CN106164736A - 用于对大的完整组织样品进行成像的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

提供了用于对大的完整组织样品进行高速、高分辨率成像的方法和装置。方法各方面包括：将样品放在光学均匀样品操纵组件中；进行校准程序以使光片与检测焦平面在所述样品内的多个位置对准；以及对所述样品进行成像程序以从每个位置收集图像。对所收集的图像进行重建以形成所述样品的三维图像。还提供了用于实施所述方法步骤的装置。

Description

用于对大的完整组织样品进行成像的方法及装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月30日提交的美国临时专利申请序号62/005,703的提交日的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式以其全文并入本文。
引言
对大的完整组织样品进行成像的一个主要挑战是在实际可行的时间段内进行成像过程。共焦显微术受成像速度缓慢困扰，在样品完全成像之前，也可能由于光致漂白而损害样品的信号发射能力。本领域中需要高速、高分辨率的成像方法和装置，所述成像方法和装置可以用于减少较大组织样品成像所需的时间量，同时使光致漂白对样品的影响最小化。本发明解决了这些和其他需求。
发明内容
提供了用于对大的完整组织样品进行高速、高分辨率成像的方法和装置。方法各方面包括：将样品放在光学均匀样品操纵组件中；进行校准程序以使光片与检测焦平面在所述样品内的多个位置对准；以及对所述样品进行成像程序以从每个位置收集图像。对所收集的图像进行重建以形成所述样品的完整三维图像。还提供了用于实施所述方法步骤的装置。
附图说明
结合附图来阅读以下详细描述，从中最佳地理解本发明。附图中包括以下附图：
图1A示出了经过CLARITY优化的光片显微术(COLM)的光学布局。
图1B，图片a至d示出了大的完整样品的光学均匀样品安装框架。
图1C和1D示出了用于在COLM中同步照明检测和自动对准参数校准的示意图。全部比例尺：100μm。
图2，图片a至d示出了使用COLM而从完整透明的Thy1-eYFP小鼠脑获取的完整脑体积的内部细节的再现图像。
图3，图片a至i提供了较大脑体积的各种放大视图。图片d至i示出了使用COLM而从完整透明的Thy1-eYFP小鼠脑获取的50微米厚体积范围内的高分辨率图像。全部比例尺：100μm。
图4A至4C示出了使用COLM而进行成像的透明完整小鼠脑中的小清蛋白免疫染色的图像。图4B中的图像是使用COLM收集的，而图4A和图4C中的图像是使用共焦显微术收集的。所有图像均表示最大Z投影并且全部比例尺均为100μm。
图5示出了共焦显微术、双光子显微术和光片显微术的示意性比较。
图6示出了控制电子器件框架和COLM零件的示意性概述。
图7示出了方法的一个实施例的方框流程图。
图8，图片a示出了具有两个照明光束路径和两个检测光束路径的多平面式COLM的示意性表示。图片b和c示出了可使用图片a中所描绘的***来执行以实现更深的成像和增大的成像速度的各种成像方法的示意性表示。
图9示出了可用于从一个照明光束路径生成四个独立光片，因而在包括两个照明光束路径和两个同时成像通路的一个实施方案中总共形成八个独立光片的多平面式COLM的示意性表示。
图10，图片a示出了图8(图片a)中详述的多平面式COLM***的物理实现方式的图片。图片b、c和d呈现了使用两个检测***而获取的成年小鼠的整个中枢神经***(大脑和脊髓)的示例数据集。图片b是来自一个相机的3D图像的最大投影，图片c是来自另一个相机的3D图像的最大投影，并且d是在将这两个投影合并后的最大投影。
图11示出具有四个检测光束路径的多平面化COLM***通过使用机动化回转镜(FM)而延伸的示意性表示。通过使用FM，样品可从正交视图进行成像，所述正交视图随后融合生成各向同性分辨率3D体积数据(LS：激光源；Sh：遮板；IFW：照明滤光轮；BE：光束扩展器；2DSc：2D检流计扫描仪；SL：f-θ扫描透镜；TL：镜筒透镜；FM：机动化回转镜；Obj：照明物镜；EFW：发射滤光轮；以及Cm：sCMOS或CCD相机。
具体实施方式
提供了用于对大的完整组织样品进行高速、高分辨率成像的方法和装置。方法各方面包括：将样品放在光学均匀样品操纵组件中；进行校准程序以使光片与检测焦平面在所述样品内的多个位置对准；以及对所述样品进行成像程序以从每个位置收集图像。对所收集的图像进行重建以形成所述样品的三维图像。还提供了用于实施所述方法步骤的装置。
在更详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可变化。也应当理解的是，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供值的范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另外清楚指示，否则本发明内涵盖所述范围的上限与下限之间的各***值(至下限单位的十分之一)以及在所陈述范围内的任何其他陈述值或***值。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所述范围内的任何特定排除的限值。如果所述范围包括限值的一个或两个，则排除这些所包括的限值一者或两者的范围也包括在所发明内。
本文中提供的某些范围中数值前面有术语“约”。本文中使用术语“约”来准确地指示它后面的确切数字以及与此术语后面的数字接近或近似的数字。在确定数值是接近还是近似具体列举的数值时，接近或近似的未列举的数值可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数值大致等同的数值。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以在本发明的实践或测试中使用，但现在描述的是有代表性的示例性方法和材料。
本说明书中所引用的所有公布和专利均以引用的方式并入本文中，就如同各个别公布或专利特定地且个别地被指示为以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文中以公开并且描述引用所述公布时所涉及的方法和/或材料。对任何公布的引用都是针对其在申请日之前的公开内容并且不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公布。此外，所提供的公布日期可能不同于可需要独立确认的实际公开日期。
应注意，如本文中和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。还应该注意的是，权利要求可以撰写成排除任何可选的元素。因而，对于使用如“唯一”、“仅”等与权利要求书要素的叙述相关的排他性术语或使用“负面”限制来说，这一陈述意图起到前提基础的作用。
本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文所述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何引述的方法可以引述的事件的顺序或以任何其他逻辑上可能的顺序实现。
在进一步更详细地描述本发明的实施方案的各个方面时，首先更详细地检查各种实施方案的***和装置的各个方面，接着论述根据本发明的某些实施方案的方法和套件。
***
本发明各方面包括用于对大的完整组织样品进行成像的***及其装置。在一些实施方案中，本发明的***包括一种显微镜装置，所述显微镜装置包括：照明光束路径，所述照明光束路径包括光源；检测光束路径，所述检测光束路径包括相机；光学均匀样品操纵组件，所述光学均匀样品操纵组件包括样品室；控制器；处理器；以及计算机可读介质，所述计算机可读介质包括指令，所述指令在由所述处理器执行时，导致所述控制器：执行校准程序以获取关于放在所述样品室中的样品的多个对准参数；以及执行成像程序，所述成像程序使用所述对准参数以生成所述样品的三维图像。现在进一步更详细地描述这些组件中的每一者。
如上概述，本发明各方面包括多个***，所述***包括照明光束路径。照明光束路径组件是本领域众所周知的并且并不在本文详细描述。在一些实施方案中，照明光束路径组件可包括准直仪、遮板、照明滤光轮、光束扩展器、二维扫描仪、扫描透镜、镜筒透镜、一个或多个镜子和光源，如以下进一步描述。在本发明的***和装置中，可以按照合适的方式使用这些组件中的任一者或它们的组合或安排。
在一些实施方案中，照明光束路径包括柱面透镜，所述柱面透镜被配置成生成静态光片。在一些实施方案中，照明光束路径包括检流计扫描仪/f-θ透镜，所述检流计扫描仪/f-θ透镜被配置成利用高斯或贝塞尔光束形成动态光片。在一些实施方案中，***可包括两个照明光束路径，其中所述照明光束路径被配置成从样品的对面的或相对的侧照明样品。
在一些实施方案中，***可被配置成从单个照明光束路径生成多个光片，诸如一个、两个、三个、四个或更多个光片。在某些实施方案中，光片可以独立地操纵以照明样品的所需部分。在一些实施方案中，可以使用两个或更多个光片来以协调的方式照明样品的一部分，以使得第一光片照明样品的第一部分并且第二光片照明样品的第二部分，其中所述样品的第一部分不同于所述样品的第二部分。在一些实施方案中，多个光片可以用于照明样品的一部分，例如，高达三个或更多个，诸如四个或更多个，诸如五个或更多个，诸如六个或更多个，诸如七个或更多个，诸如八个或更多个光片可以用于以协调的方式照明样品的一部分。在一些实施方案中，每个光片均可独立地操纵以照明样品的给定部分。在一些实施方案中，多个光片可按照协调的方式来操纵以根据本文进一步描述的方法来完成样品成像。
在一些实施方案中，***可以包括两个照明光束路径。在某些实施方案中，两个照明光束路径可用于从相对的侧照明样品，由此允许从一侧对样品的一半进行成像，并且从另一侧对样品的另一半进行成像。
根据本发明的实施方案的照明光束路径还可包括各种光源，所述光源被配置成生成在可见光谱中、波长范围为390nm至700nm的光或在红外光谱中、波长范围为子区间700-1500的光。在一些实施方案中，光源可包括激光。在一些实施方案中，光源(诸如激光光源)被配置成发射波长为例如405nm、488nm、514nm、561nm、594nm或647nm的光。多种合适光源中的任一种可用于本发明的***。
如以上概述，本发明各方面包括多个***，所述***包括检测光束路径。检测光束路径组件是本领域众所周知的并且并不在本文进行详细描述。在一些实施方案中，检测光束路径组件包括相机、镜筒透镜、发射滤光轮和检测物镜。在本发明的***和装置中，可以按照合适的方式使用这些组件中的任一个或它们的组合或安排。
在一些实施方案中，相机为CCD相机或科学CMOS相机(sCMOS)，其提供极低噪音、快速帧率、宽动态范围、高量子效率(QE)、高分辨率和大视场。此类相机可从科学技术供应商处商购获得。
在一些实施方案中，检测物镜被配置成具有一定折射率(RI)，所述折射率与进行成像的样品的RI匹配。例如，在一些实施方案中，检测物镜可以是25X、10X或4X检测物镜，其RI与进行成像分析的浸液和/或组织样品的RI匹配。
在一些实施方案中，检测物镜可以是低数值孔径检测物镜。物镜的数值孔径描述了可由物镜收集的所发射光信号(例如，荧光信号)的数量以及可实现的衍射极限分辨率。较高的数值孔径根据由阿贝衍射极限(λ/2NA)所限定的关系而以波长依赖方式转化为改进的分辨率。在一些实施方案中，检测物镜的数值孔径范围为0.1至1.4，诸如0.6至1.0。
在一些实施方案中，检测物镜具有工作距离(WD)，所述工作距离为焦平面(或成像平面)与物镜物理边缘之间的距离。因此，检测物镜的WD确定了在样品与物镜之间无物理接触的情况下，样品成像可以进行的深度。在一些实施方案中，检测物镜的WD在0.1至100mm的范围内，诸如6mm至8mm。
在一些实施方案中，***可包括两个检测光束路径。在某些实施方案中，两个检测光束路径可用于从相对侧来对样品同步成像，由此允许从一侧对样品的一半进行成像，并且从另一侧对样品的另一半进行成像。这个实施例使得可进行成像的样品尺寸增加两倍，因为这两个物镜的组合的总体工作距离通过第二检测光束路径中的第二物镜的添加而增加两倍。
如以上概述，本发明各方面包括光学均匀样品操纵组件，所述光学均匀样品操纵组件被配置成在光学均匀环境中包含样品。“光学均匀”是指所述环境中各种材料的折射率(RI)相匹配或类似，以使得行进通过光学均匀环境的光束由于穿过其中行进的材料的RI的任何变化而受到非实质性的影响。
在一些实施方案中，光学均匀样品操纵组件包括将样品室限定为具有打开顶部的箱形的底部或基底以及外壁。在一些实施方案中，将透镜从一个或多个照明光束路径设置在外壁的一部分之上或之中，以使得从照明光束路径发出的光通过透明窗直接进入样品室的内部部分中。在一些实施方案中，透明窗由与光学均匀环境的RI匹配的材料制成。在一些实施方案中，透明窗由例如石英盖玻片制成。在一些实施方案中，检测光束路径的检测物镜被设置在外壁的一部分之上或之中。在一些实施方案中，检测物镜相对于照明光束路径来说以正交关系定位(例如，相对于照明光束路径来说以90°的角度定位)。
在一些实施方案中，光学均匀样品操纵组件包括xyz-θ样品安装件，所述xyz-θ样品安装件被配置成使样品在多个方向中的任一方向上移动，包括x、y和z方向以及角度或旋转方向。在一些实施方案中，xyz-θ台安装件具有较大行程范围并且被配置成在x、y和z方向中的每一方向上移动至少45mm。在一些实施方案中，xyz-θ台安装件被配置成使样品在角度或θ方向上旋转完整360°。这样的xyz-θ样品安装件可从科学技术供应商处商购获得。
在一些实施方案中，所述***的光学器件被配置成相对于所述样品移动，而在一些实施方案中，样品操纵组件被配置成使所述样品相对于所述***的光学器件来移动。光学器件或样品操纵组件可例如按照循序渐进的方式或按照连续的方式来移动。在一些实施方案中，光学器件或样品操纵组件可按照同步方式移动，而在某些实施方案中，光学器件或样品操纵组件可按照非同步方式移动。
在一些实施方案中，光学均匀样品操纵组件的样品室用溶液填充。在一些实施方案中，所述溶液的RI与检测光束路径的检测物镜的样品的RI匹配。例如，在一些实施方案中，用于填充样品室的溶液为FocusClear或MountClear(均可从CelExplorer实验室商购获得)。在一些实施方案中，用于填充所述室的溶液为折射率范围为1.42一直到1.46诸如1.45的液体。在一些实施方案中，用于填充样品室的溶液为87％甘油。具有所需折射率范围的溶液可从供应商诸如Cargille实验室处商购获得。
在一些实施方案中，光学均匀样品操纵组件的样品室包括较小内室，所述较小内室的体积小于较大外部样品室的体积。例如，在某些实施方案中，所述内室为被配置成容纳用于进行分析的样品的吸收池。在某些实施方案中，由熔融石英制成的吸收池用作内室。在一些实施方案中，所述内室如上所述用溶液填充，所述溶液的RI与检测光束路径的检测物镜的样品的RI匹配。例如，在一些实施方案中，用于填充内室的溶液为FocusClear或MountClear(均可从CelExplorer实验室商购获得)。在一些实施方案中，用于填充内室的溶液为RI1.454，可从供应商诸如Cargille实验室处商购获得。在一些实施方案中，用于填充内室的溶液为87％甘油。在某些实施方案中，第一溶液可用于填充内室，并且另一种不同的溶液可以用于填充较大外室。例如，在一些实施方案中，所述内室用FocusClear填充，而所述外室用RI 1.454溶液或87％甘油溶液填充。
如以上概述，本发明各方面包括控制器、处理器和计算机可读介质，它们被配置或适配成控制或操作本发明的***的一个或多个组件。在一些实施方案中，***包括控制器，所述控制器如本文所述与所述***的一个或多个组件通信，并且被配置成控制所述***的各方面和/或执行本发明的***的一个或多个功能或操作。在一些实施方案中，***包括处理器和计算机可读介质，它们可以包括存储器介质和/或存储介质。在计算机可读存储器上作为计算机可读指令来实施的应用程序和/或操作***可由处理器执行以提供本文所述功能的一些或全部。
在一些实施方案中，***包括用户接口诸如图形用户接口(GUI)，所述用户接口被适配或配置成从用户接收输入并且如本文所述执行所述方法中的一个或多个。在一些实施方案中，GUI被配置成向用户显示数据或信息。
现在参照图1A，描绘了显微镜装置的一个实施方案。所描绘的显微镜装置包括第一和第二照明光束路径，其中每个照明光束路径均包括准直仪、遮板、照明滤光轮、光束扩展器、二维检流计扫描仪、扫描透镜(或f-θ透镜)、镜筒透镜、镜子和照明物镜。所描绘的显微镜装置还包括检测光束路径，所述检测光束路径包括sCMOS相机、镜筒透镜、发射滤光轮和定位在光学均匀样品操纵组件内的检测物镜。
现在参照图1B，描绘了光学均匀样品操纵组件的各种组件。图片a示出了可充当内部样品室的石英吸收池。图片b示出了定位在样品室基底的xyz-θ样品安装台。还示出了检测光束路径的检测物镜和两个照明光束路径的透镜。图片c示出了放在样品室内以形成内部样品室的吸收池。图片d示出了用RI 1.454液体填充的样品室。
现在参照图6，示出了控制电子器件框架和COLM零件的示意性概述。如图所示，控制计算机或处理器与所述***的各种组件(包括例如，检测光束路径中的sCMOS相机、照明光束路径中的激光控制器和各种附接组件)通信。
现在参照图8(图片a)，示出了多平面式COLM***的一个实施方案。如图所示，所述***包括两个照明光束路径和两个检测光束路径。照明光束路径被配置成从相对侧照明样品，并且检测光束路径被配置成从相对侧对样品进行成像。通过对两个检测臂在逐行读出方向上彼此略微偏离(约100微米就足够了，如图8(图片c)所示)进行操作来实现对多个平面的同时成像。
现在参照图9，示出了多平面式COLM***的照明光束路径的一个实施方案。如图所示，照明光束路径包括被配置成生成多个独立光片的多种组件。确切地，所描绘的实施方案被配置成生成四个独立光片。应当指出的是，本领域技术人员还可选择各种组件以便生成用于本发明的方法的不同数量的独立光片，如本文进一步描述。
现在参照图11，可以通过使用机动化回转镜以将照明光束重定向到两个不同配置来使两个检测路径扩展为四个检测路径，所述不同配置允许通过对应的检测臂对进行成像。
方法
本发明各方面包括可用于对大的完整组织样品进行成像的方法。在一些实施方案中，本发明的方法涉及：将样品放在光学均匀样品操纵组件的样品室中；执行校准程序以使光片与显微镜装置的检测焦平面在所述样品内的多个位置处对准以获取关于每个位置的对准参数；执行成像程序以从所述样品内的多个位置中的每个位置收集图像；以及使用每个位置的图像来构造所述样品的三维图像。现在将在下文进一步更详细地描述方法各方面。
如上所述，方法各方面涉及将样品放在光学均匀样品操纵组件中。在一些实施方案中，将样品放在样品安装台上，诸如被配置成使样品在任何方向上移动的xyz-θ样品安装台。在一些实施方案中，所述方法涉及：将样品放在光学均匀样品操纵组件的样品室中；以及将所述样品用溶液填充，所述溶液的折射率(RI)与所述样品的折射率匹配。在一些实施方案中，在执行本文所述的成像分析之前，可以准备样品以进行显微镜分析。在一些实施方案中，通过以下操作来制备样品：将所述样品利用多个水凝胶子单元固定；聚合所述水凝胶子单元以形成水凝胶包埋样品；以及清理所述水凝胶包埋样品。在国际专利申请No.PCT/US2013/031066中进一步描述了制备方法，所述专利申请的公开内容以引用的方式以其全文并入本文。
方法各方面涉及执行校准程序，所述校准程序用于使显微镜装置的检测焦平面与所述样品的利用光片来照明的照明平面对准。在一些实施方案中，所述校准程序涉及指定所述样品在所述z方向上的开始位置和结束位置。在某些实施方案中，所述校准程序涉及指定用于将所述样品在所述z方向上划分成多个平面的z步进值，其中每个平面均表示所述样品的二维区段或部分。在一些实施方案中，所述z步进值的范围为0.1μm至1mm，诸如1μm至5μm。
在一些实施方案中，所述校准程序涉及将样品以数学方式划分成多个拼贴。“拼贴”是指样品的离散部分的图像。当显微镜物镜的视场小于样品本身时，可能有必要在倾斜布置中收集多个图像层叠件，并且随后将这些拼贴缝合在一起以生成完整图像。在一些实施方案中，所述方法涉及：定义将限定拼贴数量的区域的两个相对拐角的坐标；以及设置用于收集拼贴图像层叠件的所需z步进值。在一些实施方案中，将区域选择作为彼此重叠范围为10％至50％，诸如15％至20％的拼贴。
校准程序各方面涉及获取关于样品内的多个位置中的每一者的对准参数。为了获取每个位置处的对准参数，使用通过在一个维度上移动光束而产生的光片来照明样品平面。所述样品的由光片照明的平面在本文称为“样品照明平面”或“照明平面”。通过在指定附近找到与样品照明平面与检测焦平面之间的最优对准相对应的最大图像质量测量值完成显微镜的检测焦平面与样品照明平面之间的对准。在一些实施方案中，图像质量测量为光焦点质量测量，所述光焦点质量测量包括傅里叶空间中的高频信号与低频信号的比。
所述校准程序产生与样品内的不同位置相对应的多个对准参数。通过在样品内的给定位置应用对准参数，在所述位置实现显微镜装置的检测焦平面与光片之间的最优对准。在一些实施方案中，z步进值(1mm)用于执行校准程序，并且样品内的两个相邻位置之间的线性插值用于确定所述两个相邻位置之间的某个位置处的对准参数。这样一来，可使用z步进值(1mm)来执行校准程序，并且可以将这些结果应用于整个样品以确定任何位置处的对准参数。在一些实施方案中，校准程序自动进行。在一些实施方案中，处理器执行多个指令，所述指令导致控制器执行所述校准程序并且获取样品的多个对准参数。
如上所述，方法各方面包括执行成像程序，所述成像程序使用对准参数以使显微镜装置的检测焦平面与样品的照明平面对准。在一些实施方案中，所述成像程序涉及：使显微镜装置的检测焦平面与样品的照明平面对准；利用来自光源的光束来照明照明平面的线性部分；以及利用相机来从所述照明平面的所照明的线性部分获取多个所发射的光信号。在某些实施方案中，显微镜装置的检测焦平面与样品的照明平面的对准同步，以使得在检测焦平面与照明平面对准的同时，实施照明平面的照明。这样一来，仅仅样品的正主动成像的部分被照明，由此使得样品中的信号的可能由于过度照明而引起光致漂白减少。
在一些实施方案中，成像程序涉及将来自光源的光束定向成扫过照明平面并且由此照明所述照明平面的多个线性部分。在一些实施方案中，当光束扫过照明平面时，从照明平面的每个不同线性部分发出的多个光信号被相机捕获，从而产生样品的与照明平面一致的二维图像。在一些实施方案中，样品的照明平面受到照明的时间段范围为1毫秒(ms)至1秒，诸如5ms至100ms。
在一些实施方案中，所述方法涉及将多个独立光片定向为照明样品的不同部分。例如，在一些实施方案中，两个或更多个光片用于从样品的相对侧照明样品。在一些实施方案中，多个光片用于照明样品，诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或多达八个或更多个光片。在一些实施方案中，单个光片用于通过使光片从一个位置到另一个位置快速移动或“切换”而照明样品的两个或更多个不同部分。
在一些实施方案中，照明程序进一步涉及使样品在z方向上移动，以使得光片照明新的照明平面，并且重复成像程序以生成样品与新照明平面一致的另一二维图像。在一些实施方案中，当光片和检测物镜移动以对新照明平面进行成像时，样品保持静止。在一些实施方案中，成像程序涉及使用于照明样品的光学器件(例如，照明光束路径中的物镜)和光片同时移动。在一些实施方案中，成像程序涉及通过样品操纵组件来使样品以所定义速率连续地移动，以使得检测光束路径中的相机在样品的各个平面受到照明时，对所述平面连续地进行成像。上述方法中的任一种可以相对于任何给定光片来实现。这样，在COLM***中使用多个光片可用于增大具体样品的成像程序的总体速度并且增大可使用本发明的***和方法进行成像的样品的尺寸。
在一些实施方案中，照明程序产生样品的多个二维图像，各自与样品的一个不同照明平面相对应。在一些实施方案中，成像程序自动进行。在一些实施方案中，处理器执行多个指令，所述指令导致控制器执行所述成像程序并且获取样品的多个二维图像，各自与样品的一个不同照明平面相对应。
在一些实施方案中，成像程序进一步涉及多个二维图像的数据处理以形成样品的三维图像。在一些实施方案中，可将样品的两个或更多个不同的二维图像组合或“缝合”在一起以形成样品平面的单个二维图像。例如，如上所述，当样品使用两个或更多个不同的独立光片进行成像时，从每个光片获得的图像可以组合起来以形成与样品的给定平面相对应的单个二维图。
三维重建软件是可商购获得的，并且可用于将拼贴图像缝合在一起和/或将多个二维图像重建为一个三维图像。可商购软件程序包括来自Imaris、Bitplane和Amira的软件程序以及开源软件诸如Fiji、XuvTools、Vaa3D plugin和TeraStitcher中的缝合插件。在一些实施方案中，可使用商业软件诸如Imaris和Amira中的具体模块或者利用开源工具诸如Neuromantic来在包含神经组织的样品中进行神经元形态的手动或半自动跟踪。
现在参照图7，示出了方法的一个实施方案的方框流程图。在所示实施方案中，所述方法包括：将样品放在光学均匀样品操纵组件中；对所述样品执行校准程序以获取多个对准参数；使用所述对准参数来对所述样品执行成像程序；以及使用在成像程序期间所获取的图像来构建整个样品的三维图像。
现在参照图8(图片b)示出了一种用于获得大的完整样品的高质量深度图像的方法的一个实施方案。如图所示，两个独立平面是从相对的检测臂同时或连续成像的，所述两个独立平面利用两个对准的光片来照明(其中每侧一个光束，照明两个不同的平面；或者每侧两个光束，其中来自每个平面侧的一个光束照明相同的平面并且剩下的一个光束照明另一平面)。由每个光片生成样品的二维图像。图片b展示出由两个相对检测臂进行成像的同一平面的图像。所述检测臂可以精确地对准(例如，通过亚微米精度)。图片b展示从略微失准壁获得的图像，以及在X或Y方向上可以叠加的较小校正。可使用这种方法对较大样品进行成像，因为这两个物镜的组合的总体工作距离通过第二检测光束路径中的第二物镜的添加而增大两倍。
现在参照图8(图片c)示出了增大成像速度的各种方法。如图所示，光片的较快切换可用于照明两个独立平面，这用于增大总体成像速度。类似地，同时多平面化成像也可用于增大成像过程的总体速度。不间断样品成像，其中多个光片连续地移动穿过样品或样品连续地移动穿过多个光片同时连续地获取图像也可用于增大成像过程的总体速度。另外，步进式光学z扫描可通过多个光片来使用以便对样品的不同光学平面连续地进行成像。单向和双向同步照明和检测也可用于增大成像过程的总体速度。在双向同步照明和检测中，两个或更多个独立光片用于照明样品的不同部分并对其进行成像，如图8(图片c)所示。在不同方向上移动的多个光片的使用会增大成像过程的总体速度。
现在参照图11，示出了一种增大轴向(z分辨率)的方法。通过从四个独立的、正交设置的信号检测臂对样品进行成像，从四个正交视图获取3D图像。通过融合这四个图，实现了轴向分辨率(z-分辨率)的改进。图11示出了两个可自动切换配置，其中样品为通过一组两个检测臂，并且随后通过检测臂的正交布置部件而获得的第一图像。所述切换使用快速、精确的回转镜来执行，这反映了激发光或允许所述激发光通过而不受阻碍。
应用
本领域技术人员能够使用本发明的方法和***来对任何生物组织进行成像。方法和***可用于对来自任何植物或动物的试样进行成像，例如脊椎动物和无脊椎动物，例如昆虫、蠕虫、爪蟾、斑马鱼、哺乳动物，例如马、牛、羊、犬、猫、鼠科动物、啮齿动物、非人类灵长类动物或人类。所述试样可具有任何组织类型，例如造血组织、神经***组织(中枢或***)、神经胶质组织、间质组织、皮肤组织、粘膜组织、基质组织、肌肉组织(心肌、骨骼肌或平滑肌)、脾脏组织、网状内皮组织、上皮组织、内皮组织、肝组织、肾组织、胰腺组织、胃肠道组织、肺组织、成纤维细胞组织和其他细胞类型。在一些情况下，试样为有机体，例如，蠕虫、昆虫、斑马鱼或发育胚胎。在其他情况下，试样为完整器官，例如，啮齿动物的全脑。在其他情况下，试样为器官的一部分，即，活体组织切片，例如移植组织的活体组织切片。所述试样可以进行新鲜分离或保存，例如，急速冷冻。所述试样可具有“正常”病理学，或可显示异常或疾病有关病理学的症状。此类试样的示例包括从肿瘤或肿瘤相关组织、病变组织等获得的那些试样。这样，本发明的方法和***可用于组织试样的病理学分析。
本发明的方法和***可以结合制备微生物试样的技术一起用于显微镜分析。在一些实施方案中，所述方法涉及通过以下操作来制备进行本发明的成像分析的样品：将样品利用多个水凝胶子单元来固定；聚合所述水凝胶子单元以形成水凝胶包埋样品；以及清洗所述水凝胶包埋样品。可在国际专利申请No.PCT/US2013/031066中找出关于制备显微镜分析所用试样的进一步细节，所述专利申请的公开内容以引用的方式以其全文并入本文。如本文所使用，术语“清晰度”指的是如PCT/US2013/031066中所公开的一种制备分析用生物试样的方法。
本发明的方法和***具有多种用途。例如，本发明的方法可以应用于中枢神经***的连接性研究。如本文所使用的“连接性”一般是指：神经元之间的连接，包括单细胞水平上的连接(例如，突触、轴突末端、树突棘等)；以及神经元组与CNS区域之间的连接，作为主要轴突束，例如，胼胝体(CC)、前连合(AC)、海马连合(HC)、锥体交叉、锥体束、外囊、内囊(IC)、大脑脚(CP)等。全脑和/或脊髓试样或其区域(例如，大脑(即，大脑皮层)、小脑(即，小脑皮质)、前脑腹侧区(例如，纹状体、尾状核、壳核、苍白球、伏隔核；隔核、丘脑底核)；丘脑和下丘脑的区域和核；深部小脑的区域和核(例如，齿状核、球状核、栓状核、顶核)和脑干的区域和核(例如，黑质、红核、脑桥、橄榄核、脑神经核)；以及脊柱区域(例如，前角、侧角、后角))可以在死后之别并且可以使用本发明的方法和***(例如，所获得的、所存储的、所再现的、所使用的和所致动的)来对其中的神经元的连接性进行显微镜分析(例如)以便提供脑(例如，人脑)在死后的完全连接性。这样的研究极大地有助于理解大脑是如何发展的以及在健康和疾病过程中如何作用并且有助于理解认知和人格的基础。
再例如，本发明的方法和***可用于诊断或监测疾病。如本文所使用的“诊断”一般包括：受试者对于疾病或疾患的易感性的预测；关于受试者目前是否受到疾病或疾患影响的确定；受到疾病或疾患影响的受试者的预后(例如，癌变状态的识别、癌症阶段、患者死于癌症的可能性)；受试者对疾病或疾患治疗的反应性的预测(例如，对于例如异基因造血干细胞移植、化学治疗、放射治疗、抗体治疗、小分子化合物治疗的肯定响应、否定响应、根本无响应)；以及疗法的使用(例如，检测受试者的病况以提供关于治疗效果或效力的信息)。例如，活体组织检查可根据癌组织来准备并且使用本发明的方法和***进行显微镜分析以确定癌症的类型、癌症发展的程度、癌症是否对治疗性干预作出响应等。再例如，活体组织检查可根据病变组织(例如，肾、胰腺、胃等)来准备并且使用本发明的方法和***进行成像以确定组织的病况、疾病发展的程度、治疗成功的可能性等。术语“治疗(treatment/treating)”等在本文一般是指获得所需的药理学和/或生理效应。所述效果在完全或部分防止疾病或症状方面可以是预防性的和/或在完全或部分治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物的任何疾病治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未诊断为患有疾病的受试者发生疾病；(b)抑制疾病，即拦阻疾病的发展；或(c)缓解疾病，即导致疾病消退。可以在疾病或损伤开始之前、期间或之后施用治疗剂。在治疗使不期望的患者临床症状稳定或减少的情况下，持续疾病的治疗特别引人关注。所希望的是，在受影响组织的功能完全损失之前，执行这种治疗。所希望的是，本发明的治疗在疾病症状期被施用，并且在某些情况下，在疾病症状期之后被施用。术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文可互换使用并且指的是需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。
类似地，本发明的方法和***可用于监测组织移植物以确定受试者对移植器官/组织诸如心脏、肾脏、肝脏或其他器官的接受程度。在这样的情况下，移植器官的活体组织检查可以使用本发明的方法和***进行显微镜分析以寻求例如组织完整性、组织血管化、免疫细胞的渗透等。
本发明的方法和***还提供一种可用于针对它们对组织或疾病的效果而选择候选治疗剂的***。例如，受试者例如小鼠、大鼠、狗、灵长类动物、人类等可与候选试剂接触，可制备器官或其活体组织切片，并且可使用本发明的方法和***对所制备的试样进行显微镜分析以寻求一个或多个细胞或组织参数。参数为细胞或组织的可量化组分，具体来说，可在高吞吐量***中根据需要精确地测量的组分。参数可以是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定簇、受体、蛋白质或它们的构象或转译后修饰、脂质、糖类、有机或无机分子、核酸，例如，mRNA、DNA等或源自细胞组分或其组合的一部分。虽然大多数参数提供定量读出，但在某些情况下，半定量或定性结果将是可以接受的。读出可以包括单个确定值，或可以包括平均值、中值或方差等。典型地，从大量同样的分析中获得关于每个参数的参数读出值的范围。可变性是所期望的并且通过利用一种用于提供单个值的常见统计方法使用标准统计方法将获得测试参数集中每一者的值范围。因此，例如，一种这样的方法可以包括检测细胞存活力、组织血管化、免疫细胞浸润物的存在、改变疾病进展的效力等。在一些实施方案中，筛选包括将已进行分析的参数与来自控制或参考样品(例如由并不与候选试剂接触的受体以类似方式制备的试样)的参数进行比较。筛选所用的感兴趣候选试剂包括已知的和未知的化合物，包括众多化学类型，主要是有机分子，所述众多化学类型可包括有机金属分子、无机分子、基因序列等。感兴趣候选试剂还包括例如核酸、对siRNA、shRNA、反义分子或miRNA编码的核酸或者对多肽进行编码的核酸。本发明的一个重要方面是评估候选药物，包括毒性测试等。
本发明的方法和***还可用于使以下各项可视化：基因编码标记物在全组织中以亚细胞分辨率的分布，例如，染色体异常(倒位、复制、易位等)；基因杂合性的损失；指示疾病或健康倾向的等位基因的存在；对治疗作出响应的可能性；血统；等。此类检测可以用于例如如上所述在个体化用药和亲子鉴定研究中诊断和监测疾病。
实施例
从上文提供的公开内容可以理解，本发明具有广泛多种应用。因此，提供以下实施例是为了给本领域技术人员提供如何实施并且使用本发明的完整的说明和介绍，而不是要限定本发明人所认为的本发明的范围，也不是要将下面的实验作为所进行的所有或仅有的实验。本领域技术人员容易认识到，可以改变或调整各种非关键参数以便产生相似的结果。因此，提供以下实施例是为了给本领域技术人员提供如何实施并且使用本发明的完整的说明和介绍，而不是要限定本发明人所认为的本发明的范围，也不是要将下面的实验作为所进行的所有或仅有的实验。已经努力确保所用数值(例如，量、温度等等)的精确性，但是应说明某些实验误差和偏差。
实施例概述
如上所提供，在光片显微术中，从侧面利用薄光片照明样品，并且利用焦点内正交布置的物镜检测所发出的光信号(例如，荧光信号)。通过将照明限于所选择的一个平面而实现光学断层显微术，这允许使用快速CCD或sCMOS相机来同时捕获完整图像，并且导致成像速度增大。此外，光片显微术通过将照明限于感兴趣平面而使得光致漂白(图5)最小化。光片显微术的这些性质适于对例如通过CLARITY过程而产生的透明样品进行成像。经过CLARITY优化的光片显微术(COLM)(图1A至1D)允许使用经过CLARITY优化的物镜(图2、3、4B)而对透明样品例如小鼠脑(>5mm)的整个深度以高分辨率进行成像并且较大透明体积的高速收集导致光致漂白大大地减少(图2、3)。两个检测臂允许提高较大深度范围内的成像质量，因为样品的一部分从离其最近的检测臂进行成像。(图10，图片b，c和d)。
材料和方法
反应物和样品
水凝胶单体(HM)溶液通过将以下各项混合来制备400ml的HM溶液：40mL的40％丙烯酰胺(Bio-Rad，目录号161-0140，4％最终浓度)；10mL的2％双丙烯酰胺(Bio-Rad，目录号161-0142；0.05％最终浓度)；40mL的10X PBS；100mL的16％PFA(电子显微镜科学，目录号15710-S；4％最终浓度)；210mL的蒸馏水；以及1g的VA-044热引发剂(Wako，目录号VA-044；0.25％w/v最终浓度)。所有试剂都保存在冰上。将40mL的HM溶液分装到50mL的离心管中并且在需要时保存在-20℃下。HM溶液中的丙烯酰胺和双丙烯酰胺浓度可按比例减少以加速清洗过程。成功地使用0.5％/0.0125％丙烯酰胺/双丙烯酰胺的范围高达4.0％/0.05％的浓度；然而，当清洗速度增大数倍时，可以采用较低的丙烯酰胺/双丙烯酰胺浓度来就此开始。
SDS/硼酸清洗缓冲液(SBC)制备由以下各项组成的备料：20％的SDS(Sigma，目录号L337或Amresco，目录号0837；在H2O中)；以及1M的硼酸缓冲液(pH调整为8.5)。通过将20％的SDS和1M的硼酸缓冲液在蒸馏水中稀释5倍来新鲜制备最终清洗缓冲液。
其他反应物其他反应物使用如下：FocusClear(CelExplorer实验室)；定制折射率液体(RI 1.454，目录号1806Y，Cargille实验室)；清洗溶液(硼酸(Sigma，目录号B7901)；氢氧化钠小球(EMD，目录号SX0590-3)。
成像样品由成年Thy1-eYFP或WT小鼠制备成像样品。所有动物实验均在斯坦福大学机构审查委员会批准下进行。
分子标记
组织样品可具有荧光素的内源性转基因表达以标记样品中的分子和结构细节，但另外，免疫组织化学可用于标记感兴趣的结构和分子。
37℃下，将组织在PBST中彻底清洗至少1天(或对于全脑来说，在硼酸缓冲液/0.1％的Triton X-100中进行清洗)。将样品在一次抗体/PBST溶液(从1:50稀释开始)中在37℃下对于组织块来说温育2天，或对于整个完整大脑来说温育一周。大约1M的硼酸/0.1％的Triton X-100缓冲液(pH 8.5)也可替代PBST用于抗体温育以减少背景染色。对于1mm厚的块来说，将抗体在1mL溶液中利用进行温育或对于整个小鼠脑来说，在5mL溶液中进行温育，其中定期补充比例增大的抗体体积；例如，可以添加50μL的抗-TH Ab(10μl至20μl)，随后在大约1周内每两天再添加20μL。为了进行有效的免疫染色，需要较高的抗体浓度(1:20至1:100)，以确保深层渗透到组织中并且克服所述体积范围内的总抗体结合位点的巨大的总数量。成功免疫染色的另一个主要因素是在清洗期间完全移除脂质。
对于组织块来说，将一次抗体在37℃下利用PBST缓冲液冲洗一天，并且对于全脑来说，2至3天(每4至6个小时重新缓冲)。将样品利用所需二次抗体在PBST中在37℃下对于组织块来说温育2天(1:50-1:100)或对于全脑来说，高达1周。应当指出的是，在这一步，还可以添加核标记染料，诸如DAPI。将二次抗体利用PBST在37℃下对于组织块来说冲洗1天并且对于全脑来说冲洗2至3天。为了准备进行成像，将组织转移到FocusClear中进行折射率均匀化。在通过将组织在清洗缓冲液中在60℃下过夜温育后，通过洗脱(移除)先前标记而执行多轮标记，接着进行另一轮标记。
设备装置
经过CLARITY优化的光片显微镜
光片显微镜由以下各项组成：一个或多个标准宽场检测光学臂，所述光学臂包括检测物镜、镜筒透镜和相机；以及一个或多个正交布置的独立照明壁，所述照明壁包括用于生成静态光片的低NA物镜、镜筒透镜和任一个柱面透镜或者用于利用高斯或贝塞尔光束而形成动态光片的检流计扫描仪/f-θ透镜。
开发了经过CLARITY优化的光片显微镜(COLM)以使透明样品与光片显微镜的兼容性最大化，所述显微镜使用了以下各项：CLARITY物镜(25X和10X，奥林巴斯)；快速sCMOS相机；双轴检流计扫描仪；以及f-θ透镜；低NA物镜，其用于使用高斯光束生成动态光片；经过优化的样品室(在以下部分详述)；以及xyz-θ样品安装台，其在每个维度上提供45mm的较长行程范围以允许较大样品进行成像(图1A至1D)。
使用COLM进行同步照明检测以改进成像质量，尤其是在较高的深度处(图1C)，利用在下一代sCMOS相机中可用的单向读出(与标准双向形成对照)模式。使扫描光束(其形成了动态光片)与所发射信号的单向单行读出同步进行，从而产生虚拟共焦狭缝布置，这拒绝了由于样品中的更深散射而引起的焦点外平面信号。COLM中的自动对准参数校准(使用线性适应性进行)纠正了整个样品空间上的失准伪影(图1D)。COLM的控制电子器件设计和零件在图6中概述。FPGA逻辑用于对显微镜的各种零件进行控制和同步化。
COLM的样品安装设备
COLM的一个组件为经过CLARITY优化的样品安装策略，使得沿着一个或多个检测通路的光学不均匀性最小化(图1B)。将透明的整个小鼠脑(或任何较大的透明完整组织诸如脊髓)安装在由熔融石英玻璃制成的、用FocusClear填充的吸收池中(标准吸收池用于进行分光光度计测量)；熔融石英的折射率(大约1.458)与FocusClear的折射率几乎完全相同。使用底部适配器(图1B)来将样品吸收池安装到xyz-θ台上，在样品室内部(图1B)。随后将大得多的室用相对经济型的定制折射率匹配液体(RI 1.454，目录号1806Y，Cargille实验室)填充，从而产生光学均匀的样品操纵***。RI液体每半升花费几百美元，这足以填充样品室(并且超过一个数量级，比FocusClear更便宜)并且可以重复使用很多次。替代地，所述室也可用87％的甘油填充。
进行数据分析所用的计算工作台
由于图像数据尺寸非常大，因此重要的是，使用具有丰富RAM、多芯CPU和优良图形卡的计算工作台。这里示出的数据在具有以下配置的工作台上进行处理：英特尔服务器板S2600CO；两个Intel Xeon E5-2687W 8C CPU；大约130GB的DIMM RAM；大约8TB的硬盘(Seagate Savvio 10K)；NVidia K5000图形卡；以及高分辨率监测器(NEC MultiSyncPA301W 30，2560x1600英寸)。
成像和分析
经过CLARITY优化的光片显微术
将样品(例如，完整小鼠脑)安装在适当尺寸的石英吸收池中，以使得样品在成像时保持静止(图1B)。应当指出的是，很多不同尺寸的石英吸收池从供货商(诸如StarnaCells)处获得；小块丙烯酰胺凝胶(或类似的透明材料)可用于在与成像侧相对的一侧上提供结构填料。对于成年小鼠脑来说，可以取决于年龄而使用具有填料的10x 5mm或10x 10mm基底吸收池。
所述吸收池用FocusClear填充，刚好足以覆盖整个样品。使用适配器而将吸收池安装在xyz-θ台上(图1B)。气泡或灰尘颗粒得以避免，因为它们干扰了成像。
透明样品(诸如完整成年小鼠脑)被安装在用折射率匹配溶液诸如FocusClear填充的石英吸收池中。石英玻璃的折射率(大约1.458)与FocusClear的折射率(大约1.454)几乎相同。底部适配器用于将吸收池附接到样品室中的xyz-θ台，所述样品室随后用折射率匹配液体(大约1.454)填充。这导致产生具有最小折射率过渡边界的光学均匀样品操纵***。
拼贴参数设置如下。一些样品比所使用物镜的视场更大，并且因此需要拼贴图像层叠件以覆盖整个样品。为了指定拼贴的数量，定义所感兴趣区域的两个相对拐角的坐标，其中拼贴覆盖20％或更多。通过从样品找出包含有用信号的第一图像帧和最后一个图像帧来指定层叠件的开始位置和z位置，并且随后设置所需z步进值。
调整光片与检测焦平面之间的任何失准，所述失准(尤其是在较大样品成像期间)可能引起图像混乱不清。在如上所定义的整个样品空间内，优化光片和焦平面对准参数。通过在全部拼贴的每毫米组织处优化这些参数，并且随后在这些毫米步进之间线性地***z步进的值来实现这种效果。通过在指定附近找出与图像质量度量相对应的最大值来识别最优参数；为使这一过程自动化，实施光学焦点质量测量，作为傅里叶空间中的高频信号与低频信号的比。
成像实验已启动并且数据收集如下。从相对侧形成两个光片并且利用焦点内检测物镜、镜筒透镜和sCMOS相机来对所发射的荧光进行成像。照明和发射滤光轮(机动化)用于分别生成定义明确的激发信号和发射信号带。
通过使扫描光束与sCMOS相机芯片的单向读出同步进行来实现同步照明和检测，导致产生虚拟狭缝效应，所述虚拟狭缝效应允许大幅提高成像质量，如通过COLM并且通过常规光片显微术(图1C)而从相同平面获取的图像所示。通过COLM获取的图像中的视场的信号强度分布与通过常规光片显微术(图1C，右边的图)所获取的图像相比得到改进。
为了调整较大透明样品的折射率均匀性，在如上所述开始成像实验之前，利用检测物镜的焦平面通过线性适应性校准程序来纠正照明失准。
3D重建和分析
利用商业软件(例如，来自Imaris、Bitplane或Amira)或经由免费/开源项目(例如，Vaa3D，www.vaa3d.org)执行三维重建。利用TeraStitcher执行拼贴缝合。可以使用商业软件诸如Imaris和Amira中的特定模块或利用开源工具诸如Neuromantic来执行对神经元形态的手动或半自动跟踪。
实施例1：使用COLM对整个小鼠脑的超高速成象
将Thy1-eYFP小鼠脑用0.5％丙烯酰胺单体溶液灌注，并且在37℃下通过轻轻摇动而被动地透明化。使用20ms的相机曝光时间，并且使用折射率1.454的液体作为浸渍介质。使用10X的0.6NA物镜在大约4小时内获取整个数据集。通过连续地移除背侧封闭图像(图2，图片b、c和d)而使完整小鼠脑体积的内部细节可视化。图10(图片b、c和d)呈现了使用两个独立检测臂COLM实现方式来对整个中枢神经***(所附接的大脑和脊髓)进行成像的一个示例。
实施例2：使用COLM对透明大脑的快速高分辨率成像
将Thy1-eYFP小鼠脑用0.5％丙烯酰胺单体溶液灌注。使用具有25x放大率的完整透明大脑来获取3.15mm x 3.15mm x 5.3mm体积。在大约1.5小时内获取完整的图像数据集；为获得最优对比度，在图片之间线性地调整放大图像的LUT。获得来自图3(图片c)的由矩形限定的放大视图(图3，图片a，b)。获得50微米厚体积的最大强度投影(图3，图片d至i，通过框和箭头的累进示出)。使用20ms的相机曝光时间；使用折射率1.454的液体作为浸渍介质。
实施例3：透明组织的分子查询
将整个小鼠脑用4％丙烯酰胺单体溶液灌注且被动地透明化，并且进行免疫染色以标记所有的小清蛋白(PV)阳性神经元。利用25X物镜使用COLM来对完整大脑进行成像。在样品中在不同的深度观察到标记过的细胞(图4B)。
经过CLARITY优化的物镜用于利用共焦显微术(图4A和4C)来对透明的小鼠脑组织块进行成像。将小鼠脑用4％丙烯酰胺单体溶液灌注并且利用抗PV抗体进行免疫染色。利用经过CLARITY优化的水浸物镜(10X，0.6NA，3mm)进行的共焦显微术用于获取1mm厚的组织块的高质量图像，并且对所述图像进行处理以生成PV阳性神经元(图4A)的最大强度投影图像。
也可以在来自透明小鼠脑的相同组织块中利用经过CLARITY优化的水浸物镜(10X，0.6NA，3mm)执行多轮免疫染色和共焦成像。使用1％的丙烯酰胺单体溶液来灌注小鼠脑。在针对PV进行第一轮免疫染色(图4C，左图片)后，通过在60℃下在清洗缓冲液中温育而对标签洗脱过夜(大约12小时)(图4C，中间图片)。随后将组织块利用抗PV抗体进行免疫染色(图4C，右图片)。也对第一轮中存在的DAPI成功洗脱。所有所示图像均表示最大Z投影。
实施例4：共焦显微术、双光子显微术和光片显微术的比较
共焦显微术(图5，左列)通过在光电倍增管(PMT)的前面使用针孔而实现光学断层显微术。双光子显微术(图5，中间列)使用以下事实，即仅仅两个光子(具有较长波长)的同时吸收会导致荧光信号发射，在样品中的最高光强度点即焦平面处更有可能发生这种事件。光片萤光显微术(图5，右列)通过将照明选择性地限于感兴趣平面而实现光学断层显微术。共焦显微术和双光子显微术为点扫描并且因此固有地缓慢，尽管光片显微术使用快速sCMOS/CCD相机来对选择性照明的焦平面进行成像，从而产生2至3数量级的较快成像速度和最小光致漂白。
对透明样品与光片的兼容性进行了评估并且在最小光致漂白的情况下实现了大于2数量级的较快成像速度；例如，将完整小鼠脑使用10X放大率的物镜在大约4小时内进行成像并且使用25X物镜在大约1.5天内进行成像，这分别与共焦显微术情况下的许多天和许多月形成对照。经过CLARITY优化的光片显微术(COLM)尤其适于对利用转基因和组织化学方法标记的较大组织样品进行查询。使用新的显微方法经由CLARITY而生成的增大的采集速度和较高的数据质量，结合通过本文所描述的并行和高效的组织转型协议而本身启用的高速CLARIT处理，一定限定用于对较大且完全组装的组织进行结构和分子查询的通用高效平台。
尽管为了清楚理解的目的前述发明已经通过说明和实例的方式详细描述，但是鉴于本发明的教导对本领域技术人员显而易见是，在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对本发明作出某些改变和修改。
因此，以上仅仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，希望此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由随附权利要求体现。

Claims (54)

1.一种显微镜装置，包括：
照明光束路径，所述照明光束路径包括光源；
检测光束路径，所述检测光束路径包括相机；
光学均匀样品操纵组件，所述光学均匀样品操纵组件包括具有一定体积的样品室；
控制器；
处理器；以及
计算机可读介质，所述计算机可读介质包括指令，所述指令在由所述处理器执行时，导致所述控制器：
执行校准程序以获取关于放在所述样品室中的样品的多个对准参数；以及
执行成像程序，所述成像程序使用所述对准参数生成所述样品的三维图像。
2.根据权利要求1所述的显微镜装置，其中所述光学均匀样品操纵组件包括xyz-θ样品安装台。
3.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述xyz-θ样品安装台在每个维度上具有至少45mm的行程范围。
4.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述样品室用溶液填充。
5.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述光学均匀样品操纵组件包括内室，所述内室具有一定体积，所述体积小于所述样品室的所述体积。
6.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述内室为吸收池。
7.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述吸收池用溶液填充。
8.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述吸收池包括熔融石英。
9.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序包括指定样品在所述z方向上的开始位置和结束位置。
10.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序包括指定z步进值。
11.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序包括将样品以数字方式划分成多个拼贴。
12.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序包括使光片与检测焦平面在样品内的多个位置处对准以获取每个位置的对准参数。
13.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序包括通过来自两个相邻位置的线性插值而获取关于所述样品内的位置的对准参数。
14.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中使所述光片与所述检测焦平面对准包括使图像质量测量最大化。
15.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述图像质量测量为光焦点质量测量。
16.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述光焦点质量测量包括傅里叶空间中的高频信号与低频信号的比。
17.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述校准程序自动进行。
18.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述成像程序包括：
使用对准参数来使所述显微镜的检测焦平面与所述样品的照明平面对准；
利用所述光源来照明所述照明平面的线性部分；以及
利用所述相机沿着所述照明平面的所照明的线性部分来捕获多个所发射的光信号。
19.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中使所述显微镜的所述检测焦平面与所述照明平面对准是与照明所述照明平面的所述线性部分同步。
20.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述成像程序进一步包括：
将所述光源定向成照明所述照明平面的多个不同的线性部分；以及
沿着所述照明平面的所述不同线性部分中的每一者来捕获多个所发射的光信号以利用所述相机形成所述样品的二维图像。
21.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述成像程序进一步包括：
从所述样品内的不同照明平面收集多个二维图像；以及
汇集所述二维图像以形成所述样品的三维图像。
22.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述成像程序自动进行。
23.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述相机为CCD相机或sCMOS相机。
24.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述检测光束路径包括检测物镜。
25.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述检测物镜的折射率与样品的折射率匹配。
26.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述照明光束路径包括低数值孔径物镜，所述低数值孔径物镜被配置成生成动态光片。
27.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述装置包括两个照明光束路径。
28.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述装置包括两个检测光束路径。
29.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述两个照明光束路径被配置成从所述光学均匀样品操纵组件的相对侧照明所述样品。
30.根据以上权利要求中任一项所述的显微镜装置，其中所述检测光束路径中的一者或多者相对于所述照明光束路径中的一者或多者来说以正交关系定位。
31.一种使用显微镜装置来对样品进行成像的方法，所述方法包括：
将所述样品放在光学均匀样品操纵组件中的样品室中；
进行校准程序以使一个或多个光片与显微镜装置的一个或多个检测焦平面在所述样品内的多个位置处对准以获取关于每个位置的对准参数；
进行成像程序以从所述样品内的所述多个位置中的每一者收集图像，其中所述成像程序包括：
将所述对准参数应用于每个位置；以及
同时利用光片照明所述位置并捕获所述位置的图像；以及
使用每个位置的所述图像来构建所述样品的三维图像。
32.根据权利要求31所述的方法，其中进行所述成像程序包括使用两个或更多个独立光片来同时照明所述样品的两个或更多个不同平面。
33.根据权利要求31所述的方法，其中进行所述成像程序包括使用单个光片的快速切换来同时照明所述样品的两个不同平面。
34.根据权利要求31所述的方法，其中已通过以下操作准备所述样品来进行显微镜分析：
将所述样品通过多个水凝胶子单元来固定；
聚合所述水凝胶子单元以形成水凝胶包埋样品；以及
清洗所述水凝胶包埋样品。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述样品包括生物组织。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述生物组织包括脑组织。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述样品包括完整器官。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述器官为脑、眼睛、心脏、肝、胰腺、肌肉、骨骼、肾脏或卵巢。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述样品包括完整有机体或发育胚胎。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，进一步包括将所述样品室用折射率与所述样品的折射率匹配的溶液填充。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的方法，其中所述校准程序包括指定所述样品在所述z方向上的开始位置和结束位置。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的方法，其中所述校准程序包括指定z步进值。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的方法，其中所述校准程序包括将所述样品以数字方式划分成多个拼贴。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的方法，其中所述校准程序包括使光片与检测焦平面在所述样品内的多个位置对准以获取关于每个位置的对准参数。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的方法，其中所述校准程序包括通过来自两个相邻位置的线性插值而获取关于所述样品内的位置的对准参数。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的方法，其中使所述光片与所述检测焦平面对准包括使图像质量测量最大化。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的方法，其中所述图像质量测量为光焦点质量测量。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的方法，其中所述光焦点质量测量包括傅里叶空间中的高频信号与低频信号的比。
49.根据权利要求31至48中任一项所述的方法，其中所述校准程序自动进行。
50.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中所述成像程序包括：
使用对准参数来使相机的检测焦平面与所述样品的照明平面对准；
利用所述光源来照明所述照明平面的线性部分；以及
沿着所述照明平面的所照明的线性部分来捕获多个所发射的光信号。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的方法，其中使所述相机的所述检测焦平面与所述照明平面对准与照明所述照明平面的所述线性部分同步。
52.根据权利要求31至51中任一项所述的方法，其中所述成像程序进一步包括：
将所述光源定向成照明所述照明平面的多个不同的线性部分；以及
沿着所述照明平面的所述不同线性部分中的每一者来捕获多个所发射的光信号以形成所述样品的二维图像。
53.根据权利要求31至52中任一项所述的方法，其中所述成像程序进一步包括：
从所述样品内的不同照明平面收集多个二维图像；以及
汇集所述二维图像以形成所述样品的三维图像。
54.根据权利要求31至53中任一项所述的方法，其中所述成像程序自动进行。
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