CN106163491A - 口腔内细菌增殖抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明利用茶中所含成分提供一种优异的口腔内细菌增殖抑制剂。作为口腔内细菌增殖抑制剂的有效成分，使用茶黄素类化合物。作为茶黄素类化合物，可使用含有茶黄素类化合物的茶提取物。该口腔内细菌增殖抑制剂优选用于抑制选自变异链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、及具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)所构成的组中的一种或两种以上的增殖。

Description

口腔内细菌增殖抑制剂

技术领域

本发明涉及一种以茶黄素类化合物为有效成分的口腔内细菌增殖抑制剂。

背景技术

口腔相关的代表性疾病为龋齿(虫牙)和牙周病，其各自病原菌、机理的研究正在进行中。龋齿的主要病原菌为变异链球菌(Streptococcus mutans)，牙周病的主要病原菌为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)。至今为止，公开许多对于这些病原菌显示杀菌、抑菌效果的成分或抑制牙菌斑形成的成分的相关研究。另一方面，存在由于其抗菌性而同时影响口腔内或肠内的正常菌群，全体菌群平衡受到破坏的问题。

对于这样的问题，下述专利文献1公开了一种牙菌斑形成抑制剂的发明，其以不影响口腔内或肠内的正常菌群，特别是只以抑制变异链球菌(Streptococcus mutans)的牙菌斑的形成为目的，将以合成吸附树脂处理红茶的溶剂提取物而得到的吸附成分作为有效成分。

另一方面，下述专利文献2公开了一种发明，其目的在于提供一种在口腔关联疾病中特别是用于牙周病疾病的预防改善的物质，该物质对干预牙周组织破坏的基质金属蛋白酶(MMP)的抑制及/或产生抑制优异，可替代涩味及苦味强的表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，风味佳、且对人体安全性高。还公开了在红茶提取物或漆酶处理绿茶提取物中含有的epitheaflagallin、epitheaflagallin-3-O-gallate、茶黄素-3-O-没食子酸酯中具有基质金属蛋白酶(MMP)的抑制效果及/或产生抑制效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2000-344642号公报

专利文献2：特开2009-219484号公报

发明内容

本发明要解决的技术问题

然而，专利文献1所述的牙菌斑形成抑制剂以合成吸附树脂对红茶的溶剂提取物进行处理，并以有机溶剂或含水有机溶剂进行溶出而得到的成分为有效成分，除了儿茶素类，无法期待对于牙周病的病原菌等的杀菌或抑菌的效果。此外，在专利文献2中，虽然对基质金属蛋白酶(MMP)酶的酶活性抑制效果、对IL-1β诱导的人牙龈成纤维细胞的基质金属蛋白酶(MMP)生产率的抑制效果进行了试验，但是并未发现对牙周病的病原菌自身的杀菌或抑菌的效果。

鉴于上述以往技术，本发明的目的在于利用茶中所含成分，提供一种优异的口腔内细菌增殖抑制剂。

解决技术问题的技术手段

为了实现上述目的，本发明人等进行深刻讨论，结果发现，茶黄素类化合物抑制口腔内细菌的增殖的效果优异，从而完成了本发明。

即，本发明的口腔内细菌增殖抑制剂的特征在于，以茶黄素类化合物为有效成分。

在本发明的口腔内细菌增殖抑制剂，优选所述茶黄素类化合物的含量在固体成分中为10～100质量％。

此外，所述茶黄素类化合物优选以25～400μg/mL的浓度向口腔中进行给药的方式而使用。

此外，本发明的口腔内细菌增殖抑制剂优选由固体成分中含有10～100质量％茶黄素类化合物的茶提取物所构成。

此外，所述茶提取物优选在茶提取成分中使具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶起作用，从所述茶提取成分中含有的儿茶素类生成茶黄素类化合物。

此外，优选用于抑制选自变异链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、及具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)所构成的组中的一种或两种以上的增殖。

发明效果

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂以茶黄素类化合物为有效成分，因此抑制口腔内细菌的增殖的效果优异。具体而言，对于龋齿(虫牙)的病原菌变异链球菌(Streptococcusmutans)、牙周病的病原菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)显示优异的生长抑制效果。另一方面，对于口腔内的常居菌缓症链球菌(Streptococcus mitis)、唾液链球菌(Streptcoccus salivarius)等有益菌只显示弱抗菌性，口腔内或肠内的正常菌群的全体菌群平衡不会受到破坏。

具体实施方式

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂以茶黄素类化合物为有效成分。在本发明中，作为茶黄素类化合物，使用选自茶黄素、茶黄素-3-O-没食子酸酯、茶黄素-3’-O-没食子酸酯、茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯的一种或两种以上。

茶黄素类化合物是在将茶叶加工成红茶的发酵过程中生成的、呈红色的多酚。茶叶中含有的儿茶素类受到具有多酚氧化酶活性或过氧化物酶活性等的酶的氧化而生成。

作为茶黄素类化合物，可使用以表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等儿茶素类为原料，通过铁***进行氧化而合成的化学合成品等，但优选使用含有茶黄素类化合物的茶提取物。以下列举含有茶黄素类化合物的茶提取物的例子。

(红茶提取物)

经茶发酵过程的茶叶(全发酵茶)通过水、含水醇等溶剂在加热或常温条件下，通过进行数分钟至数小时的搅拌而进行提取，可以得到红茶提取物。此红茶提取物也可进行提纯、浓缩、粉末化等加工处理。在这样的红茶提取物中，为了提高茶黄素类化合物的含量可列举例如在红茶发酵过程中延长发酵时间的方法之外，将表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等儿茶素类追加投入于红茶提取物中，添加具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶，在加热或常温条件下，使其进行数分钟至数小时的反应的方法。作为具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶可利用来自苹果、香蕉等果实的酶、含有该酶的茶叶提取物、含有该酶的茶叶粉碎物、含有该酶的植物细胞培养液等。此外，作为上述儿茶素类，除来自茶的儿茶素制剂或高浓度含有儿茶素的茶提取物等来自于茶之外，也可利用来自可可等其他植物的儿茶素制剂或高浓度含有儿茶素的提取物。

(茶提取成分的酶处理物)

在溶解或被溶解于水等溶剂中的茶提取成分中，添加具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶，在加热或常温条件下，使其进行数分钟至数小时的反应。由此由茶提取成分中含有的儿茶素类生成茶黄素类化合物。作为具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶可利用来自苹果、香蕉等果实的酶、含有该酶的茶叶提取物、含有该酶的茶叶粉碎物、含有该酶的植物细胞培养液等。通过这样而得到的茶提取成分的酶处理物也可进行提纯、浓缩、粉末化等加工处理。

(茶叶发酵提取物)

粉碎茶叶并调制为浆状，根据需要而添加水等溶剂，在加热或常温条件下，使其进行数分钟至数小时的发酵。由此。通过茶叶中含有的具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶的作用，由茶叶中含有的儿茶素类生成茶黄素类化合物。根据需要也可通过在发酵后进行固液分离，也可进一步通过水、含水醇等溶剂在加热或常温条件下，进行数分钟至数小时的搅拌而进行提取。通过这样而得到的茶提取成分也可进行提纯、浓缩、粉末化等加工处理。

(儿茶素类的酶处理物)

以表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等儿茶素类为原料，在水等溶剂中添加具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶，在加热或常温条件下，使其进行数分钟至数小时的反应。由此，由表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等儿茶素类生成茶黄素类化合物。作为具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶可利用来自苹果、香蕉等果实的酶、含有该酶的茶叶提取物、含有该酶的茶叶粉碎物、含有该酶的植物细胞培养液等。此外，作为上述儿茶素类，除来自茶的儿茶素制剂或高浓度含有儿茶素的茶提取物等来自于茶之外，也可利用来自可可等其他植物的儿茶素制剂或高浓度含有儿茶素的提取物。通过这样而得到的儿茶素类的酶处理物也可进行提纯、浓缩、粉末化等加工处理。

此外，本发明中使用的“茶提取物”除上述例示的制备方法以外，也可为以茶为原料并作为其成分含有来自茶的茶黄素类化合物，或含有从作为其成分的儿茶素类而生成的来自茶的茶黄素类化合物，是指包括所有情况的意思。

作为上述茶提取物的原料的茶，为从山茶科的多年生植物的茶树所得到的茶，无特别限制。作为通常所栽培的茶品种可列举例如，朝露(あさつゆ)、大井早生(おおいわせ)、奥光(おくひかり)、奥绿(おくみどり)、金谷绿(かなやみどり)、驹影(こまかげ)、早绿(さみどり)、初红叶(はつもみじ)、大和绿(やまとみどり)、牧之原早生(まきのはらわせ)、峰香(みねかおり)、明绿(めいりょく)、薮北(やぶきた)、Yamanami(やまなみ)等绿茶品种、乌龙、色种、水仙、铁观音等乌龙茶品种、汉红(からべに)、姬绿(ひめみどり)、红光(べにひかり)、红富贵(べにふうき)、红富士(べにふじ)、红誉(べにほまれ)等红茶品种等。茶叶的采摘时期可为头茶、二茶、三茶等任意之一，此外，对其栽培国或地域无特别限制。

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂优选固体成分中含有10～100质量％茶黄素类化合物，更优选含有25～100质量％，最优选含有40～100质量％。茶黄素类化合物的含量在固体成分中小于10质量％时，向口腔内给药时的茶黄素类化合物的浓度变低，因此存在口腔内细菌的增殖抑制作用降低的倾向。

作为本发明的口腔内细菌增殖抑制剂，在使用前述茶提取物的情况下，该茶提取物在其固体成分中优选含有10～100质量％茶黄素类化合物，更优选含有25～100质量％，最优选含有40～100质量％。

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂除含有茶黄素类化合物的原料之外，也可含有其他原料。可含有例如，砂糖、果糖、糖醇等糖类、蛋白质、脂质、矿物质等。此外，根据需要也可含有防腐剂、增粘剂、乳化剂、着色剂、着香剂等。

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂通过向口腔内给药而带来抑制口腔内细菌的增殖的作用。其给药方法无特别限定，向口腔内给药口腔内细菌增殖抑制剂或含有它的组合物时，作为与唾液等混合而形成的流动物中的茶黄素类化合物的浓度优选以25～400μg/mL的浓度的方式而使用，更优选以100～400μg/mL的浓度的方式而使用。若口腔内的茶黄素类化合物的浓度小于10μg/mL，则存在口腔内细菌的增殖抑制作用降低的倾向。

此外，为了在口中停留一定时间而摄取或使用，本发明的口腔内细菌增殖抑制剂可以添加药学上所容许的基材或载体，可以通过公知的制剂方法，制成例如洁齿剂、漱口剂、含漱剂、口喷剂、舌下片剂、口香糖状剂、糖果状剂、口腔内溶解片剂、果冻状剂、软糖状剂等剂型，以适于所述剂型的通常摄取或使用方式进行使用。

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂的有效成分在口腔内细菌中，特别是对于龋齿(虫牙)或牙周病的病原菌显示优异的生长抑制效果，因此优选使用于抑制这些增殖。

例如，变异链球菌(Streptococcus mutans)为代表性的龋齿病原菌，平常难以从牙齿的表面检测出，但一定会从龋齿病灶中检测出。已知在菌体外生成葡聚糖、或形成生物膜、或由于乳酸的产生而引起牙釉质的丧失。此外，已知革兰氏阴性的专性厌氧细菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)为代表性的牙周病病原菌，在牙龈沟即所谓的牙周袋中生长的胶原酶、透明质酸酶等分解酶的诱导表达、或来自细菌的脂多糖引发炎症。此外，在近年的研究中作为口臭的病原菌备受瞩目。相同的，牙周病病原菌的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)为与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)以相同机理引起疾病的菌，其作为大肠癌的风险因素周所周知。作为其他的牙周病病原菌可列举福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、伴放线放线杆菌(Actinobacillisactinomycetemcomitans)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、中间普氏菌(Prevotellaintermedia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)等。

在此，口腔内存在超过500种的细菌，对于其细菌群平衡，口腔内细菌根据饮食生活或生活习惯有很大的变动，但作为被称作为常居菌的正常细菌群的代表性的菌种，例如，唾液链球菌(Streptococcus salivarius)为舌表面的最优势菌种，缓症链球菌(Streptococcus mitis)为颊粘膜及牙齿表面的最优势菌种。此外，血链球菌(Streptococcus sanguinis)为生长在牙齿表面上的口腔链球菌，同样的，也认同口腔链球菌的轻型链球菌(Streptococcus mitior)也存在。

本发明的口腔内细菌增殖抑制剂的有效成分在口腔内细菌中，对于缓症链球菌(Streptococcus mitis)、唾液链球菌(Streptcoccus salivarius)等的对身体影响少的有益菌只表示弱抗菌性。因此口腔内或肠内的正常菌群的全体菌群平衡不会受到破坏。

实施例

以下列举实施例对本发明进行进一步具体的说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。

＜制备例1＞含茶黄素粗提取物之一

将0.3g来自绿茶的儿茶素制剂(儿茶素含量90％以上，商品名“Sunphenon 90”，太阳化学株式会社)溶解于400mL水中。另外，将3g茶叶加入100mL水中并粉碎，以此得到茶粉碎物。在此茶粉碎物中混合上述儿茶素溶液，在30～35℃下进行3小时的反应。通过合成吸附剂“Sepabeads SP-700”(商品名，三菱化学株式会社制)对反应后的反应液进行提纯，通过冷冻干燥进行粉末化，得到了0.1g含茶黄素粗提取物。通过HPLC分析后，此含茶黄素粗提取物中含有6质量％茶黄素、14质量％茶黄素-3-O-没食子酸酯、4质量％茶黄素-3’-O-没食子酸酯、18质量％茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯，茶黄素类化合物的总含量为42质量％。

＜制备例2＞含茶黄素纯化提取物

将通过以与制备例1相同的方式制备所得到的4g含茶黄素粗提取物溶解于20％丙酮中，同样的，供给于以20％丙酮而溶胀的凝胶过滤色谱“Sephadex LH-20”(商品名、GEHealthcare Japan株式会社制)上并进行分离，以此得到了含茶黄素提取液。通过冷冻干燥将该含茶黄素提取液粉末化，得到了1.5g含茶黄素纯化提取物。通过HPLC分析后，该含茶黄素纯化提取物中含有16质量％茶黄素、27质量％茶黄素-3-O-没食子酸酯、7质量％茶黄素-3’-O-没食子酸酯、40质量％茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯，茶黄素类化合物的总含量为90质量％。

＜制备例3＞含茶黄素粗提取物之二

向50g绿茶用茶叶中添加400mL热水，在搅拌之后，进行固液分离得到了绿茶提取液。另外，向3g绿茶用茶叶中加入100mL水并粉碎，以此得到了绿茶粉碎物。在此茶粉碎物中合并上述绿茶提取液，在30～35℃下反应3小时。通过合成吸附剂“Sepabeads SP-700”(商品名，三菱化学株式会社制)对反应后的反应液进行提纯，通过冷冻干燥进行粉末化，以此得到了0.1g含茶黄素粗提取物。通过HPLC分析后，此含茶黄素粗提取物中含有4质量％茶黄素、10质量％茶黄素-3-O-没食子酸酯、3质量％茶黄素-3’-O-没食子酸酯、14质量％茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯，茶黄素类化合物的总含量为31质量％。

＜试验例1＞(对于口腔内细菌的增殖抑制效果)

[试验方法]

(1)细菌及培养基

在(变异链球菌)Streptococcus mutans(NBRC13955,以下简称为S.mutans)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)(NBRC106071，以下简称为S.mitis)、及唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(NBRC13956，以下简称为S.salivarius)的培养中使用了脑心浸出液(BHI)培养基。此外，在专性厌氧细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(ATCC33277，以下简称为P.gingivalis)和具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(ATCC25586，以下简称为F.nucleatum)的培养中使用了含有1mg/mL酵母提取物(Yeast Extract)、1μg/mL氯化血红素(Hemin)、5μg/mL甲萘醌(Menadion)的脑心浸液肉汤(BHI)培养基。将各菌在各培养基中植菌后进行1日的培养，提供于以下的试验中。

(2)被检样品

将制备例1中得到的含茶黄素粗提取物(以下简称为TF crude 1)、制备例2中得到的含茶黄素纯化提取液(以下简称为TF fine)、制备例3中得到的含茶黄素粗提取液(以下简称为TF fine 2)、茶黄素(以下简称为TF-1)、茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯(以下简称为TF-3)、及来自绿茶的儿茶素制剂(儿茶素含量90％以上，商品名“Sunphenon 90”，太阳化学株式会社)(以下简称为CC)作为被检样品。以在含有1％二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲液(PBS)中为5mg/mL的方式溶解各样品，并为了除菌将通过0.20μm膜的各样品提供于以下的试验中。

(3)最低抑菌浓度的测定

将被检样品与含有1％二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲液(PBS)混合，制成5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.50、0.25mg/mL的稀释系列，进一步以含有菌的培养基进行10倍稀释，将最终浓度调整为500、400、300、200、100、50、25μg/mL。各菌，进一步调整上述稀释中使用的培养基中的菌数从而使培养开始时为约1.0×10⁵cfu/mL。

在培养中使用96孔板，在厌氧培养条件下进行静置培养，使用孔板检测仪经时性测定浊度(OD 630nm)。浊度为平均了三个孔的结果，对浊度进行测定直至菌的增殖曲线到达曲线平直。作为抑菌的基准，对于菌的增殖曲线到达曲线平直部分时的浊度上升幅度，设定相对于未添加被检样品的对照组的浊度上升幅度控制在小于10％的值，求出其表示抑菌的最小浓度的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration；MIC)。

[结果]

结果如表1所示。

[表1]

如表1所示，对于龋齿病原菌S.mutans，TF fine的生长抑制的效果最高，TF crude1和TF-3的效果为第二高，TF crude 2的效果为第三高。对于牙周病病原菌P.gingivalis，TF fine的生长抑制的效果最高，TF crude 1和TF-3的效果为第二高，TF crude 2的效果为第三高。对于牙周病病原菌F.nucleatum，在任何一个被检样品中都发现了生长抑制的效果。对于口腔内常居菌S.mitis，TF-3确认到若干效果，在其他被检样品中效果缺乏。对于口腔内常居菌S.salivarius，在任何一个被检样品中效果均缺乏。

从以上的结果明确可知，在含有茶黄素类化合物的被检样品中，相比于对口腔内常居菌，对于龋齿(虫牙)或牙周病的病原菌方面，整体生长抑制的效果增高，如上所述存在选择性的抗菌性。对此，在来自绿茶的儿茶素制剂中，除对于F.nucleatum以外，一样的只确认到弱的效果。因此，可以认为对于儿茶素制剂，若提高至对于例如S.mutans的有効浓度而使用，则存在甚至抑制常居菌的生长的可能性。

Claims (6)

1.一种口腔内细菌增殖抑制剂，其特征在于，以茶黄素类化合物为有效成分。

2.根据权利要求1所述的口腔内细菌增殖抑制剂，所述茶黄素类化合物的含量在固体成分中为10～100质量％。

3.根据权利要求1或2所述的口腔内细菌增殖抑制剂，将所述茶黄素类化合物以25～400μg/mL的浓度向口腔中给药的方式而使用。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的口腔内细菌增殖抑制剂，由固体成分中含有10～100质量％茶黄素类化合物的茶提取物所构成。

5.根据权利要求4所述的口腔内细菌增殖抑制剂，所述茶提取物在茶提取成分中使具有多酚氧化酶活性及/或过氧化物酶活性的酶起作用，由所述茶提取成分中含有的儿茶素类生成茶黄素类化合物。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的口腔内细菌增殖抑制剂，其用于抑制选自变异链球菌(Streptococcus mutans)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、及具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)所构成的组中的一种或两种以上的增殖。