CN106804285A - 提高牛樟芝三萜类成分的培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，先将预定比例的麦芽萃取物、葡萄糖、蛋白胨、琼脂及菇类萃取物等物质加入蒸馏水后均匀混合，再将混合后的培养基溶液置于一高压灭菌设备内，在预定压力、温度下加热杀菌适当时间，继而将灭菌后的培养基溶液，在无菌环境下倒入一培养皿至适当高度，并静置、冷却培养基溶液，以形成一固态培养基，再将牛樟芝菌种分别接菌至固态培养基的复数位置，各位置并具适当间距，最后，在预定温度、波长、照射光度的光源照射下培养30天，不需要使用牛樟椴木培养，即可在1个月采收高三萜总量的牛樟芝。
Description
技术领域
本发明与牛樟芝的培养方法有关，更详而言之是指一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法。
背景技术
牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是一种生长在樟科植物-牛樟树心材的寄生真菌，已被中国人广泛用作为治疗食物、药物中毒、腹泻、腹痛、高血压和癌症，具有开发成医药或保健食品的高经济价值。牛樟芝子实体特有的三萜类成分甚多，此处不一一赘述，三萜类成分具有抗肿瘤活性、促使癌细胞凋亡等疗效，但不会影响人体正常细胞。
已知关于牛樟芝子实体的培养方法不少，如TWI422680专利、CN102746054公开案，利用一般常用培养微生物的培养基，添加中草药萃取物，在温度、湿度、空气量控制的无菌密闭空间培养135天，获得固态培养基培养牛樟芝。CN202455895公开案，以控制温湿度与具有光照波长为300～800nm单元的无菌培养箱，促进牛樟芝在椴木培养效率，提高牛樟芝所含不同活性成分的含量。上述专利所揭技术，皆需有温、湿度控制的昂贵无菌空调空间的设备，需要添加昂贵且大量(16.7％～40％)的中草药萃取物，固态培养基培养牛樟芝的培养时间至少5-6个月，椴木培养时间至少24个月，不仅生产成分太贵，环境控制消耗能量，也不环保。
其次，目前业界栽培牛樟芝的方式大概区分为四大类，第一种是以牛樟椴木栽培牛樟芝子实体的方式，第二种是以固态培养基培养牛樟芝的方式，第三种是以液态发酵方法培养牛樟芝菌丝体，第四种是以太空包方式栽培。使用牛樟树椴木培养牛樟芝，会破坏森林、生态，造成牛樟树遭受空前浩劫滥砍。牛樟芝的子实体，不论是椴木栽培或固态培养基培养都含有牛樟芝的三萜类成分。液态发酵方法培养牛樟芝菌丝体中，则不含牛樟芝特有三萜类成分，虽然培养时间短、可快速量产，不过其菌丝体内容物组成分析和子实体成分差异甚大。采用含有营养物质的太空包来培养牛樟芝(如栽培香菇子实体的方法)，所得到的牛樟芝外观虽然与牛樟芝相似，但木质纤维太高，因此三萜类化合物的含量低。
换言之，椴木栽培或固态培养基培养牛樟芝子实体，都可含有三萜类成分，较其他两种牛樟芝培养方式佳，不过，固态培养基培养方式的成本高、培养时间长、约需2年，不利于量产与推广。
发明内容
本发明的主要目的即在提供一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其不使用椴木培养牛樟芝子实体，在一个月内，在室温、光线照射的环境下培养，可达到快速量产而又富含三萜类化合物成分的功效，成本低，甚为环保、安全，甚具经济价值。
缘是，为达成前述的目的，本发明提供一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其步骤至少包含有混合培养基的组成成分：将预定比例的麦芽萃取物(maltextract)、葡萄糖(glucose)、蛋白胨(peptone)、琼脂(agar)及菇类萃取物等物质加入蒸馏水后均匀混合；灭菌：将混合后的培养基溶液置于一高压灭菌设备内，在预订压力、温度下加热杀菌适当时间；形成固态培养基：将灭菌后的培养基溶液，在无菌环境下倒入一培养皿至适当高度，并静置、冷却培养基溶液，以形成一固态培养基；菌株接种：将牛樟芝菌种分别接菌至固态培养基的复数位置，各位置并具适当间距；光线刺激培养：在预定环境温度、预定波长、照射光度的光源照射下，培养适当时间，以获得高含量的牛樟芝三萜类成分。
进一步地，混合培养基的组成成分的步骤中，将1％-2％w/v浓度的麦芽萃取物、1％-2％w/v浓度的葡萄糖、0.1％-0.2％w/v浓度的蛋白胨、1％-2％w/浓度的琼脂及0.1％-0.2％w/v浓度的菇类萃取物等物质，置入于可灭菌的一玻璃容器中。
进一步地，菇类为金针菇、木耳、银耳或香菇。
进一步地，灭菌的步骤中，在压力1kg/cm2、温度120-121℃下，加热杀菌25-30分钟。
进一步地，该高压灭菌设备为高压灭菌釜。
进一步地，形成固态培养基的步骤中，将灭菌后的培养基溶液倒入一直径90mm、高度10mm的培养皿中，培养基倒入高度约1mm(相当体积6cc)。
进一步地，该无菌环境指在一无菌操作台上操作。
进一步地，菌株接种的步骤中，将牛樟芝菌种分别接菌至固态培养基的上、下、左、右、中的五个位置，每个位置的间距约20mm。
进一步地，牛樟芝菌种的接菌面积为1mm×1mm面积。
进一步地，光线刺激培养的步骤中，培养温度为25-30℃、培养光源为波长620-625nm、照射光度为400-600Lux，培养时间为30天。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，利用皿培式培养法来培养牛樟芝子实体，不仅可缩短培养时间至4周，更可提升培养的成功率(成功率约为95％～98％)及产量，可增加推广价值；可提升牛樟芝的培养效率，并可稳定牛樟芝子实体的三帖类生成量；本发明的培养方法配合光线刺激，可有效刺激牛樟芝子实体的生长状况，并可提高牛樟芝子实体的三萜类成分生成量。
附图说明
图1为本发明一较佳实施例的流程图。
图2为本发明一较佳实施例提供菇类营养前驱物质配方培养基与已知椴木培养所培养的牛樟芝子实体中三萜类成分的HPLC分析图谱。
图3为本发明一较佳实施例与已知椴木培养所培养的牛樟芝子实体中三萜类成分的HPLC分析图谱。
具体实施方式
以下，兹举本发明一较佳实施例，并配合附图做进一步的详细说明如后。
首先，请参阅图1所示，本发明一较佳实施例的提高牛樟芝三萜类成分的培养方法100，其第一步骤为混合培养基的组成成分110：依比例预先混合培养基的各组成成分(营养前驱物质)，该培养基配方为：1％-2％w/v(本实施例为2％w/v)浓度的麦芽萃取物(malt extract)、1％-2％w/v(本实施例为2％w/v)浓度的葡萄糖(glucose)、0.1％-0.2％w/v(本实施例为0.2％w/v)浓度的蛋白胨(peptone)、1％-2％w/v(本实施例为2％w/v)浓度的琼脂(agar)、0.1％-0.2％w/v(本实施例为0.2％w/v)浓度的菇类萃取物(如金针菇、木耳、银耳、香菇等物质，本实施例为木耳)，置入于可灭菌的玻璃容器中，再加入蒸馏水均匀混合。
本发明的第二步骤为灭菌120：将混合后的培养基溶液置于一高压灭菌设备内，为高压灭菌釜，在压力1kg/cm2下、温度120-121℃(本实施例为121℃)，加热杀菌25-30分钟(本实施例为30分钟)。
本发明的第三步骤为形成固态培养基130：将灭菌后的培养基溶液，在无菌环境(无菌操作台)倒入一培养皿至适当高度，该培养皿的直径90mm、高度10mm，培养基倒入高度约1mm(相当体积6cc)，并静置、冷却培养基溶液，以形成一固态培养基。
本发明的第四步骤为菌株接种140：将牛樟芝菌种以1mm×1mm的接菌面积，分别接菌至固态培养基的上、下、左、右、中的五个位置，各位置并相隔约20mm。
本发明的最后步骤为光线刺激培养150：在温度25-30℃(即室温)(本实施例为25℃)、光源波长620-625nm(红光)(本实施例为625nm)、照射光度400-600Lux(本实施例为600Lux)的光源照射下，培养30天，即可获得高含量的牛樟芝三萜类成分。
藉此，本发明提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其通过混合培养基的组成成分、灭菌、形成固态培养基、菌株接种及光线刺激培养的步骤，可在一个月的培养时间获得高含量的牛樟芝三萜类成分。
以下，兹就本发明培养方法所获得的牛樟芝子实体三萜类成分含量，与已知椴木培养得到的牛樟芝子实体三萜类成分作比较与分析，如下：
经由本发明所提供的菇类营养前驱物质配方培养基培养所得到的牛樟芝子实体与椴木培养得到的牛樟芝子实体，从图2的牛樟芝子实体中三萜类成分的HPLC分析图谱显示，二者三萜类成分是相同的，亦即，本发明的培养方法可获得与已知椴木培养的牛樟芝子实体相同含量的三萜类成分。
其次，本发明的培养方法，其从菇类子实体，如金针菇、木耳、银耳、香菇熬煮的浓缩液，具有直接诱导牛樟芝子实体形成三萜类成分的功效，因此，给予适当的营养前驱物质配方有助于牛樟芝菇体的子实体形成三萜类成分快速生成。使用一般微生物培养添加营养前驱物质配方调和而成的培养基，使菌种能在接近天然生长状态的固态环境下成长，并且使用高温消毒技术，可确保无其他微生物、保证品质无污染。
而已知椴木栽培法是使用枯死的牛樟树椴木，将牛樟芝菌体植入椴木中，使牛樟芝在椴木中生长，藉此取得牛樟芝子实体，此种培养方式的成本高、培养时间约需2年，不利于量产与推广，相较之下，本发明显然更具经济价值。
再者，进行子实体诱导测试时，本发明红光照射与营养前驱物物质引导的刺激有助于三萜类成分在子实体中形成高含量三萜类成分。而菇菌类子实体产生三萜类成分的机制，主要是因应营养与环境状况，比方营养前驱物质添加与环境光线刺激，进而促进从子实体中产生三萜类成分，从图3的牛樟芝子实体中三萜类成分的HPLC分析图谱可显示与证明，本发明较椴木培养得到的牛樟芝子实体，可获得更高含量三萜类成分。
由上可知，本发明提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其至少具有下列优点及有益效果：
1、利用皿培式培养法来培养牛樟芝子实体，不仅可缩短培养时间至4周，更可提升培养的成功率(成功率约为95％～98％)及产量，可增加推广价值。
2、本发明所提供的营养前驱物质配方培养基成份，可提升牛樟芝的培养效率，并可稳定牛樟芝子实体的三帖类生成量。
3、本发明的培养方法配合光线刺激，可有效刺激牛樟芝子实体的生长状况，并可提高牛樟芝子实体的三萜类成分生成量。
Claims (10)
1.一种提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，步骤包含有：
混合培养基的组成成分：将预定比例的麦芽萃取物、葡萄糖、蛋白胨、琼脂及菇类萃取物加入蒸馏水后均匀混合；
灭菌：将混合后的培养基溶液置于一高压灭菌设备内，在预订压力、温度下加热杀菌适当时间；
形成固态培养基：将灭菌后的培养基溶液，在无菌环境下倒入一培养皿至适当高度，并静置、冷却培养基溶液，以形成一固态培养基；
菌株接种：将牛樟芝菌种分别接菌至固态培养基的复数位置，各位置并具适当间距；及
光线刺激培养：在预定环境温度、预定波长、照射光度的光源照射下，培养适当时间，以获得高含量的牛樟芝三萜类成分。
2.如权利要求1所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，混合培养基的组成成分的步骤中，将1％-2％w/v浓度的麦芽萃取物、1％-2％w/v浓度的葡萄糖、0.1％-0.2％w/v浓度的蛋白胨、1％-2％w/v浓度的琼脂及0.1％-0.2％w/v浓度的菇类萃取物，置入于可灭菌的一玻璃容器中。
3.如权利要求2所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，菇类为金针菇、木耳、银耳或香菇。
4.如权利要求1所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，灭菌的步骤中，在压力1kg/cm2、温度120-121℃下，加热杀菌25-30分钟。
5.如权利要求4所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，该高压灭菌设备为高压灭菌釜。
6.如权利要求1所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，形成固态培养基的步骤中，将灭菌后的培养基溶液倒入一直径90mm、高度10mm的培养皿中，培养基倒入高度1mm。
7.如权利要求6所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，该无菌环境指在一无菌操作台上操作。
8.如权利要求1所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，菌株接种的步骤中，将牛樟芝菌种分别接菌至固态培养基的上、下、左、右、中的五个位置，每个位置的间距约20mm。
9.如权利要求8所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，牛樟芝菌种的接菌面积为1mm×1mm面积。
10.如权利要求1所述提高牛樟芝三萜类成分的培养方法，其特征在于，光线刺激培养的步骤中，培养温度为25-30℃、培养光源为波长620-625nm、照射光度为400-600Lux，培养时间为30天。
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