CN106167837A

CN106167837A - 牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物和探针

Info

Publication number: CN106167837A
Application number: CN201610784167.0A
Authority: CN
Inventors: 王艳杰; 魏学峰; 刘国英; 范秀丽; 张贵刚; 周伟光; 关平原; 张七斤; 陈君彦; 韩志玲; 王秀明; 王云凌; 张宸; 张妍; 韩四娥; 羡东堡; 田志辉; 张燕红; 谯小燕
Original assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2016-11-30

Abstract

本发明公开了一种用于检测I型和II型牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。利用本发明的试剂盒对BVDV检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于I型、II型牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒和猪瘟病毒的鉴别，更可以实现I型和II型牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的准确定量，可用于疫苗生产中原料和半成品检测、牛奶产品质检等领域。

Description

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，特别涉及一种用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

牛病毒性腹泻-粘膜病

牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)，简称牛病毒性腹泻或黏膜病，是由牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)引起的，主要发生于牛的一种急性、热性传染病，其临诊特征为黏膜发炎、糜烂、坏死、腹泻及怀孕母牛流产。2008年颁布的我国农业部公告第96号将牛病毒性腹泻病列入三类疫病。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)粒子呈圆形颗粒，直径约为50-80nm，有囊膜，表面有纤突结构。根据产生细胞病变的情况，BVDV分为2个型，非致细胞病变型(NCP)和致细胞病变型(CP)，其基因组长度分别约为12.5Kb和12.3Kb。BVDV基因组核酸为单股正链RNA分子，包括5’UTR区、ORF和3’NRT区三个部分。根据5’UTR区序列将BVDV分为两种基因型，即I型(BVDV-I)和II型(BVDV-II)，流行病学调查发现BVDV-I型流行更为广泛，但随着II型BVDV病毒传入我国，II型BVDV病毒也越来越受到更多人的关注。BVDV和猪瘟病毒(CSFV)的核苷酸序列及氨基酸序列同源性非常高，分别约为66％和85％。BVDV病毒在很多细胞培养物中都能繁殖，例如胎牛肾、睾丸、脾、胎羊睾丸、猪肾等细胞培养物，目前牛肾继代细胞株被广泛应用。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的流行情况

目前，牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)分布于世界各地，从20世纪八、九十年代以来，在北美州，美国、加拿大BVD-MD的感染率达到50％-85％；在欧洲、法国、德国，经血清学调查结果显示BVD-MD的感染率为76％，瑞典的发病率在10％-80％之间，芬兰肉牛的感染率不小于50％，希腊阳性率为1.3％-14％，立陶宛阳性率为70％-100％，瑞士和波兰的平均阳性率分别为12.5％和86％；在南美洲，巴西、委内瑞拉、秘鲁、新西兰及澳大利亚BVD-MD的阳性率分别为15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。

我国于1980年首次发现BVDV，之后在全国的20多个省、市都陆续检测到了BVDV。菅复春等从河南省采集了576份样品，包括从5个肉牛养殖场采了395份血清样品和6个奶牛场采了181份牛奶样品，对这576份样品进行BVDV抗体的检测，结果显示，肉牛血清样品和奶牛牛奶样品的平均BVDV阳性率分别为31.39％和58.60％(河南牛病毒性腹泻粘膜病流行病学调查，菅复春等，中国兽医杂志，2012,48(5)：3-6)。2006-2008年之间，杨得胜等花费3年时间对福建省的9个地区的56个散养户和15个大型牛场的牛进行血清学调查，结果BVDV平均阳性率高达93.1％(福建省牛病毒性腹泻病的血清学调查，杨得胜等，中国动物检疫，2008,25(12)：36-37)。这些研究表明，BVDV检测不仅对判断奶牛是否患病有重要意义，还是奶牛产奶安全性的重要保障。

牛病毒性腹泻-粘膜病的预防

因牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)的广泛流行，接种疫苗是预防该病发生的有效手段，当前生产上使用的疫苗主要是用BVDV研究毒株的细胞培养物培养制作而成的弱毒疫苗或灭活疫苗。实践证明，BVDV灭活疫苗以及弱毒疫苗可以有效保护同源或者抗原差异较小的毒株，但对不同抗原性的BVDV毒株，则无法完全保护。Meyers等评估了BVDV I型灭活疫苗对BVDV II型感染的免疫效果，结果BVDV灭活苗只能在一定程度上交叉保护异源亚型BVDV感染(Meyers G,Tantz N,Dubovi EJ,Dubovi,Heinz-Jürgen T.1991.Viralcytopathogenicity correlated with integration of Ubiquitin-coding sequences[J].Virol:180:602～616)。此外，由于BVDV弱毒疫苗存在引发子宫感染、免疫抑制及外源病毒污染的风险，因此，BVDV弱毒疫苗的使用仍存在争议。当然，不可否认BVDV弱毒疫苗在一定程度上还是安全的。

牛病毒性腹泻-粘膜病的诊断

普遍存在的牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)，以及复杂的致病机理，造成了牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)的防治困难。在我国BVD-MD病例通常不表现出该病特异性临床症状，大多数是隐性感染，如持续感染、免疫耐受等。而隐性感染在牧场中通常不被重视，因此并没有得到足够的监控。使用疫苗又存在着效果不理想、安全性较差的问题，导致BVD-MD在我国日趋流行。

BVDV检测

目前，针对BVDV病毒的检测，业内普遍采用的方法有普通PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术和RPA检测技术，其问题在于普通PCR检测技术因只采用一对引物进行检测，对目的序列的适应性强，导致核酸序列同源性高的病毒也出现特异性条带，从而导致假阳性，而RPA检测技术敏感性要低于荧光定量PCR检测技术，如RPA专利文献CN201510292386.2的检测敏感性仅为2TCID₅₀，而定量PCR专利文献CN201410658803.6 的检测敏感性高至0.32TCID₅₀，但是因不同荧光定量PCR方法设计的引物和探针序列的位点不同，在进行BVDV病毒检测时，其敏感性也不近相同，如海日汗“鉴别GSFV与BVDV1双重实时荧光定量PCR方法的建立”文献中检测病毒敏感性仅为10²copies/uL，并且该方法的建立只针对I性BVDV病毒而不涉及II型BVDV。由于I型和II型BVDV病毒的核苷酸序列差异比较大，寻找一个好的位点同时进行I型和II型BVDV的检测非常困难，尽管专利文献CN201410658803.6建立检测方法的重复性好，循环数标准偏差最高仅为0.6，但因该专利采用的BVDV毒株为C24V毒株，该毒株属于I型BVDV，该文献中未涉及到II型BVDV毒株，该方法是否能够检测II性BVDV毒株还需要进一步确认。还有，BVDV检测中还面临着猪瘟病毒(CSFV)的干扰，因猪瘟病毒(CSFV)和BVDV是同一个属的成员，同源性高，具有很强的血清学交叉反应，通过琼脂扩散试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验以及常规PCR技术都存在一定的交叉反应，很难将两者彻底区分，因此BVDV检测中存在假阳性。

相关技术

实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析(Heid CA,Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.1996Oct；6(10):986-94.)。实时荧光定量PCR技术是一种对病毒基因组进行检测的相对定量技术，与普通PCR技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用中间的寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别。目前，该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域(Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real-time PCR-based analysis of geneexpression.Methods Enzymol.2011；500:99-109.)

发明内容

本发明的第一个目的是提供用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，并实现牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的鉴别。

本发明所提供的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物为：上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

由上述引物衍生的引物序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

本发明所提供的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针为：TaqMan探针(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在SEQID NO：3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

所述用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(BVDV-P)的5’端报告荧光基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。

本发明的第二个目的是提供用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒。

本发明所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O 7.5μL。

为方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型基因组RNA，所述阴性对照为不含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

本发明的第三个目的是提供所述引物、探针或试剂盒在对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的的检测、或在对BVDV与猪瘟病毒(CSFV)进行非疾病诊断目的的鉴别的应用。

该应用之一为一种用上述实时荧光定量PCR检测试剂盒及实时荧光定量PCR技术对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的的定性、定量检测的方法。该实时荧光定量PCR检测包括以下步骤：

1)建立标准曲线：选取I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR区域基因的特异性保守序列(I型病毒自5’端第131-606位碱基)作为标准品构建序列，设计对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的标准品引物，构建携带I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR区域检测基因的重组质粒pCR TOPO-BVDV standardplasmid，对鉴定正确的重组质粒进行转录，制备RNA标准品，将携带I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR检测基因的重组质粒pCR TOPO-BVDV standard plasmid转录的RNA产物作为标准品，分别10倍梯度稀释成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝(copies)/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在上述引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在上述引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的拷贝数，实现定量检测。

应用之二为一种牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的鉴别，在上述步骤后还包括：

4)结果判定：

本发明的实时荧光定量PCR检测方法只对BVDV样品有扩增曲线而对CSFV样品无扩增曲线，本发明充分利用两者基因序列的差异，并利用探针序列差异2个碱基之上无法扩增的原理，筛选出三处较好的位点(自5’端192、193、206位点)，用BVDV-F、BVDV-R和BVDV-P可同时扩增I型和II型BVDV，PCR扩增若出现标准的“S”型曲线可以确认其为I型和II型BVDV病毒，因与CSFV序列具有3个碱基的差异无法扩增CSFV序列(未出现“S”型曲线)，从而实现鉴别牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的目的。

具体判定方法：35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为BVDV阳性(样品中含有I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，38个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为BVDV阴性(样品中不含有I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，35-38个循环之间判定为可疑，需重检。

在上述方法中，所述步骤2)中的待测样品可以为采自胎牛或犊牛用于疫苗生产的原料血清、疫苗半成品，也可以为奶牛所产牛奶，对其检测用于非诊断目的。通过对此类待测样品中BVDV病毒的定量检测以实现对疫苗原料及半成品等的监控，并为后续处置提供客观数据。

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH₂O 7.5μL。引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。TaqMan探针稀释为10ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。

所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先52℃15min，95℃2min；然后94℃5s，58℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。

本发明提供了一种用于检测I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明能对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒实施快速检测，可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗(如评估配制疫苗抗原的准确含量，为疫苗抗原含量提供数据基础)提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和合理性，对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型疫苗的生产具有指导作用；还可以对奶牛产奶质量进行监控，并为后续处置提供客观数据，以保证牛奶及其制品的安全性。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒和猪瘟病毒的鉴别，更可以实现I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的准确定量，将在I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的检测(包括临床诊断中临床病料或培养物中I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的准确检测)及疫苗生产和牛奶制品生产(非诊断目的的应用)中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明用实时荧光定量PCR技术对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行定性、定量检测的技术路线

图2为本发明用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行实时荧光定量PCR检测的标准品的扩增曲线

图3为本发明用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行实时荧光定量PCR检测的标准曲线

图4为I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果

图5为I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测结果

图6为I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的实时荧光定量PCR检测方法的重复性检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由北京华大基因有限公司合成；所用探针由TAKARA基因公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的病毒所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的病毒分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增，从而通过一定的方法使得肉眼可见。

如图1所示，本发明基于以上基本原理设计了一对特异性引物和一条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的实时荧光定量PCR检测方法。

实施例1、设计用实时荧光定量PCR技术检测I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的引物和TaqMan探针

由于I型和II型BVDV病毒的核苷酸序列差异比较大，寻找一个好的位点同时进行I型和II型BVDV的检测是关键。从NCBI的核酸数据库GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR区域基因(BVDV I型GenBank号：JN704144，其全基因序列如序列表中SED ID NO：4所示，BVDV II型GenBank号：FJ431191.1，其5’端基因序列如序列表中SED ID NO：5所示)的序列，用DNA Man软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，选取牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR区域基因(选择该基因是因为BVDV不同毒株之间相对保守)并将优选的特异性保守序列作为检测序列(该检测序列为I型牛病毒性腹泻粘膜病病毒自5’端第131-606位碱基，序列表中SED ID NO：6)，用Primer Express 6.0软件设计对牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针，序列如下：

BVDV-F(上游引物)：5’-AGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGA-3’(序列表中SED ID NO：1)

BVDV-R(下游引物)：5’-GCCCTCGTCCACGTGGC/TATCTCG-3’(序列表中SED ID NO：2)

BVDV-P(TaqMan荧光探针)：5’-ROX-AGTACAGGGTAGTCGTCAA/GTGGTTCG-BHQ2-3’(序列表中SED ID NO：3)。

BVDV-P的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。

实施例2、用本发明的引物及TaqMan探针对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测

一、提取待测样品的基因组RNA

分别对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒细胞培养物(用于获得标准品和获得阳性对照)以及待测样品提取基因组RNA，具体方法包括以下步骤(Axyprep^TMBody FluidViral DNA/RNA Miniprep Kit，AXYGEN公司)：

(1)AXYGEN试剂盒准备：按试剂盒说明书，预先配置含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定浓度的无水乙醇。

(2)在1.5mL离心管中加入200uL的待检样品，并加入200uL Buffer V-L，漩涡震荡混匀后，静置5min.

(3)在步骤(2)的1.5mL样品及试剂混合离心管中加75uL Buffer V-N，漩涡震荡混匀，12000g离心5min。

(4)将上清转移至2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300uL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。

(5)将制备管置于2mL离心管中(试剂盒内提供)中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min。

(6)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加500uL Buffer W1A，室温静置1min。12000g离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加800uL Buffer W2，12000g离心1min。

(8)将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min。

(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40uL无酶水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱RNA。

从待测样品中提取的RNA作为检测样；从I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒细胞培养中提取的RNA作为阳性对照样；按照下述二的方法将从I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒细胞培养中提取的RNA制备得到标准品。

二、I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的实时荧光定量PCR标准曲线的建立

1、PCR扩增I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒PCR扩增引物***的的5’UTR区域基因

对步骤一提取的来自I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的基因组RNA进行PCR扩增，得到I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR区域基因的目的片段，25μL反应体系如下：

表1 I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒5’UTR区域基因的PCR扩增体系

2、标准品制备

将纯化回收的I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR区域含检测基因的目的片段克隆至pCR TOPO载体(购自Invitrogen公司)中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒送华大基因公司测序，验证质粒构建知否成功。测序结果表明获得了序列正确的携带I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR区域基因的重组质粒，命名为pCR TOPO-BVDVstandard plasmid，对鉴定正确的重组质粒采用TAKARA的T7转录试剂盒进行转录，制备得到RNA标准品。

3、实时荧光定量PCR标准曲线的建立

对测序正确的携带I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR基因的重组质粒pCR TOPO-BVDV standard plasmid转录的RNA产物，用Nanodrop测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，按照10倍梯度将标准品稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，每个样品做2个重复，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测。

实时荧光定量PCR的反应体系(25μL)如下：

表2 I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的5’UTR基因的实时荧光定量PCR反应体系

试剂名称	体积(μL)
		2×One Step RT-PCR Buffer III(购自TaKaRa公司)	12.5
TaKaRa Ex Taq HS(购自TakaRa公司)	0.5
		PrimeScript RT Enzyme Mix II(购自TakaRa公司)	0.5
BVDV-F(20μM)	0.5
		BVDV-R(20μM)	0.5
BVDV-P(10μM)	1.0
		DNA模板	2.0
RNA-free H₂O	7.5

实时荧光定量PCR的反应条件为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：反转录条件：52℃15min，95℃2min；PCR扩增条件：94℃5s，58℃30s，45个循环。

标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图2所示，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线(阳性)，图2中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图3所示，相关系数分别为R²＝1.000，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝-3.295x+42.139。

4、对疫苗原料血清中I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测

本实施例用本发明建立的I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测方法对所收集的12份疫苗原料血清(待测样品)提取的RNA(检测样)进行检测，以灭活的I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒细胞培养物提取的RNA为阳性对照样，以无酶水为阴性对照样，根据实时荧光定量PCR检测结果，对样本中I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒进行判定，并对病毒的拷贝数进行定量。

结果如表3所示，所检测的12份检测样中有4份为阴性(没有I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒)，8份血清判定为阳性(存在I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒)，循环数均小于35，且其拷贝数大于10¹拷贝，不可以用作I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒疫苗生产的原料(原材料中不允许含有BVDV病毒)。可见使用本发明方法能监控疫苗原料血清中的病毒水平，有效筛选出合格原料。

表3 样本实时荧光定量PCR检测结果

样本	定量结果(循环数)	定量结果(copies/μL)	判定结果
				阳性对照	26.18	5.17E+04	成立
血清样品1	32.29	2.56E+02	阳性
				血清样品2	0	0	阴性
血清样品3	33.64	8.90E+01	阳性
				血清样品4	31.54	4.65E+02	阳性
血清样品5	0	0	阴性
				血清样品6	32.85	1.65E+02	阳性
血清样品7	34.99	1.52E+01	阳性
				血清样品8	34.97	3.11E+01	阳性
血清样品9	34.94	3.19E+01	阳性
				血清样品10	39.54	8.45E-01	阴性
血清样品11	28.10	7.01E+03	阳性
				血清样品12	0	0	阴性
阴性对照	0	0	成立

实施例3、特异性实验

按照实施例2所述方法利用DNA/RNA同时进行提取的AxyGen试剂盒对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)提取RNA，对猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒(IBRV)提取DNA，同时以灭活的I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒细胞培养物提取的RNA为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。

检测结果如图4所示，仅有BVDV出现特定的“S”型扩增曲线，结果阳性，其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒。

实施例4、灵敏度实验

按照实施例2所述，将携带牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR基因的pCRTOPO-BVDV standard plasmid标准品转录RNA产物按照10倍梯度分别稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的灵敏度。

检测结果如图5所示，显示本发明I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测方法可以检测至1×10¹copies/μL，与其它荧光定量PCR检测方法(海日汗，鉴别GSFV与BVDV1双重实时荧光定量PCR方法的建立，内蒙古农业大学硕士论文)相比，灵敏度要高10倍。

实施例5、重复性实验

按照实施例2所述，将稀释好的定量方法标准品的8个梯度作为模板，每个梯度进行3个重复，在本发明引物和TaqMan探针的指导下进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的重复性。

检测结果如图6和表4所示，从图中可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明I型和II型牛病毒性腹泻病病毒的实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好，循环数标准偏差相差最高仅为0.59，与其它荧光定量(CN201410658803.6)PCR检测方法最高标准偏差0.6的重复性相当。

表4 牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR基因的实时荧光定量重复性验证试验结果

样品信息	重复1	重复2	重复3	标准偏差
					标准品	循环数	循环数	循环数	循环数
1.00E+08	13.43	13.38	13.36	0.03
					1.00E+07	16.75	16.78	16.55	0.13
1.00E+06	19.95	20.20	20.19	0.14
					1.00E+05	23.24	23.41	23.55	0.16
1.00E+04	26.66	26.83	26.75	0.08
					1.00E+03	29.91	29.82	29.84	0.05
1.00E+02	32.85	32.71	32.44	0.21
					1.00E+01	0	36.54	37.37	0.59

实施例6、检测牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的实时荧光定量PCR检测试剂盒

基于实施例1和2，本发明所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述用于对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物(BVDV-F和BVDV-R)和TaqMan探针(BVDV-P)。

具体来讲，该试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH₂O 7.5μL。

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型基因组RNA，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

试剂盒中各试剂的使用可参考实施例2的内容。

实施例7、疫苗生产过程中对疫苗半成品中抗原的实时荧光定量PCR检测

本实施例对BVDV疫苗生产中半成品样品中疫苗抗原I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒含量进行检测。检测方法与实施例2相同，待检样品为BVDV疫苗半成品1-14号。

检测结果如表5：

表5 14份BVDV半成品样品检测结果

样品编号	循环数	拷贝数	样品编号	循环数	拷贝数
						疫苗样品1	22.60	1.06E+06	疫苗样品2	20.08	5.01E+06
疫苗样品3	23.38	5.89E+05	疫苗样品4	22.07	1.09E+06
						疫苗样品5	21.57	2.33E+06	疫苗样品6	19.53	7.65E+06
疫苗样品7	30.46	2.79E+03	疫苗样品8	31.44	8.28E+02
						疫苗样品9	21.06	3.42E+06	疫苗样品10	20.76	2.98E+06
疫苗样品11	20.79	4.17E+06	疫苗样品12	18.51	1.67E+07
						疫苗样品13	28.80	9.80E+03	疫苗样品14	19.81	6.18E+06

依据该定量检测结果，拷贝数达到10⁵的半成品苗可进行成品苗的配制，而拷贝数低的7、8、13号样品病毒含量不足，不能进行成品苗的配制。

实施例8、奶牛产奶中对I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒的实时荧光定量PCR检测

本实施例对奶牛所产奶样品中I型和II型牛病毒性腹泻粘膜病病毒含量进行检测。检测方法与实施例2相同，待检样品为奶牛场产出奶。

检测结果如表6：

表6 10份牛奶样品的BVDV病毒检测结果

样品编号	循环数	拷贝数	样品编号	循环数	拷贝数
						奶样1	32.18	5.04E+02	奶样2	0	0
奶样3	33.83	1.40E+02	奶样4	34.44	8.74E+01
						奶样5	0	0	奶样6	0	0
奶样7	0	0	奶样8	0	0
						奶样9	0	0	奶样10	40.05	2.92E+00

依据该定量检测结果，10份牛奶样品中3份样品为BVDV检测阳性，分别为1,3,和4号，剩余7份均为阴性(循环数大于38为阴性，故样品10也判为阴性)。依据该检测，针对阳性产出奶需做进一步处理，并可据此建立追溯档案。

Claims

1.用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物或TaqMan探针，依据牛病毒性腹泻粘膜病病毒I型和II型的5’UTR区域基因的特异性保守序列作为检测序列设计得到，该检测序列的碱基如序列表中SED ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，该TaqMan探针(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

4.根据权利要求3所述的TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

5.用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物和权利要求1或3或4所述的TaqMan探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR BufferIII 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-free H₂O 7.5μL。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还可包括标准品、阳性对照和阴性对照，所述标准品为含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒PCR扩增产物片段的质粒转录RNA产物，所述阳性对照为I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒基因组RNA，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

8.一种用权利要求5-7任一所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的定性、定量检测的方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：构建携带所述检测基因的重组质粒pCR TOPO-BVDV standardplasmid，对鉴定正确的重组质粒进行转录，制备得到RNA标准品，将标准品稀释成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝(copies)/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1或2所述引物和权利要求1或3或4所述TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1或2所述引物和权利要求1或3或4所述TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的CT值或荧光信号的变化对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)I型或II型；再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含I型或II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的拷贝数，实现定量检测；

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，BVDV-F(20μM)0.5μL，BVDV-R(20μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)1μL，RNA-freeH₂O 7.5μL；所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先52℃15min，95℃2min；然后94℃5s，58℃30s，45个循环。

9.一种鉴别I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的方法，在权利要求8步骤后还包括：

4)结果判定：

35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为BVDV阳性(样品中含有I型或II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，38个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为BVDV阴性(样品中不含有I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，35-38个循环之间判定为可疑，需重检。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的待测样品包括作为疫苗生产原料的血清样品、半成品疫苗样品或奶牛场牛奶样品。