份、绞股蓝200重量份和人参170重量份，将所述山茱萸、绞股蓝和70重量份的人参制备为乙醇提取物，余量人参制备为细粉，将黄芪、枸杞子制备为水煎提取物。
2.一种权利要求1所述的增强人体免疫力的保健品组合物的制备方法，包括以下步骤：
A、将山茱萸、绞股蓝、人参用乙醇回流提取适宜时间，提取液滤过，合并滤液，减压浓缩滤液回收有机溶液，得到清膏，备用；
B、将黄芪、枸杞子加水煎煮，煎液滤过，合并滤液，滤液减压浓缩得到清膏，备用；
C：将步骤A余量的人参粉碎，过筛，得细粉，备用；
D、合并A、B步骤制得的两种清膏，减压干燥，所得干膏粉碎成细粉，过筛，再与步骤C制得的细粉混匀，即得。
3.如权利要求2所述的增强人体免疫力的保健品组合物的制备方法，其特征在于：
步骤A所述乙醇用量为5～10倍量，乙醇浓度为60％～80％；所述提取次数为1～5次；
步骤B所述加水煎煮，水的用量为6～8倍量，煎煮时间为1～2小时，煎煮次数为1～3次；
步骤C所述过筛为100目筛；
步骤D所述过筛为80目筛。
4.如权利要求3所述的增强人体免疫力的保健品组合物的制备方法，其特征在于，所述乙醇的用量为6～8倍量。
5.如权利要求3所述的增强人体免疫力的保健品组合物的制备方法，其特征在于，所述提取次数为1～3次。
6.一种活性成分为权利要求1所述的保健品组合物的制剂，其特征在于，所述制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂为胶囊剂。
8.权利要求1所述的组合物在制备增强人体免疫力的保健品中的用途。
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