CN106171529A

CN106171529A - 高含量虫草素的虫草培养方法及其使用的培养基

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Publication number: CN106171529A
Application number: CN201610635109.1A
Authority: CN
Inventors: 吴剑翔
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明公开了一种高含量虫草素的虫草培养方法及其使用的培养基，方法的步骤中含有：(a)制作培养基；其中，所述培养基含有的组分及组分质量百分比如下：鸡蛋粉：75％～100％；麦芽糊精：0％～20％；腺苷：0％～5％；所述培养基的组分之和总计100％；(b)在培养基上接种蛹虫草菌种；(c)然后在一定环境条件下培养后，采收得到所需的蛹虫草。本培养方法提高了蛹虫草的生产效率，使生产周期缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制，工厂化生产的成本会很低，培养的蛹虫草中的虫草素含量可达1.5‑4.0％。

Description

高含量虫草素的虫草培养方法及其使用的培养基

技术领域

本发明涉及一种高含量虫草素的虫草培养方法及其使用的培养基。

背景技术

在1950年，德国的Cunningham et al观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，定名虫草素，并在Nature上发表了论文。

经大量研究，虫草素是由腺苷和有着碳支链的脱氧戊糖组成的一种核苷酸，因此被称为3′-脱氧腺苷(3′-deoxyade-nosine,3′-dA)，是从真菌中分离出来的第一个脱氧核苷类抗生素。虫草素的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量为251D，碱性，针状或片状结晶。熔点为230℃～231℃，紫外光最大吸收波长为259nm，虫草素能溶于生理盐水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、***和氯仿，因此多数实验采用无菌盐水或PBS液作为溶剂。虫草素在体内大部分经嘌呤核苷酸代谢途径，在腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)的作用下快速脱氨基而成为无生物活性的代谢产物3′-脱氧次黄嘌呤核苷，其余小部分则被磷酸化为三磷酸虫草素(可能为虫草素具有生物活性的成分)。研究虫草素对人肿瘤细胞抑制作用时发现，虫草素在用于培养肿瘤细胞的含100mL/L小牛血清中的半衰期是3h。

虫草素具有多种生物活性，如在分子水平上对DNA及RNA合成、hnRNA和mRNA转录后修饰、腺苷酸环化酶活化以及特异性蛋白质合成等过程具有抑制作用；在细胞水平上能促进细胞分化、增强巨噬细胞系的趋化性；在整体水平上具有抗真菌、抗疟疾、抗衰老、免疫调节、抗病毒、抑制血管内皮平滑肌细胞增生、抗缺血再罐注损伤、抗血小板聚集及抗肿瘤等药理作用。多年来大部分研究将其作为DNA延长链的终止剂。虫草素分子式为虫草素具有抗肿痛、抗菌、抗病毒，免疫调节、清除自由基等多种药理作用。

经过几十年的世界各国科技工作者研究认为，虫草素是虫草中特有的活性成份，也是虫草的标志性成分。虫草的功效取决于虫草素含量的多少，和虫草的形状、大小、颜色、产地没有一点关系。

野生虫草资源稀缺，价格昂贵，含量甚微，很难成为获得虫草素的主要原料。人工合成虫草素虽然在我国有报道，但迄今还难以实现产业化。因此，通过生物工程的方法，从人工培育的虫草中提取虫草素，是实现虫草素作为治疗药物产业化生产的最可行的途径。

目前国内外虽然有很多家企业能生产蛹虫草，由于工厂化大规模培育等关键技术尚未突破，其产品的虫草素含量很低，而获得的虫草素成本很高，所以造成虫草素售价极高，每克达2-4万元人民币，使虫草素难以为普通老百姓所用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高含量虫草素的虫草培养方法，它提高了蛹虫草的生产效率，使生产周期缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制，工厂化生产的成本会很低，培养的蛹虫草中的虫草素可达1.5-4.0％。

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高含量虫草素的虫草培养方法，它提高了蛹虫草的生产效率，使生产周期缩短，并且发酵生产设备简单，生产条件易于控制，工厂化生产的成本会很低，培养的蛹虫草中的虫草素可达1.5-4.0％。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案是：一种高含量虫草素的虫草培养方法，该方法的步骤中含有：

(a)制作培养基；其中，所述培养基含有的组分及组分质量百分比如下：鸡蛋粉：75％～100％；麦芽糊精：0％～20％；腺苷：0％～5％；所述培养基的组分之和总计100％；

(b)在培养基上接种蛹虫草菌种；

(c)然后在一定环境条件下培养后，采收得到所需的高含量虫草素的蛹虫草。

进一步，在所述的步骤(a)中，培养基的制作步骤如下：

(a1)按照各组分及各组分质量百分比进行配料，再加入水混合均匀，然后蒸煮成块状原料；

(a2)将块状原料粉碎成颗粒状原料；

(a3)采用瓶将颗粒状原料进行分装；

(a4)然后灭菌和冷却处理，得到需要的培养基；

进一步，在所述的步骤(a1)中，所述干料与水的质量比可以为1:1.5。

进一步，在所述的步骤(a1)中，蒸煮的温度为100℃～105℃。

进一步，在所述的步骤(c)中，先进行黑暗培养再进行见光培养。

进一步，所述黑暗培养的温度控制在22℃～23℃。

进一步，所述见光培养中先进行低光照培养再进行高光照培养，低光照培养的环境条件为：温度控制在22℃-25℃，光线每天照射10小时-12小时，光照的光强为1000-3000lux。

进一步，高光照培养的环境条件为：温度控制在25℃-27℃，光照的光强为5000-7000lux，24小时照光。

进一步，见光培养的光源为黄色光。

本发明还提供了一种高含量虫草素的虫草培养方法中使用的培养基，它含有的组分及各组分质量百分比如下：鸡蛋粉：75％～100％；麦芽糊精：0％～20％；腺苷：0％～5％；所述培养基的组分之和总计100％。

采用了上述技术方案后，本发明提供的固体式培养基进行培育蛹虫草，不仅生产效率大大提高，生产周期缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制，工厂化生产的成本会很低，对虫草素的进一步研究和开发利用具有重要意义。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。

一种高含量虫草素的虫草培养方法，该方法的步骤中含有：

(a)制作培养基；

(b)在培养基上接种蛹虫草菌种；接种在无菌的条件下进行；此菌种是自己选出的虫草素高的蛹虫草菌种；

(c)然后在一定环境条件下培养后，采收得到所需的蛹虫草；

在所述的步骤(a)中，培养基的制作步骤如下：

(a1)按照各组分及各组分质量百分比进行配料得到干料，在干料中加入水混合均匀，然后蒸煮成块状原料；

(a2)用粉碎机将块状原料粉碎成颗粒状原料，所述颗粒状原料与米粒大小相同即可；

(a3)采用瓶将颗粒状原料进行分装；瓶采用蛹虫草培育瓶，每瓶装30-40克，封好口；

(a4)然后灭菌和冷却处理，得到需要的培养基；其中，灭菌的方法为：在121℃情况下保持30分钟，就可以有效灭菌，

在所述的步骤(a1)中，所述干料与水的质量比可以为1:1.5。

在所述的步骤(a1)中，蒸煮的温度为100℃。

在所述的步骤(c)中，先进行黑暗培养再进行见光培养。

所述黑暗培养的温度为22℃，黑暗培养的时间为6天，培养基上就长满菌丝了。

所述见光培养中先进行低光照培养再进行高光照培养，低光照培养的环境条件为：温度控制在23℃左右，光线每天照射10小时，光照的光强为1000lux；高光照培养的环境条件为：温度控制在26℃左右，光照的光强为5000lux，24小时照光。低光照培养时间是从见光开始进行照光24天左右；高光照培养在采收前10天左右进行，从接种到采收的培养时间为40天左右。

采收的时候，要求连子实体和培养基一起采收，然后进行烘干保存。经过以上方法培养的蛹虫草中的虫草素含量达到2％左右。

实施例二

一种培养基，它含有的组分及各组分质量百分比如下：鸡蛋粉：100％。

一种高含量虫草素的虫草培养方法，该方法的步骤中含有：

(a)制作培养基；

(b)在培养基上接种蛹虫草菌种；接种在无菌的条件下进行；

(c)然后在一定环境条件下培养后，采收得到所需的蛹虫草。

在所述的步骤(a)中，培养基的制作步骤如下：

在所述的步骤(a1)中，所述干料与水的质量比可以为1:1.5。

在所述的步骤(a1)中，蒸煮的温度为105℃。

在所述的步骤(c)中，先进行黑暗培养再进行见光培养。

所述黑暗培养的温度为23℃，黑暗培养的时间为5天，培养基上就长满菌丝了。

所述见光培养中先进行低光照培养再进行高光照培养，低光照培养的环境条件为：温度控制在22℃-25℃，光线每天照射11小时，光照的光强为2000lux；高光照培养的环境条件为：温度控制在25℃-27℃，光照的光强为6000lux，24小时照光。低光照培养是从见光开始进行25天左右；高光照培养在采收前12天左右进行，从接种到采收的培养时间为42天比较合适。

采收的时候，要求连子实体和培养基一起采收，然后进行烘干保存。经过以上方法培养的蛹虫草中的虫草素含量达到2.7％左右。

实施例三

一种培养基，它含有的组分及各组分质量百分比如下：鸡蛋粉：86％；麦芽糊精：10％；腺苷：4％。

一种高含量虫草素的虫草培养方法，该方法的步骤中含有：

(a)制作培养基；

(b)在培养基上接种蛹虫草菌种；接种在无菌的条件下进行；

(c)然后在一定环境条件下培养后，采收得到所需的蛹虫草。

在所述的步骤(a)中，培养基的制作步骤如下：

在所述的步骤(a1)中，所述干料与水的质量比可以为1:1.5。

在所述的步骤(a1)中，蒸煮的温度为102℃。

在所述的步骤(c)中，先进行黑暗培养再进行见光培养。

所述黑暗培养的温度控制在23℃，黑暗培养的时间为5天，培养基上就长满菌丝了。

所述见光培养中先进行低光照培养再进行高光照培养，低光照培养的环境条件为：温度控制在25℃，光线每天照射12小时，光照的光强为4000lux；高光照培养的环境条件为：温度控制在27℃，光照的光强为7000lux，24小时照光。低光照培养是从见光开始进行27天左右；高光照培养在采收前13天左右进行，从接种到采收的培养时间为45天。

采收的时候，要求连子实体和培养基一起采收，然后进行烘干保存。经过以上方法培养的蛹虫草中的虫草素含量达到3.5％。

经过大量地研究，不同的菌株、培养方式、培养基配方、环境条件和培养时间等因素对蛹虫草生长过程中虫草素的产生有重要影响，影响虫草素产量的因素是多方面的，并且各因素问存在互作、是作为一个整体来影响虫草素产量的。而以往的研究往往仅孤立地探讨某个单因素对虫草素产生的影响，这是不够科学的，不能形成最佳的虫草素生产工艺。因此，通过科学的试验设计，把影响虫草素产量的各因子放在一起进行综合考量，摸索研究出蛹虫草的最佳生产工艺条件。

为了生产出虫草素含量高的原料，从菌株种类、培养方式、培养基成分、环境因子和培养时间等均进行了研究。

通过现代研究认为，许多虫草菌类的子实体或菌丝体都能在生长过程中产生虫草素，例如蛹虫草、九州虫草、冬虫夏草、蝉花等都可产生虫草素。其中蛹虫草不仅栽培比较容易，并且子实体和菌丝体中虫草素的产量也较高，是目前用于虫草素生产最佳的菌种。

除了菌种之外，不同的培养基配方以及不同环境培养条件对虫草素的含量影响也非常大。本发明通过大量试验，将菌种采用蛹虫草菌种，培养基采用由鸡蛋粉为主要成分，还可以加入麦芽糊精和腺苷的固体培养基，还从光线、温度等培养环境条件刺激来提高虫草素含量。

以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

除了菌种之外，不同的培养基配方以及不同环境培养条件对虫草素的含量影响也非常大。本发明通过大量试验，将菌种采用蛹虫草菌种，培养基采用由鸡蛋或鸡蛋粉为主要成分，还可以加入麦芽糊精和腺苷的固体培养基，还限定了蛹虫草的培养环境条件，不仅使生产效率大大提高，生产周期缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制，工厂化生产的成本会很低。

Claims

1.一种高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于该方法的步骤中含有：

(b)在培养基上接上蛹虫草菌种；

2.根据权利要求1所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：在所述的步骤(a)中，培养基的制作步骤如下：

(a2)将块状原料粉碎成颗粒状原料；

(a3)采用瓶将颗粒状原料进行分装；

(a4)然后灭菌和冷却处理，得到需要的培养基。

3.根据权利要求2所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：在所述的步骤(a1)中，所述干料与水的质量比为1:1.5。

4.根据权利要求2所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：在所述的步骤(a1)中，蒸煮的温度为100℃～105℃。

5.根据权利要求1所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：在所述的步骤(c)中，先进行黑暗培养再进行见光培养。

6.根据权利要求5所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：所述黑暗培养的温度控制在22℃～23℃。

7.根据权利要求5所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：所述见光培养中先进行低光照培养再进行高光照培养，低光照培养的环境条件为：温度控制在22℃-25℃，光线每天照射10小时-12小时，光照的光强为1000-3000lux。

8.根据权利要求7所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：高光照培养的环境条件为：温度控制在25℃-28℃，光照的光强为5000-7000lux，24小时照光。

9.根据权利要求5所述的高含量虫草素的虫草培养方法，其特征在于：见光培养的光源为黄色光。

10.一种如权利要求1至9中任一项所述的高含量虫草素的虫草培养方法中使用的培养基，其特征在于它含有的组分及各组分质量百分比如下：鸡蛋粉：75％～100％；麦芽糊精：0％～20％；腺苷：0％～5％；所述培养基的组分之和总计100％。