CN116004221A - 环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒 - Google Patents
环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种环肽在制备化学发光标记物中的应用,所述环肽的结构为PG‑(AA1)‑环(Lys‑(AA2)‑(AA3))‑(AA4);其中,AA3选自Asp或Glu;AA1为包含1至4个亲水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;AA2为包含3至10个疏水性氨基酸的多肽;AA4为包含1至5个疏水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;PG为含有一个或多个反应位点的反应基团。本发明所述环肽能应用于制备化学发光标记物,可降低检测过程中的本底值,最终减少假阳性结果的出现,同时还能保证检测结果具有较高的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域,特别是涉及一种环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒。
背景技术
目前应用广泛的免疫学检测技术有酶联免疫吸附法、胶乳免疫比浊法、时间分辨荧光免疫法以及化学发光免疫法等。其中,化学发光免疫法由于其具有灵敏度高、线性范围广、检测快速简便、结果稳定等优势,近年来发展得越来越快。
化学发光体系有多种,最主要的有HRP-鲁米诺发光体系、吖啶酯发光体系和电化学发光体系。吖啶酯常作为标记物用于免疫分析,其标记工艺简单、快速并且无需催化剂,其稳定性也比较好,试剂效期长。同时,吖啶酯发光为闪光型,发光快速集中且强大,检测结果的灵敏度和精密度都很高。
然而,在化学发光免疫检测中,有时会出现阴性样本测试的时候发光值偏高而被判定为阳性样本的情况。引起假阳性的主要原因是样本中存在干扰物质,而干扰物质可以与检测***中的抗体或抗原结合,使发光信号升高而产生假阳现象。常见的干扰物主要有异嗜性抗体(HA)、类风湿因子(RF)以及人抗动物抗体(HAAA)等免疫干扰物质。
传统方法是通过加入阻断剂来阻断干扰物质与检测***中的抗体或抗原的结合,从而达到消除假阳的目的。然而,有些情况下,即使添加了这些免疫阻断剂,阻断效果也并不明显,主要是因为干扰物质除了免疫干扰外,还可以通过带电性、疏水性、极性、金属络合等因素产生非特异性干扰。非特异性干扰受检测***中的磁珠、抗体或抗原的带电性、疏水性、极性、络合官能团等因素影响,导致即使是同一个检测项目,选用不同的磁珠、抗体或抗原,出现假阳的概率也不相同。
还有的传统方法用多肽(Lys)m—(PEG)n—R≡(4≤m≤12,4≤n≤12)对抗体或抗原进行修饰,发光信号增大,检测灵敏度提高,但是修饰后的抗体或抗原,亲水性增强,从而使得非特异性吸附非常严重。样本中的干扰物如果亲水性强,将容易产生假阳现象。
发明内容
基于此,本发明提供了一种环肽的新应用,具体为环肽在制备化学发光标记物中的应用。
本发明通过如下技术方案实现。
一种环肽在制备化学发光标记物中的应用,所述环肽的结构为PG-(AA1)-环(Lys-(AA2)-(AA3))-(AA4);
其中,AA3选自Asp或Glu;
AA1为包含1至4个亲水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
AA2为包含3至10个疏水性氨基酸的多肽;
AA4为包含1至5个疏水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
PG为含有一个或多个反应位点的反应基团。
在其中一个实施例中,所述AA1中,所述亲水性氨基酸每次出现,独立地选自Asp、Glu、Lys或Arg。
在其中一个实施例中,所述AA2中,所述疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
在其中一个实施例中,所述AA4中,所述疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
在其中一个实施例中,所述反应位点独立选自氨基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、膦基或叠氮基。
在其中一个实施例中,所述化学发光标记物为吖啶标记复合物。
本发明还提供一种吖啶标记复合物,包括本体、连接于所述本体上的活化片段、连接于所述活化片段上的如上所述的环肽,以及标记于所述本体上的或同时标记于所述本体与所述环肽上的吖啶酯类化合物。
在其中一个实施例中,所述本体为抗原、半抗原或抗体。
在其中一个实施例中,所述吖啶酯类化合物选自NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS或NSP-DMAE-HEG-NHS。
本发明还提供一种如上所述的吖啶标记复合物的制备方法,包括如下步骤:
活化所述本体,制备活化片段-本体复合物;
将所述活化片段-本体复合物与所述环肽进行偶联反应,制备环肽-活化片段-本体复合物;
将吖啶酯类化合物标记于所述环肽-活化片段-本体复合物上;或
将吖啶酯类化合物标记于所述本体上,制备本体-吖啶酯类化合物复合物;
活化所述本体-吖啶酯类化合物复合物,制备活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物;
将所述活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物与所述环肽进行偶联反应。
本发明还提供一种检测试剂盒,包括如上所述的吖啶标记复合物。
与现有技术相比较,本发明的环肽在制备化学发光标记物中的应用具有如下有益效果:
本发明人发现将Asp或Glu中的羧基和Lys的氨基进行反应成环,从而使所制备的化学发光标记物具有较短的肽链,可达到降低多肽位阻效应对抗体或抗原活性位点的遮蔽作用的目的,并且还不影响抗体或抗原的活性。同时,环内以及Asp或Glu的另一端引入疏水性氨基酸能确保修饰后的抗体或抗原的疏水性得到增强,从而降低化学发光免疫检测体系中的非特异性吸附。此外,在Lys的另一端引入亲水性氨基酸,可增大环肽在水溶液中的溶解度,使后续的修饰反应在水中得以进行。
进一步地,本发明所述环肽能应用于制备化学发光标记物,可降低检测过程中的本底值,最终减少假阳性结果的出现,同时还能保证检测结果具有较高的灵敏度和特异性。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。实施例中给出了本发明的较佳实施方式。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中,“若干”的含义是至少一个,例如一个,两个等,除非另有明确具体的限定。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指,在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而,在相同的情况下或其他情况下,其他实施方案也可能是优选的。此外,对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用,也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时,上述范围视为连续,且包括该范围的最小值及最大值,以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地,当范围是指整数时,包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并该范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
除非另外指明,所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。除非另外指明,有关所列成分的所有质量均给予活性物质的含量,因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“质量百分比含量”可用符号“%”表示。除非另外指明,在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。除非另外指明,在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括,这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种环肽在制备化学发光标记物中的应用,环肽的结构为PG-(AA1)-环(Lys-(AA2)-(AA3))-(AA4);
其中,AA3选自Asp或Glu;
AA1为包含1至4个亲水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
AA2为包含3至10个疏水性氨基酸的多肽;
AA4为包含1至5个疏水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
PG为含有一个或多个反应位点的反应基团。
在一个具体的示例中,AA3中的羧基和Lys侧链的氨基进行酰胺化反应成环。
在一个具体的示例中,AA1中,亲水性氨基酸每次出现,独立地选自Asp、Glu、Lys或Arg。
在一个具体的示例中,AA1选自如下肽链中的任一种:
Glu-Glu-Asp、Glu-Lys-Arg-Lys或Asp-Arg。
在一个具体的示例中,AA2中,疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
在一个具体的示例中,AA2选自如下肽链中的任一种:
Ala-Phe-Tyr-Trp-Leu-Pro-Trp-Phe、
Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Val或
Trp-His-Tyr-His-Phe。
在一个具体的示例中,AA4中,疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
在一个具体的示例中,AA4选自如下肽链中的任一种:
Gly-Ile-Ala、Phe-Tyr-His或Trp-Phe。
在一个具体的示例中,反应位点独立选自氨基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、膦基或叠氮基。
在一个具体的示例中,PG选自Cys或如下基团中的任一种:
在一个具体的示例中,化学发光标记物为吖啶标记复合物。
在一个具体的示例中,环肽选自如下多肽中的任一种:
Cys-Glu-Glu-Asp-环(Lys-Ala-Phe-Tyr-Trp-Leu-Pro-Trp-Phe-Asp)-Gly-Ile-Ala、
6-马来酰亚胺基己酸-Glu-Lys-Arg-Lys-环(Lys-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Val-Glu)-Phe-Tyr-His或
Alkyne-PEG6-Asp-Arg-环(Lys-Trp-His-Tyr-His-Phe-Glu)-Trp-Phe。
本发明还提供一种吖啶标记复合物,包括本体、连接于本体上的活化片段、连接于活化片段上的上述环肽,以及标记于本体上的或同时标记于本体与环肽上的吖啶酯类化合物。
在一个具体的示例中,本体为抗原、半抗原或抗体。
在一个具体的示例中,吖啶酯类化合物选自NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS或NSP-DMAE-HEG-NHS。
本发明还提供一种上述吖啶标记复合物的制备方法,包括如下步骤:
活化本体,制备活化片段-本体复合物;
将活化片段-本体复合物与环肽进行偶联反应,制备环肽-活化片段-本体复合物;
将吖啶酯类化合物标记于环肽-活化片段-本体复合物上;或
将吖啶酯类化合物标记于本体上,制备本体-吖啶酯类化合物复合物;
活化本体-吖啶酯类化合物复合物,制备活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物;
将活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物与环肽进行偶联反应。
本发明还提供一种检测试剂盒,包括上述吖啶标记复合物。
在一个具体的示例中,检测试剂盒还包括包被了的捕获抗体,以及抗原的磁珠;其中,包被了的捕获抗体可与待测物质及吖啶标记复合物经免疫结合形式形成包被了的捕获抗体-待测物质-吖啶标记复合物的夹心结构。
在一个具体的示例中,检测试剂盒还包括校准品、稀释用缓冲液、样本稀释剂、蛋白保护剂和发光底物中的一种或多种。
以下结合具体实施例对本发明的环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料,如无特别说明,均为市售产品。
实施例中所提供的环肽均为外购,从生工生物工程(上海)股份有限公司购买。
实施例1
本实施例提供一种含有环肽的吖啶标记复合物及其制备方法,具体如下:
一、环肽
本实施例提供的环肽为(Seq_1~Seq_2):
Cys-Glu-Glu-Asp-环(Lys-Ala-Phe-Tyr-Trp-Leu-Pro-Trp-Phe-Asp)-Gly-Ile-Ala;其中,Cys为反应基团;
其结构式如下所示:
二、吖啶标记复合物及其制备方法
本实施例以S100蛋白检测项目为本体目标,具体步骤如下:
1、检测抗体标记吖啶
(1)取1mg的S100蛋白检测抗体,加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度1mg/mL;
(2)将吖啶酯NSP-DMAE-NHS粉末溶于DMSO,配置成5mg/mL的吖啶酯溶液;
(3)往S100蛋白检测抗体溶液中加入30uL的吖啶酯溶液,25℃反应3h;
(4)加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL,进行淬灭反应;
(5)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的吖啶酯。
2、活化检测抗体吖啶标记物
(1)检测抗体吖啶标记物加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度1mg/mL;
(2)加入SM(PEG)4的DMSO溶液(10mg/mL)20uL,25℃反应2h;
(3)加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL,进行淬灭反应;
(4)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的吖啶酯。
3、环肽修饰检测抗体吖啶标记物
(1)活化好的检测抗体吖啶标记物加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度10mg/mL;
(2)取上述环肽,溶在15%DMF溶液中,浓度为2mg/mL;
(3)取100uL环肽溶液,加到活化好的检测抗体吖啶标记物中,25℃反应6h。
(4)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去未反应的环肽。
(5)环肽修饰的吖啶标记物用保存液稀释后保存。
实施例2
本实施例提供一种含有环肽的吖啶标记复合物及其制备方法,具体如下:
一、环肽
本实施例提供的环肽为(Seq_3):6-马来酰亚胺基己酸-Glu-Lys-Arg-Lys-环(Lys-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Val-Glu)-Phe-Tyr-His;其中,6-马来酰亚胺基己酸为反应基团;
其结构式如下所示:
本实施例提供的环肽衍生物为:6-马来酰亚胺基己酸-Glu-Lys-Arg-Lys-环(Lys-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Val-Glu)-Phe-Tyr-His-NH2。
二、吖啶标记复合物及其制备方法
本实施例以PIVKA-II检测项目为本体目标,具体步骤如下:
1、活化检测抗体
(1)取1mgPIVKA-II检测抗体,加入PBS溶液(100mM、pH8.0),浓度2mg/mL;
(2)将Traut’s Reagent溶于水中,配置成10mg/mL的溶液;
(3)往PIVKA-II检测抗体溶液中加入10uL的Traut’s Reagent试剂溶液,25℃反应1.5h;
(4)使用30KDa的超滤管进行纯化,除去游离的Traut’s Reagent。
2、环肽修饰检测抗体
(1)活化好的检测抗体加入PBS溶液(100mM、pH7.2),浓度5mg/mL;
(2)将上述环肽衍生物溶在20%DMF溶液中,浓度为2mg/mL;
(3)往活化好的检测抗体溶液中加入环肽溶液100uL,25℃反应2h;
(4)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的吖啶酯。
3、环肽修饰的检测抗体标记吖啶
(1)环肽修饰的检测抗体加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度1mg/mL;
(2)将吖啶酯NSP-SA-NHS粉末溶于DMSO,配置成5mg/mL的吖啶酯溶液;
(3)往环肽修饰的检测抗体溶液中加入30uL的吖啶酯溶液,25℃反应2h;
(4)加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL,进行淬灭反应;
(5)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的吖啶酯;
(6)环肽修饰的吖啶标记物用保存液稀释后保存。
实施例3
本实施例提供一种含有环肽的吖啶标记复合物及其制备方法,具体如下:
一、环肽
本实施例提供的环肽为(Seq_4):
Alkyne-PEG6-Asp-Arg-环(Lys-Trp-His-Tyr-His-Phe-Glu)-Trp-Phe;其中Alkyne-PEG6为反应基团;
其结构式如下所示:
二、吖啶标记复合物及其制备方法
本实施例以FDP检测项目为本体目标,具体步骤如下:
1、检测抗体标记吖啶
(1)取FDP检测抗体,加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度1mg/mL;
(2)将吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS粉末溶于DMSO,配置成5mg/mL的吖啶酯溶液;
(3)往FDP检测抗体溶液中加入20uL的吖啶酯溶液,25℃反应3h;
(4)加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL,进行淬灭反应;
(5)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的吖啶酯。
2、活化检测抗体吖啶标记物
(1)检测抗体吖啶标记物加入PBS溶液(50mM、pH7.4),浓度1mg/mL;
(2)加入NHS-PEG4-Azide的DMSO溶液(10mg/mL)10uL,25℃反应2h;
(3)加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL,进行淬灭反应;
(4)使用10KDa的超滤管进行纯化,除去游离的NHS-PEG4-Azide。
3、环肽修饰检测抗体吖啶标记物
(1)活化好的检测抗体吖啶标记物加入PBS溶液(150mM、pH7.4),浓度10mg/mL;
(2)将上述环肽溶在10%DMF溶液中,浓度为4mg/mL;
(3)取500uL环肽溶液,加到活化好的检测抗体吖啶标记物中,加入硫酸铜溶液,使硫酸铜的终浓度为0.5mM,37℃反应1h;
(4)使用10KDa的超滤管进行纯化;
(5)环肽修饰的吖啶标记物用保存液稀释后保存。
对比例1
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例1几乎一致,不同在于,对比例1省略了检测抗体吖啶标记物的活化步骤和多肽修饰的步骤,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例1一样。
即相对于实施例1,对比例1所提供的检测抗体吖啶标记物中没有多肽修饰。
对比例2
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例1几乎一致,不同在于,对比例2所用的环肽序列为Cys-Glu-Glu-Asp-环(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp)-Gly-Ile-Ala,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例1一样。
即相对于实施例1,对比例2所提供的环肽的AA2的序列变更为:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys。
对比例3
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例2几乎一致,不同在于,对比例3省略了检测抗体的活化步骤和多肽修饰的步骤,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例2一样。
即相对于实施例2,对比例3所提供的检测抗体吖啶标记物中没有多肽修饰。
对比例4
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例2几乎一致,不同在于,对比例4所用的环肽序列为6-马来酰亚胺基己酸-Glu-Lys-Arg-Lys-环(Lys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Glu)-Phe-Tyr-His,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例2一样。
即相对于实施例2,对比例4所提供的环肽的AA2的序列变更为:
Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg。
对比例5
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例3几乎一致,不同在于,对比例5省略了检测抗体吖啶标记物的活化步骤和多肽修饰的步骤,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例3一样。
即相对于实施例3,对比例5所提供的检测抗体吖啶标记物中没有多肽修饰。
对比例6
本对比例提供的检测抗体吖啶标记物的制备过程与实施例3几乎一致,不同在于,对比例6所用的环肽序列为Alkyne-PEG6-Asp-Arg-环(Lys-Glu-Arg-Asp-Lys-Asp-Glu)-Trp-Phe,其标记物在保存液中的最终浓度与实施例3一样。
即相对于实施例3,对比例6所提供的环肽的AA2的序列变更为:
Glu-Arg-Asp-Lys-Asp。
效果验证试验
性能检测一
将实施例1、对比例1、对比例2中得到的吖啶酯标记物分别应用于S100蛋白的化学发光免疫分析检测,采用iStar 500全自动化学发光测定仪(深圳市卓润生物科技有限公司),S100蛋白化学发光试剂盒半成品进行测试。具体步骤包括:取不同的样本50uL,分别加入50uL捕获抗体包被的磁珠工作液和实施例1、对比例1与对比例2制备的工作液50uL,37℃反应10min后,磁分离清洗3次,各组分分别先后加入100uL的HNO3-H2O2溶液和100uL的NaOH溶液,用iStar 500全自动化学发光测定仪测量发光值,平行进行3次测量,取平均值。样本包含校准品,阴性样本阳性样本和假阳样本。假阳样本为2000例阴性血清中筛选出来的5例发光值很高的样本,经罗氏试剂盒测试确认为阴性。测试结果如表1所示。
表1
由表1可知,采用实施例1的多肽修饰后的吖啶酯标记物降低了阴性血清的发光值,而中高值的校准品和阳性样本的信号和没有多肽修饰的对比例2变化不太大。采用对比例2的多肽修饰后的吖啶标记物测定的阴性血清的发光值比不修饰的对比例1测定的发光值还高。对于5例假阳样本,对比例1、对比例2的测试发光值都很高,显示为阳性,而改用实施例1的多肽修饰的抗体吖啶标记物进行测试,发光值都很低,属于阴性样本,测试结果和罗氏的一致。
性能检测二
将实施例2、对比例3、对比例4中得到的吖啶酯标记物分别应用于PIVKA-II的化学发光免疫分析检测,采用iStar 500全自动化学发光测定仪(深圳市卓润生物科技有限公司),PIVKA-II化学发光试剂盒半成品进行测试。具体步骤包括:取不同的样本10uL,分别加入50uL捕获抗体包被的磁珠工作液,37℃反应5min后,加入实施例2、对比例3与对比例4制备的工作液50uL,37℃反应5min后,磁分离清洗3次,各组分分别先后加入100uLHNO3-H2O2溶液和100uL的NaOH溶液,用iStar 500全自动化学发光测定仪测量发光值,平行进行3次测量,取平均值。样本包含校准品,阴性样本阳性样本和假阳样本。假阳样本为2000例阴性血清中筛选出来的5例发光值很高的样本,经雅培试剂盒测试确认为阴性。测试结果如表2所示。
表2
由表2可知,采用实施例2的多肽修饰后的吖啶酯标记物降低了阴性血清的发光值,而中高值的校准品和阳性样本的信号和没有多肽修饰的对比例3稍微增大。采用对比例4的多肽修饰后的吖啶标记物测定的阴性血清的发光值比不修饰的对比例3测定的发光值还高。对于5例假阳样本,对比例3、对比例4的测试发光值都很高,显示为阳性,而改用实施例2的多肽修饰的抗体吖啶标记物进行测试,发光值都很低,属于阴性样本,测试结果和雅培的一致。
性能检测三
将实施例3、对比例5与对比例6中得到的吖啶酯标记物分别应用于FDP的化学发光免疫分析检测,采用iStar 500全自动化学发光测定仪(深圳市卓润生物科技有限公司),FDP化学发光试剂盒半成品进行测试。具体步骤包括:取不同的样本10uL,分别加入50uL捕获抗体包被的磁珠工作液和实施例3、对比例5与对比例6制备的工作液50uL,37℃反应10min后,磁分离清洗3次,各组分分别先后加入100uL的HNO3-H2O2溶液和100uL的NaOH溶液,用iStar500全自动化学发光测定仪测量发光值,平行进行3次测量,取平均值。样本包含校准品,阴性样本阳性样本和假阳样本。假阳样本为1000例阴性血清中筛选出来的4例发光值很高的样本,经希森美康试剂盒测试确认为阴性。测试结果如表3所示。
表3
由表3可知,采用实施例3的多肽修饰后的吖啶酯标记物降低了阴性血清的发光值,而中高值的校准品和阳性样本的信号和没有多肽修饰的对比例5稍微降低。采用对比例6的多肽修饰后的吖啶标记物测定的阴性血清的发光值比不修饰的对比例5测定的发光值还高。对于4例假阳样本,对比例5、对比例6的测试发光值都很高,显示为阳性,而改用实施例3的多肽修饰的抗体吖啶标记物进行测试,发光值都很低,属于阴性样本,测试结果和希森美康的一致。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.一种环肽在制备化学发光标记物中的应用,所述环肽的结构为PG-(AA1)-环(Lys-(AA2)-(AA3))-(AA4);
其中,AA3选自Asp或Glu;
AA1为包含1至4个亲水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
AA2为包含3至10个疏水性氨基酸的多肽;
AA4为包含1至5个疏水性氨基酸的氨基酸、二肽或多肽;
PG为含有一个或多个反应位点的反应基团。
2.根据权利要求1所述的环肽在制备化学发光标记物中的应用,其特征在于,所述AA1中,所述亲水性氨基酸每次出现,独立地选自Asp、Glu、Lys或Arg。
3.根据权利要求1所述的环肽在制备化学发光标记物中的应用,其特征在于,所述AA2中,所述疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
4.根据权利要求1所述的环肽在制备化学发光标记物中的应用,其特征在于,所述AA4中,所述疏水性氨基酸每次出现,独立地选自Gly、Ala、Pro、Leu、Ile、Val、Phe、Trp、His或Tyr。
5.根据权利要求1所述的环肽在制备化学发光标记物中的应用,其特征在于,所述反应位点独立选自氨基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、膦基或叠氮基。
6.根据权利要求1~5任一项所述的环肽在制备化学发光标记物中的应用,其特征在于,所述化学发光标记物为吖啶标记复合物。
7.一种吖啶标记复合物,其特征在于,包括本体、连接于所述本体上的活化片段、连接于所述活化片段上的如权利要求1~5任一项所述的环肽,以及标记于所述本体上的或同时标记于所述本体与所述环肽上的吖啶酯类化合物。
8.根据权利要求7所述的吖啶标记复合物,其特征在于,所述本体为抗原、半抗原或抗体。
9.根据权利要求7所述的吖啶标记复合物,其特征在于,所述吖啶酯类化合物选自NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS或NSP-DMAE-HEG-NHS。
10.一种如权利要求7~9任一项所述的吖啶标记复合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
活化所述本体,制备活化片段-本体复合物;
将所述活化片段-本体复合物与所述环肽进行偶联反应,制备环肽-活化片段-本体复合物;
将吖啶酯类化合物标记于所述环肽-活化片段-本体复合物上;或
将吖啶酯类化合物标记于所述本体上,制备本体-吖啶酯类化合物复合物;
活化所述本体-吖啶酯类化合物复合物,制备活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物;
将所述活化片段-本体-吖啶酯类化合物复合物与所述环肽进行偶联反应。
11.一种检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求7~9任一项所述的吖啶标记复合物。
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