TWI425201B - 觀察厚組織三維結構之方法 - Google Patents
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Description
本發明係提供一種用於觀察厚組織三維結構之方法,更特定言之,是有關利用可增加組織透視程度的技術搭配顯微鏡影像擷取與組織移除技術,以觀察厚組織之三維結構。
生物組織的三維結構觀察對各種生物的研究有重大義意;在傳統技術上觀察厚組織三維結構之方法是使用組織切片技術,之後進行染色與影像擷取。透過由淺到深的一系列切片、分別染色與影像擷取後可由影像堆疊方式得到組織的三維影像。然而在任兩切片間的機械切除面會產生嚴重變形與破壞,無法經由堆疊而得到完整且正確的厚組織三維影像。
目前已知較進步的方法是利用光學澄清技術使組織透明化,如使用已揭露的FocusClear技術(參考美國第472216 B1號與中華民國第206390號專利),可將觀察清楚的深度推進到200至300微米(μm)。所謂光學澄清技術是將本來不透明的組織浸泡在可減少光散射的溶液中,因為此類溶液會置換組織中的水份,而且溶液的折射率比水份更接近組織的折射率,因此可減少光的散射,搭配使用共軛焦雷射顯微鏡已可將觀察清楚的深度推進到200至300微米(μm)。但是大部分的動物組織與植物組織的厚度卻仍遠超過此值;舉例來說,若腦神經的研究要從果蠅推展到小鼠甚至人體,它的厚深度就已超過目前所能清楚觀察的範圍。如何能找到方法觀察厚組織的三維結構便成了急需克服的問題。
我們提出一個方法來克服觀察的深度限制:利用可增加組織透視程度的技術,搭配先掃瞄再切除且移除平面深度淺於或相同於該階段最後掃瞄平面深度的概念,可在掃瞄過程中使用移除工具移除掃瞄過的組織,同時也可保留待掃瞄組織的完整性,如此重複進行掃瞄與移除的動作可將清楚觀察的組織厚度大幅推進,突破顯微觀察只能限於樣品表層薄片的限制。故對於生物科技的發展將帶來非常大的助益。
本發明係提供一種觀察厚組織三維結構之方法,包括:提供一厚組織,該厚組織經過光學澄清技術處理,如使用FocusClear(參考美國第472216 B1號與中華民國第206390號專利)技術處理或選用適當波長之光線以穿透該組織,以容許反映其結構的光訊號穿透該厚組織而可被顯微鏡擷取;一光學掃瞄顯微鏡與一組織移除裝置。該厚組織包含動物組織、植物組織、人造組織或生物材料,經包埋固定後,置於一基座之上。所使用之光學掃瞄顯微鏡包含共軛焦雷射顯微鏡、多光子雷射掃描顯微鏡等可擷取特定光學切片之光學顯微鏡。所使用之移除裝置包含機械式切除、雷射切除或化學腐蝕、燒灼等方法。
以該光學掃瞄顯微鏡自該厚組織表面開始擷取組織之影像,之後漸次增加該影像擷取裝置之影像擷取深度,以擷取組織表面以下各深度平面之影像。此處的擷取深度乃相對於光學掃瞄顯微鏡之物鏡而言,愈遠離物鏡處為深度愈深。由於形成組織深層影像之光訊號受到其上層組織散射之影響,組織漸深之處影像解析度漸差。當掃瞄至影像清楚之極限時,將移除平面定於其掃瞄平面上方某特定距離,然後除去移除平面以上的組織。此處影像清楚之極限乃根據使用者需求之影像解析度而定,掃瞄平面上方之特定距離亦根據使用者需求作調整,唯組織去除深度必須小於組織已掃瞄深度,使去除面產生的變形及破壞不影響待掃瞄組織的完整性,可維持後續掃瞄所擷取的組織影像與已掃瞄組織影像之連續性。若重覆掃瞄移除平面與已掃瞄平面間之區域,可作為後續影像重組之對齊依據。
執行複數次上述之掃瞄、擷取影像與使用該移除裝置移除厚組織移除平面上方組織的動作,即可擷取該厚組織全部深度之三維結構影像,以供後續重組該各層之影像以建構成該厚組織之三維結構影像。
本發明將以較佳實施例及觀點加以敘述,此類敘述係解釋本發明之結構及程序,僅用以說明而非用以限制本發明之申請專利範圍。因此,除說明書中之較佳實施例以外,本發明亦可廣泛實行於其他實施例中。
本發明係揭露一種觀察厚組織三維結構之方法;其實施方式如第1圖所示,先準備一厚組織10經過螢光染色後,將其用凝膠包埋固定(未繪示於圖上),利用一種光學澄清溶液(如上述之FocusClear技術)透明化該包埋後的厚組織後,置於基座20之上。上述之FocusClear光學澄清技術為已知技術,為避免模糊焦點,在此不加以贅述。使用光學掃瞄顯微鏡,例如共軛焦雷射顯微鏡(未繪示於圖上)掃瞄該厚組織10以擷取組織影像,上述共軛焦雷射顯微技術亦為已知技術,在此不加以贅述。共軛焦雷射顯微鏡之雷射30先掃瞄厚組織10之表面1001後,逐步往厚組織10之深層掃瞄,深層為距離該顯微鏡物鏡較遠處,以擷取不同深度平面之組織影像,以供後續建構為三維影像之用。當雷射30掃瞄深度逐漸增加,所擷取之影像解析度愈差,其原因主要是激發光被上層組織散射所致。
當雷射30掃瞄至厚組織10表面1001的下方深度T(舉例為200μm)時,為可清楚解析影像之極限,在此定義此極限地方為界面1002。此時厚組織10之淺層部分100,範圍為自表面1001到界面1002之地方,為可擷取清楚影像之部分;而厚組織10之深層部分101,範圍為自界面1002以下至基座20以上,為無法擷取清楚影像之部份。
使用一移除裝置,如機械式切片機、雷射切除或化學腐蝕、燒灼等方法,自距離厚組織10表面1001下方深度T’(舉例為150μm)的地方(如第2A圖所示),沿移除平面1003移除厚組織10之淺層組織。移除平面1003之深度T’必須小於淺層部分100之深度T,如例示移除平面1003之深度為150μm,而厚組織10淺層部分100深度為200μm,故當淺層部分100之影像被擷取完後,沿移除平面1003以上被移除掉之組織,其影像已在執行移除動作前被清楚擷取;是故,移除動作於切除平面所造成的破壞對後續待收集之組織影像不造成影響。
如第2B圖所示,為執行第一次移除後之厚組織10,其有一個新的表面1001,自此表面1001往下方同為深度T(舉例為200μm)的地方(範圍自表面1001到界面1002),是此移除後之厚組織10之新的淺層部分100;如前文所述,此淺層部分100是厚組織10可被擷取清楚影像的部分,又同前文所述之步驟,以雷射30掃瞄擷取淺層部分100之影像後,在表面1001下方深度T’(舉例為150μm)的地方,定義一新的移除平面1003,用以去除移除平面1003以上之組織。
施行如上述步驟數次之後,即可完全擷取厚組織10之各層面之影像,用以建構成厚組織10之立體影像。此厚組織10雖經數次的移除動作,然因移除面之深度T’(如150μm)淺於淺層部分100之深度T(如200μm),執行移除前,厚組織10之淺層影像已被擷取,故移除動作對組織所造成的破壞,不影響所擷取影像之完整性。因而所建構還原的立體影像為完整厚組織10的三維結構影像。
以下實施例說明如何決定出厚組織淺層100與深層101之界面1002以及移除平面1003;如第3圖所示,準備一經過一種光學澄清技術(如Focus Clear)處理過之厚組織10,組織厚度為D(舉例為600μm),置於一基座20之上。以共軛焦雷射顯微鏡先以厚組織10之表面1001為焦點平面(focal plane) 1001’,擷取其影像並開始往下擷取各深度平面之影像直到焦點平面1001’為距離表面1001下方4d的位置(舉例為200μm,如第4圖所示)。發現此深度平面為可解析清楚影像之極限時,即可定義此處之焦點平面1001’為厚組織10之淺層100與深層101之界面1002,而在界面1002以上各層之組織影像已被清晰地擷取。在界面1002之上方約d’處(舉例為50μm)定義出移除平面1003,在移除平面1003以上之組織將被移除。移除平面1003之決定原則是要在界面1002以上(包含與1002同一平面),目的是確保所去除組織的影像已被清晰地擷取,故移除面1003相對於界面1002並非一固定的距離,在極端情況移除面1003可與界面1002同一平面,上述實施例所舉之d’僅用於說明本發明之概念,非用於限定本發明。
以上敘述係為本發明之較佳實施例。此領域之技藝者應得以領會其係用以說明本發明而非用以限定本發明所主張之專利權利範圍。其專利保護範圍當視後附之申請專利範圍及其等同領域而定。凡熟悉此領域之技藝者,在不脫離本專利精神或範圍內,所作之更動或潤飾,均屬於本發明所揭示精神下所完成之等效改變或設計,且應包含在下述之申請專利範圍內。
10...厚組織
100...厚組織之淺層
101...厚組織之深層
1001...厚組織之表面
1001’...三維光學掃瞄顯微鏡之焦點平面
1002...厚組織淺層與深層之界面
1003...厚組織之移除平面
20...基座
30...三維光學掃瞄顯微鏡之雷射掃瞄
D...厚組織之厚度
d...焦點平面調整之間距
T...厚組織之淺層深度
T’...厚組織移除平面之深度
本發明可藉由說明書中之若干較佳實施例及詳細敘述與後附圖式而得以瞭解。圖式中相同之元件符號係指本發明中之同一元件。然而,應理解者為,本發明之所有較佳實施例係僅用以說明而非用以限制申請專利範圍,其中:
第1圖係說明一厚組織置於基座之上,厚組織分為淺層與深層之部分。
第2A圖係說明淺層被雷射掃瞄,擷取影像,並定義出切割面,準備去除移除平面上方之組織。
第2B圖係說明厚組織已執行第一次移除動作,雷射掃瞄更往下定義出新的淺層。
第3圖係說明準備一新的厚組織置於基座之上,並以雷射掃瞄最淺層之組織。
第4圖係說明焦點平面已調到可清晰擷取影像之極限,以定義出厚組織之淺層部分、深層部分、移除平面。
10...厚組織
100...厚組織之淺層部分
101...厚組織之深層部分
1001...厚組織之表面
1002...厚組織淺層與深層之界面
1003...厚組織之移除平面
20...基座
30...三維光學掃瞄顯微鏡之掃瞄
T...厚組織之淺層深度
T’...厚組織移除平面之深度
Claims (10)
- 一種觀察厚組織三維結構之方法,包括:提供一待掃瞄的厚組織,其中該厚組織經過光學澄清技術處理進而容許反映其結構的光訊號穿透;提供一光學掃瞄顯微鏡,用以擷取該厚組織之影像;提供一移除裝置,用以移除部分該厚組織;以該光學掃瞄顯微鏡自該厚組織之表面擷取該厚組織之影像,之後漸次增加該光學掃瞄顯微鏡之取像深度,以擷取該厚組織表面以下各深度平面之影像;以該光學掃瞄顯微鏡所擷取之各深度平面之影像清晰度決定出距離該厚組織表面之一掃瞄深度;在該掃瞄深度上方之一特定距離決定出一移除平面;以該移除裝置移除該移除平面以上之該厚組織後,繼續擷取該厚組織更深層之影像。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中先執行擷取影像後再移除部分該厚組織。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中該厚組織經過光學澄清溶液FocusClear處理。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中該厚組織包含動物組織、植物組織、人造組織或生物材料。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中該光學掃描顯微鏡包含共軛焦雷射顯微鏡、多光子雷射顯微鏡、或其他可擷取特定光學切片之光學掃瞄顯微鏡。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中該移除裝置工具包含機械式切除、雷射切除、化學腐蝕、燒灼。
- 如申請專利範圍第1項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中該掃瞄深度為觀察者定義所觀察清楚影像之極限。
- 一種觀察厚組織三維結構之方法,包括;提供一待掃瞄的厚組織,其中該厚組織容許反映其結構的訊號穿透;提供一光學掃瞄顯微鏡,用以擷取該厚組織之影像;提供一移除裝置,用以移除部分該厚組織;執行複數次如申請專利範圍1所述之決定該掃瞄深度、決定該移除平面與移除該厚組織之步驟,以擷取完整該厚組織之三維影像。
- 如申請專利範圍第8項所述之觀察厚組織三維結構之方法,其中先執行擷取影像後再移除該厚組織,且該移除平面之深度小於該掃瞄深度。
- 一種觀察厚組織三維結構之方法,包括:提供一待掃瞄的厚組織,其中該厚組織容許反映其結構的訊號穿透;提供一影像擷取裝置,用以擷取該厚組織之影像;提供一移除裝置,用以移除部分該厚組織;以該影像擷取裝置自該厚組織之表面擷取該厚組織之影像,之後漸次增加該影像擷取裝置之取像深度,以擷取該厚組織表面以下各深度平面之影像;以該影像擷取裝置所擷取之各深度平面之影像清晰度決定出距離該厚組織表面之一掃瞄深度;在該掃瞄深度上方之一特定距離決定出一移除平面;以該移除裝置移除該移除平面以上之該厚組織後,繼續擷取該厚組織更深層之影像。
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