CN106146672A - 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents

吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒。吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物。吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成‑CO‑NH‑结构从而将吖啶取代物与连接载体连接。通过连接载体以及含有马来酰亚胺基及酰肼基的双功能交联剂，吖啶取代物与待标记物不直接发生化学键连接，避免了吖啶取代物对待标记物上的活性位点形成干扰，使得吖啶标记结合物的活性相对较高，提高免疫分析的灵敏度。

Description

吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒。
背景技术
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原、半抗原、抗体或碳水化合物的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶类化合物(acridinium ester，AE)。其通过起动发光试剂(NaOH、H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。
吖啶类化合物作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原或者抗体则采用夹心法，非特异性结合少，本底低，与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。吖啶类化合物可标记抗原抗体等形成吖啶标记结合物。吖啶标记结合物质量的好坏直接关系到化学发光免疫技术的成功与否，因此是试剂盒中一个很关键的试剂。吖啶标记结合物一般通过吖啶类化合物与特异性抗体经适当方法连接而成，吖啶类化合物和抗体将直接影响吖啶标记结合物的发光产率、背景干扰及亲和力等能力。
目前常用的吖啶标记结合物的制备方法是碳二亚胺交联法，以碳二亚胺双功能交联剂为桥，使吖啶取代物与待标记物结合。然而，传统方法制得的吖啶标记结合物中，由于吖啶取代物与待标记物需要通过碳二亚胺直接结合，吖啶取代物往往会对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，待标记物上可选择结合的活性位点少，造成吖啶标记结合物的活性降低，影响免疫分析的灵敏度。
发明内容
基于此，有必要提供一种活性相对较高的吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒。
一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物；
所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂；
所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物；
所述连接载体含有氨基和羧基，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；
或者，所述连接载体含有氨基及二硫键，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的二硫键与所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接。
在一个实施方式中，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。
在一个实施方式中，所述连接载体为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白。
在一个实施方式中，所述待标记物为抗原、半抗原或抗体。
一种上述吖啶标记结合物的制备方法，包括如下步骤：
用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B，其中，所述中间产物B为吖啶取代物-连接载体结合物；以及
将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物，所述连接载体含有氨基和羧基，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；或者，所述连接载体含有氨基及二硫键，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的二硫键与所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接。
在一个实施方式中，将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的操作具体包括以下步骤：
用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D，其中，所述中间产物D为吖啶取代物-连接载体-双功能交联剂结合物，所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，所述中间产物B中的连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述中间产物B与所述双功能交联剂连接；以及
将所述中间产物D与待标记物结合得到吖啶标记结合物，其中，所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，所述中间产物D中的双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述中间产物D与所述待标记物连接。
在一个实施方式中，将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的操作具体包括以下步骤：
将中间产物B进行活化处理，使得所述中间产物B中的连接载体上的二硫键活化形成巯基，得到中间产物F，其中，所述中间产物F为含有巯基的吖啶取代物-连接载体结合物；
将待标记物与双功能交联剂反应生成中间产物I，其中，所述中间产物I为待标记物-双功能交联剂结合物，所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；以及
将所述中间产物I与所述中间产物F结合得到吖啶标记结合物，其中，所述中间产物I中的双功能交联剂上马来酰亚胺基与所述中间产物F上的巯基反应形成结构从而将所述中间产物I与所述中间产物F连接。
在一个实施方式中，用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B的操作中，所述活化后的吖啶取代物与所述连接载体的摩尔比为1～5000：1。
在一个实施方式中，用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D的操作中，所述双功能交联剂与所述中间产物B的摩尔比为1～10000：1。
一种化学发光免疫检测试剂盒，包括上述任一项所述的吖啶标记结合物。
这种吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物。吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接。连接载体上的羧基与双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，双功能交联剂上的马来酰亚胺基与待标记物上的巯基反应形成结构从而将双功能交联剂与待标记物连接。或者另一种方式，连接载体上的二硫键与双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，双功能交联剂上的酰肼基与待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将双功能交联剂与待标记物连接。通过含有连接载体以及含有马来酰亚胺基及酰肼基的双功能交联剂，吖啶取代物与待标记物没有直接通过化学键结合，避免了吖啶取代物对待标记物上的活性位点形成干扰，使得吖啶标记结合物的活性相对较高，提高免疫分析的灵敏度。此外，双功能交联剂中的马来酰亚胺基及酰肼基可与含有巯基、羰基或羧基的待标记物特异性结合，避免了以往吖啶取代物不能与含有巯基、羰基或羧基的待标记物结合的缺陷，扩大待标记物的选择范围，使得吖啶标记结合物的特异性高，增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
附图说明
图1为一实施方式的吖啶标记结合物的制备方法的流程图；
图2为一实施方式的由中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的制备流程图；
图3为另一实施方式的由中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的制备流程图；
图4为测试例4中得到的系列浓度甲状腺球蛋白抗体样本检验结果散点图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物。双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂。待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物。
一实施方式中，连接载体含有氨基和羧基，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接。连接载体上的羧基与双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，双功能交联剂上的马来酰亚胺基与待标记物上的巯基反应形成结构从而将双功能交联剂与待标记物连接。
另一实施方式中，连接载体含有氨基及二硫键，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接。连接载体上的二硫键与双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，双功能交联剂上的酰肼基与待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将双功能交联剂与待标记物连接。
具体的，吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。标记用吖啶酯，具体可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亚胺酯甲酸酯)、DMAE-NHS(2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯)、ME-DMAE-NHS(2’,6’-二甲基羰基苯基-10-甲基-9-吖啶甲酸酯-4’-N-琥珀酰亚胺酯-三氟甲基磺酸盐)等。
具体的，连接载体可以为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白(KLH)。当然，在其它同时含有氨基、羧基及二硫键的载体也可以作为本吖啶标记结合物中的连接载体。连接载体同时含有氨基、羧基及二硫键这三种功能性基团，可以与双功能交联剂或待标记物发生多种结合方式。
具体的，双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂。具体可以为EMCH(N-[ε-马来酰亚胺乙酸]-酰肼■三氟乙酸)、KMUH(N-[κ-马来酰亚胺十一烷酸]-酰肼■三氟乙酸)或MPBH(4-[4-N-马来酰亚胺苯基]-丁酸酰肼■盐酸)等。
具体的，待标记物可以为本身就具有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，也可以为通过修饰后引入巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物。
本实施方式中，待标记物为抗原、半抗原或抗体。
以吖啶取代物为吖啶酯，连接载体为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白(KLH)、双功能交联剂为含有马来酰亚胺基为例，吖啶标记结合物具有如下结构式：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白，为待标记物。
另一实施方式的吖啶标记结合物具有如下结构式：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白，为待标记物。
这种吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物。通过含有氨基、羧基及二硫键的连接载体以及含有马来酰亚胺基及酰肼基的双功能交联剂，吖啶取代物与待标记物可以不通过碳二亚胺直接结合，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，使得吖啶标记结合物的活性相对较高，提高免疫分析的灵敏度。
此外，双功能交联剂中的马来酰亚胺基及酰肼基可与含有巯基、羰基或羧基的待标记物特异性结合，避免了以往吖啶取代物不能与含有巯基、羰基或羧基的待标记物结合的缺陷，扩大待标记物的选择范围，使得吖啶标记结合物的特异性高，增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。可以根据检测的需要，相应的连接该被检测物对应的待标记物，因为待标记物的选择范围宽，即使是含有巯基、羰基或羧基的待标记物也能通过双功能交联剂以及连接载体与吖啶取代物结合形成吖啶标记结合物，因此在检测时，吖啶标记结合物可与被检测物特异性结合，灵敏度高，标记率高。
这种吖啶标记结合物，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接，吖啶取代物与待标记物之间没有直接发生化学键反应。而传统的方法一般以碳二亚胺双功能交联剂为桥，使吖啶取代物与待标记物直接结合，这样标记率较低，活性不好，且标记基团选择性少，不能直接跟含羰基、巯基的待结合物结合。与传统吖啶标记结合物相比，本发明的吖啶标记结合物标记效率较高，可以直接用于化学发光免疫分析的检测和定量分析，并且能解决传统的碳二亚胺交联法等方法制备的吖啶标记结合物原料失活、标记效率低、标记基团选择性少等缺点。
如图1所示的上述的吖啶标记结合物的制备方法，包括如下步骤S110～S120。
S110、用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B。
其中，中间产物B为吖啶取代物-连接载体结合物，连接载体含有氨基和羧基或者连接载体含有氨基及二硫键，更进一步的，连接载体可以为含有氨基、羧基及二硫键的连接载体，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接。
具体的，吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。具体可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亚胺酯甲酸酯)、DMAE-NHS(2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯)、ME-DMAE-NHS(2’,6’-二甲基羰基苯基-10-甲基-9-吖啶甲酸酯-4’-N-琥珀酰亚胺酯-三氟甲基磺酸盐)等。
具体的，连接载体可以为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白(KLH)。当然，在其它同时含有氨基、羧基及二硫键的载体也可以作为本吖啶标记结合物中的连接载体。
用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B的操作中，活化后的吖啶取代物与连接载体的摩尔比为1～5000：1。
更进一步的，活化后的吖啶取代物与连接载体的摩尔比为50～400：1。
吖啶取代物可通过羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺或羧酸等活化吖啶类化合物后得到。
吖啶取代物为羟基琥珀酰亚胺活化的吖啶化合物、连接载体可以为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白(KLH)为例，用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B的反应式如下：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白。
上述反应式的具体反应过程为：将KLH溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入用DMSO溶剂溶解的吖啶酯溶液，于20℃～30℃反应1h。用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到中间产物B(吖啶取代物-连接载体结合物)，本实施例中中间产物B具体为吖啶酯-KLH。
S120、将中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物。
其中，吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物，连接载体含有氨基和羧基，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接，连接载体上的羧基与双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将连接载体与所述双功能交联剂连接，双功能交联剂上的马来酰亚胺基与待标记物上的巯基反应形成结构从而将双功能交联剂与待标记物连接。或者，连接载体含有氨基及二硫键，吖啶取代物与连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将吖啶取代物与连接载体连接，连接载体上的二硫键与双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，双功能交联剂上的酰肼基与待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将双功能交联剂与待标记物连接。
通过步骤得到的中间产物B，含有连接载体上的功能性基团氨基、羧基及二硫键等。中间产物B可以先与双功能交联剂结合再通过双功能交联剂与待标记物结合，也可以是先将双功能交联剂与待标记物结合，形成双功能交联剂-待标记物，然后再与中间产物B结合。
在一个实施方式中，中间产物B通过羧基与双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将连接载体与双功能交联剂连接，再通过双功能交联剂上的马来酰亚胺基与待标记物上的巯基反应形成结构从而将双功能交联剂与待标记物连接得到吖啶标记结合物。具体如图2所示，S120包括以下步骤S120A和S120B。
S120A、用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D。
其中，中间产物D为吖啶取代物-连接载体-双功能交联剂结合物，双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，中间产物B中的连接载体上的羧基与双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将中间产物B与双功能交联剂连接。
具体的，双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂。具体可以为EMCH(N-[ε-马来酰亚胺乙酸]-酰肼■三氟乙酸)、KMUH(N-[κ-马来酰亚胺十一烷酸]-酰肼■三氟乙酸)或MPBH(4-[4-N-马来酰亚胺苯基]-丁酸酰肼■盐酸)等。
用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D的操作中，双功能交联剂与中间产物B的摩尔比为1～10000：1。
更进一步的，双功能交联剂与中间产物B的摩尔比为5～5000：1。
以中间产物B为吖啶酯-KLH、双功能交联剂为EMCH为例，中间产物B与双功能交联剂反应得到中间产物D的反应式如下：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白。
本实施方式中，中间产物B与双功能交联剂(EMCH)在碳二亚胺溶剂(EDC)溶液中反应，碳二亚胺溶剂可以选自二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N，N-二异丙基碳二亚胺。本实施方式中，EDC选用二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。通过碳二亚胺溶剂促进中间产物B与双功能交联剂(EMCH)反应，提高产物率。
具体的，双功能交联剂与碳二亚胺溶的摩尔比例可以为10:1～1:10。更进一步的双功能交联剂与碳二亚胺溶的摩尔比例为5:1～1:5。
上述反应式的具体反应过程为：将EDC和EMCH加入到中间产物B(吖啶酯-KLH)中。其中，EDC与EMCH摩尔为10:1～1:10。在20℃～25℃反应10min～60min后。用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC和EMCH及副产物，得到中间产物D(吖啶取代物-连接载体-双功能交联剂结合物)，本实施方式中，中间产物D具体为吖啶酯-KLH-EMCH。
S120B、将中间产物D与待标记物结合得到吖啶标记结合物。
其中，待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，中间产物D中的双功能交联剂上的马来酰亚胺基与待标记物上的巯基反应形成结构从而将中间产物D与待标记物连接。
具体的，待标记物可以为本身就具有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，也可以为通过修饰后引入巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物。
本实施方式中，待标记物为抗原、半抗原或抗体。
将中间产物D与待标记物结合得到吖啶标记结合物的操作中，中间产物D与待标记物的摩尔比为0.01～100:1。进一步的，中间产物D与待标记物的摩尔比为0.25～5:1。
以中间产物D为吖啶酯-KLH-EMCH，待标记物为含有巯基的待标记物为例，中间产物D与待标记物结合得到吖啶标记结合物的反应式如下：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白，为待标记物。
上述反应式的具体反应过程为：将中间产物D(吖啶酯-KLH-EMCH)加入纯化好含有巯基(-SH)的待标记物溶液中，反应1h～3h，得到吖啶标记结合物。
在另一个实施方式中，中间产物B通过二硫键与双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将连接载体与双功能交联剂连接。双功能交联剂上的酰肼基与待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将双功能交联剂与待标记物连接。具体如图3所示，在本实施方式中，S120包括以下步骤S120a、S120b以及S120c。
S120a、将中间产物B进行活化处理，使得中间产物B中的连接载体上的二硫键活化形成巯基，得到中间产物F。
其中，中间产物F为含有巯基的吖啶取代物-连接载体结合物。
具体的，可以通过含巯基的溶液对中间产物B中的连接载体上的二硫键活化形成巯基，从而得到中间产物F。含巯基的溶液可以为DTT(二硫苏糖醇)等。
以中间产物B为吖啶酯-KLH、活化处理剂为DTT溶液为例，将中间产物B进行活化处理得到中间产物F的反应式如下：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白。
上述反应式的具体反应过程为：将纯化后的中间产物B(吖啶酯-KLH)，加入终浓度为1mM～10mM的DTT，混匀，20℃～30℃反应10min～60min。用5mL7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的DTT及反应副产物，得到中间产物F。本实施方式中，中间产物F具体为吖啶酯-KLH-SH。
S120b、将待标记物与双功能交联剂反应生成中间产物I。
其中，中间产物I为待标记物-双功能交联剂结合物，待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，双功能交联剂上的酰肼基与待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将双功能交联剂与待标记物连接。
具体的，待标记物可以为本身就具有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，也可以为通过修饰后引入巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物。
本实施方式中，待标记物为抗原、半抗原或抗体。
具体的，双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂。具体可以为EMCH(N-[ε-马来酰亚胺乙酸]-酰肼■三氟乙酸)、KMUH(N-[κ-马来酰亚胺十一烷酸]-酰肼■三氟乙酸)或MPBH(4-[4-N-马来酰亚胺苯基]-丁酸酰肼■盐酸)等。
将待标记物与双功能交联剂反应生成中间产物I的操作中，双功能交联剂与待标记物的摩尔比为1～10000：1。更进一步的，双功能交联剂与待标记物的摩尔比为50～1000：1
以待标记物为含有羰基或羧基的待标记物、双功能交联剂为EMCH为例，待标记物与双功能交联剂反应生成中间产物I的反应式如下：
其中，为待标记物，-R为-H、-OH或芳香族化合物。
本实施方式中，待标记物与双功能交联剂(EMCH)在碳二亚胺溶剂(EDC)溶液中反应，碳二亚胺溶剂可以选自二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N，N-二异丙基碳二亚胺。本实施方式中，EDC选用二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。通过碳二亚胺溶剂促进待标记物与双功能交联剂(EMCH)反应，提高产物率。
具体的，双功能交联剂与碳二亚胺溶的摩尔比例可以为10:1～1:10。更进一步的双功能交联剂与碳二亚胺溶的摩尔比例为5:1～1:5。
上述反应式的具体反应过程为：将EDC和EMCH加入到待标记物溶液中。其中，EDC与EMCH摩尔为10:1～1:10。在20℃～25℃反应10min～60min后。用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC和EMCH及副产物，得到中间产物I。本实施方式中，中间产物I具体为待标记物-EMCH。
S120c、将中间产物I与中间产物F结合得到吖啶标记结合物。
其中，中间产物I中的双功能交联剂上马来酰亚胺基与中间产物F上的巯基反应形成结构从而将中间产物I与所述中间产物F连接。
具体的，将中间产物I与中间产物F结合得到吖啶标记结合物的操作中，中间产物I与中间产物F的摩尔比为0.01～100：1。更进一步的，中间产物I与中间产物F的摩尔比为0.2～20：1。
以中间产物I为待标记物-EMCH、中间产物F为吖啶酯-KLH-SH为例，中间产物I与中间产物F结合得到吖啶标记结合物的反应式如下：
其中，表示吖啶类化合物，表示血蓝蛋白，为待标记物。
上述反应式的具体反应过程为：将待标记物-EMCH加入吖啶酯-KLH-SH溶液中，反应1h～5h，得到吖啶标记结合物。本实施方式中，吖啶标记结合物具体为吖啶酯-KLH-EMCH-待标记物。
这种吖啶标记结合物的制备方法，工艺简单，通过连接载体以及含有马来酰亚胺基及酰肼基的双功能交联剂，吖啶取代物与待标记物可以不通过碳二亚胺直接结合，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，使得吖啶标记结合物的活性相对较高，提高免疫分析的灵敏度。双功能交联剂中的马来酰亚胺基及酰肼基可与含有巯基、羰基或羧基的待标记物特异性结合，避免了以往吖啶取代物不能与含有巯基、羰基或羧基的待标记物结合的缺陷，扩大待标记物的选择范围，使得吖啶标记结合物的特异性高，增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。可以根据检测的需要，相应的连接该被检测物对应的待标记物，因为待标记物的选择范围宽，即使是含有巯基、羰基或羧基的待标记物也能通过双功能交联剂以及连接载体与吖啶取代物结合形成吖啶标记结合物，因此在检测时，吖啶标记结合物可与被检测物特异性结合，提高灵敏度高和标记率。
本发明还公开了一种化学发光免疫检测试剂盒，该化学发光免疫检测试剂盒包括上述吖啶标记结合物。
优选的，这种化学发光试剂盒还包括离心脱盐柱和离心超滤管中的至少一种。
这种化学发光试剂盒可以根据检测的需要，在吖啶标记结合物中相应的连接该被检测物对应的待标记物，因为待标记物的选择范围宽，即使是含有巯基、羰基或羧基的待标记物也能通过双功能交联剂以及连接载体与吖啶取代物结合形成吖啶标记结合物，因此在检测时，吖啶标记结合物可与被检测物特异性结合，提高灵敏度高和标记率。
以下为具体实施例。
实施例中，除非特殊说明，否则所使用的试剂购自Sigma-aldrich公司，为分析纯。
实施例中出现的吖啶酯均为N-羟基琥珀酰亚胺活化的吖啶酯。KLH表示含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白。EDC表示二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。DTT表示二硫苏糖醇。
实施例1
将KLH溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，终浓度为20nmol/L。加入10μL溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯。于25℃反应1h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-KLH溶液。
将1mg甲状腺球蛋白(厂家：biospacific，货号：J19400，1.5nmol)溶解于1mL 50mMMES缓冲液(pH 4.5)中，加入EDC(终浓度为5mmol/L)和EMCH(终浓度为10mmol/L)，25℃条件下反应30分钟后，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC和EMCH及副产物，得到活化后的甲状腺球蛋白-EMCH。
将纯化后的吖啶酯-KLH溶液，加入终浓度为5mM的DTT处理，混匀，25℃反应0.5h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的DTT及反应副产物，得到吖啶酯-KLH-SH。
将活化后的甲状腺球蛋白-EMCH加入纯化好的吖啶酯-KLH-SH溶液中，反应2h，得到吖啶标记结合物(吖啶酯-KLH-EMCH-甲状腺球蛋白)溶液。
实施例2
将KLH溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，终浓度为20nmol/L，加入10μL溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯。于25℃反应1h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以50mM MES(pH 4.5)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-KLH溶液。
将EDC(终浓度为5mmol/L)和EMCH(终浓度为10mmol/L)加入到吖啶酯-KLH中，25℃反应30分钟后，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC和EMCH及副产物，得到活化后的吖啶酯-KLH-EMCH；
将1mg抗降钙素原的小鼠单克隆抗体抗体(厂家：Hytest，货号：4PC47-6F10，6.67nmol)溶解于150mM PBS(pH 7.4)缓冲液溶液，用终浓度5mM的DTT处理，25℃反应0.5h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的DTT及反应副产物，得到巯基化的抗降钙素原抗体(抗降钙素原抗体-SH)。
将活化后的吖啶酯-KLH-EMCH加入纯化好的抗降钙素原抗体-SH溶液中，反应2h，得到吖啶标记结合物(吖啶酯-KLH-EMCH-抗降钙素原小鼠单克隆抗体)溶液。
实施例3
将KLH溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，终浓度20nmol/L，加入10μL溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯，于25℃反应1h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-KLH溶液。
将1mg的β2糖蛋白(厂家：abgree，货号：G7018，16.7nmol)溶解于1mL50mM MES缓冲液(pH 4.5)中，加入偏高碘酸钠(终浓度为10mmol/L)，25℃反应30分钟后，加20ul的乙二醇淬灭反应30min，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离反应副产物，加入终浓度为10mmol/L的EMCH，反应1h，加入终浓度为20mmol/L的赖氨酸反应30min，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离反应副产物，得到活化后的β2糖蛋白-EMCH。
将纯化后的吖啶酯-KLH溶液，加入终浓度5mM的DTT处理，混匀，25℃反应0.5h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的DTT及反应副产物，得到吖啶酯-KLH-SH溶液。
将活化后的β2糖蛋白-EMCH加入纯化好的吖啶酯-KLH-SH溶液中，反应2h，得到结合物吖啶酯-KLH-EMCH-糖蛋白溶液。
对比例1
此实施例为活化后的吖啶酯在同等条件下用常规方法标记甲状腺球蛋白的方案，将1mg甲状腺球蛋白(厂家：biospacific，货号：J19400，1.5nmol)溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入10μL溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯，于25℃反应1h。用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-甲状腺球蛋白溶液。
对比例2
此实施例为活化后的吖啶酯在同等条件下用常规方法标记抗降钙素原的小鼠单克隆抗体的方案，将1mg抗降钙素原的小鼠单克隆抗体(厂家：Hytest，货号：4PC47-6F10，6.67nmol)溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入10ul溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯，于25℃反应1h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-抗降钙素原的小鼠单克隆抗体溶液。
对比例3
此实施例为活化后的吖啶酯在同等条件下用常规方法标记β2微球蛋白的方案，将1mgβ2糖蛋白(厂家：abgree，货号：G7018，16.7nmol)溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入10ul溶解于DMSO溶剂的10mmol/L吖啶酯，于25℃反应1h。用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermo fish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶酯-β2糖蛋白溶液。
测试例1
将实施例1和对比例1中得到的结合物分别用于甲状腺球蛋白抗体(Anti-Tg)的化学发光免疫分析检测。向500IU/mL的甲状腺球蛋白抗体样本中，加入40μg甲状腺球蛋白包被的磁珠，再分别加入实施例1和对比例1制备的4nmoL吖啶酯标记甲状腺球蛋白，孵育反应后清洗，先后加入100μL HNO3-H2O2溶液和100μL的氢氧化钠溶液，用iFlash3000型化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3份测量，取平均值。结果见表1。免疫分析所得结果的发光值越大，说明吖啶酯标记物的活性越好。
表1：实施例1和对比例1中得到的结合物检测Anti-Tg对比结果
吖啶酯标记物 平均发光值(RLU)
实施例1 2015672
对比例1 431557
由表1结果可知，采用实施例1制备得到的吖啶标记结合物的活性显著优于对比例1制备的结合物。
测试例2
将实施例2和对比例2中得到的结合物分别用于降钙素原(PCT)的化学发光免疫分析检测。向30ng/ml的降钙素原样本中，加入40μg抗降钙素原的小鼠单克隆抗体包被的磁珠，再分别加入实施例2和对比例2制备的10nmol吖啶酯标记甲状腺球蛋白，孵育反应后清洗，先后加入100μL HNO3-H2O2溶液和100μL的氢氧化钠溶液，用iFlash3000型化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3份测量，取平均值，结果见表2。免疫分析所得结果的发光值越大，说明吖啶酯标记物的活性越好。
表2：实施例2和对比例2中得到的结合物检测PCT对比结果
吖啶酯标记物 平均发光值(RLU)
实施例2 6358457
对比例2 865473
由表2结果可知，采用实施例2制备得到的吖啶标记结合物的活性显著优于对比例2制备的结合物。
测试例3
将实施例3和对比例3中得到的结合物分别用于抗β2糖蛋白I抗体的化学发光免疫分析检测。向50AU/mL的抗β2糖蛋白I抗体样本中，加入40μgβ2糖蛋白包被的磁珠，再分别加入实施例3和对比例3制备的1nmol吖啶酯标记β2糖蛋白，孵育反应后清洗，先后加入100μLHNO3-H2O2溶液和100μL的氢氧化钠溶液，用iFlash3000型化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3份测量，取平均值结果见表3。免疫分析所得结果的发光值越大，说明吖啶酯标记物的活性越好。
表3：实施例3和对比例3中得到的结合物检测抗β2糖蛋白I抗体对比结果
由表3的结果可知，采用实施例3制备得到的吖啶标记结合物的活性显著优于对比例3制备的结合物。
测试例4
将实施例1中得到的吖啶酯-KLH-EMCH-甲状腺球蛋白溶液用于系列浓度的甲状腺球蛋白抗体(Anti-Tg)的化学发光免疫分析检测。向系列浓度的Anti-Tg样本溶液中分别加入40μg甲状腺球蛋白包被的磁珠试剂和4nmoL吖啶酯-KLH-EMCH-甲状腺球蛋白试剂，孵育反应后清洗，先后加入100μL HNO3-H2O2溶液和100μL的氢氧化钠溶液，用iFlash3000型化学发光免疫分析仪测量发光值，结果见表4。以甲状腺球蛋白抗体浓度为X轴，以相对发光值为Y轴，由表4数据作图，得图4。
表4：系列浓度甲状腺球蛋白抗体样本的免疫检测结果
由表4和图4结果可知，实施例1制备吖啶酯-KLH-EMCH-甲状腺球蛋白可应用于化学发光免疫分析且效果良好。实施例1制备的吖啶酯-KLH-EMCH-标记物制备方法具有良好的适用性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种吖啶标记结合物，其特征在于，包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物；
所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂；
所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物；
所述连接载体含有氨基和羧基，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；
或者，所述连接载体含有氨基及二硫键，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的二硫键与所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接。
2.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。
3.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述连接载体为含有氨基、羧基及二硫键的血蓝蛋白。
4.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述待标记物为抗原、半抗原或抗体。
5.一种权利要求1～4中任一项所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B，其中，所述中间产物B为吖啶取代物-连接载体结合物；以及
将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、连接载体、双功能交联剂和待标记物，所述连接载体含有氨基和羧基，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；或者，所述连接载体含有氨基及二硫键，所述吖啶取代物与所述连接载体上的氨基反应形成-CO-NH-结构从而将所述吖啶取代物与所述连接载体连接，所述连接载体上的二硫键与所述双功能交联剂上的马来酰亚胺基反应形成结构从而将所述连接载体与所述双功能交联剂连接，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接。
6.根据权利要求5所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的操作具体包括以下步骤：
用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D，其中，所述中间产物D为吖啶取代物-连接载体-双功能交联剂结合物，所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，所述中间产物B中的连接载体上的羧基与所述双功能交联剂上的酰肼基反应形成-CO-NH-NH-结构从而将所述中间产物B与所述双功能交联剂连接；以及
将所述中间产物D与待标记物结合得到吖啶标记结合物，其中，所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，所述中间产物D中的双功能交联剂上的马来酰亚胺基与所述待标记物上的巯基反应形成结构从而将所述中间产物D与所述待标记物连接。
7.根据权利要求5所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，将所述中间产物B、双功能交联剂以及待标记物交联反应后得到吖啶标记结合物的操作具体包括以下步骤：
将中间产物B进行活化处理，使得所述中间产物B中的连接载体上的二硫键活化形成巯基，得到中间产物F，其中，所述中间产物F为含有巯基的吖啶取代物-连接载体结合物；
将待标记物与双功能交联剂反应生成中间产物I，其中，所述中间产物I为待标记物-双功能交联剂结合物，所述待标记物为含有巯基、羰基或羧基的蛋白、改性蛋白、多肽、改性多肽或碳水化合物，所述双功能交联剂为含有马来酰亚胺基及酰肼基的交联剂，所述双功能交联剂上的酰肼基与所述待标记物上的羰基或羧基反应形成-NH-NH-CO-构从而将所述双功能交联剂与所述待标记物连接；以及
将所述中间产物I与所述中间产物F结合得到吖啶标记结合物，其中，所述中间产物I中的双功能交联剂上马来酰亚胺基与所述中间产物F上的巯基反应形成结构从而将所述中间产物I与所述中间产物F连接。
8.根据权利要求5所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，用活化后的吖啶取代物与连接载体反应得到中间产物B的操作中，所述活化后的吖啶取代物与所述连接载体的摩尔比为1～5000：1。
9.根据权利要求6所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，用中间产物B与双功能交联剂反应生成中间产物D的操作中，所述双功能交联剂与所述中间产物B的摩尔比为1～10000：1。
10.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述的吖啶标记结合物。
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Assignee: Hunan Yahuilong Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: SHENZHEN YHLO BIOTECH Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023980047609

Denomination of invention: Acridine labeled conjugate and its preparation method, chemiluminescence immunoassay kit

Granted publication date: 20191129

License type: Common License

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