TW202408575A - 奧布替尼與ｔａｆａｓｉｔａｍａｂ聯合用藥治療 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及兩種藥物的組合的使用：布魯頓酪氨酸激酶（BTK）抑制劑奧布替尼和抗CD19抗體如tafasitamab，或三種藥物的組合藥物：布魯頓酪氨酸激酶（BTK）抑制劑奧布替尼、抗CD19抗體如tafasitamab和免疫調節劑來那度胺，用於治療B細胞惡性腫瘤如非霍奇金氏淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，或急性淋巴細胞白血病。
Description
本發明涉及使用Bruton-酪氨酸激酶（BTK）抑制劑奧布替尼與抗CD19特異性抗體Tafasitamab的兩藥聯用，任選的與免疫調節劑來那度胺組合，用於治療CD19抗原陽性的B淋巴細胞惡性腫瘤患者。
淋巴瘤是淋巴系統的惡性腫瘤，近年來淋巴瘤發病率逐年增高。淋巴瘤的病理類型繁雜、治療方法多樣。B細胞淋巴瘤的治療方案通常選用利妥昔單抗聯合化療CHOP（R-CHOP）方案，或化療方案，例如環磷醯胺、長春新堿、多柔比星和***的CVAD方案。儘管如此，對於復發或難治性非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）（如彌漫性大細胞淋巴瘤（DLBCL）、套細胞淋巴瘤（MCL）和濾泡淋巴瘤（FL））患者仍有未滿足的醫療需求，新的治療方案亟待開發。
近年來新型分子靶向藥物成為重要開發方向，如Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制劑，該類抑制劑已在治療B細胞淋巴瘤中顯示出較好療效。奧布替尼（Orelabrutinib）是的新一代高選擇性Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制劑，奧布替尼通過高度特異性地與BTK共價結合，不可逆抑制BTK活性，進而抑制BCR信號通路的啟動，減少B細胞惡性增殖並誘導細胞的凋亡，從而發揮治療B細胞相關惡性腫瘤的作用。
奧布替尼已在中國獲批用於治療復發/難治慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、以及復發/難治性套細胞淋巴瘤(MCL)兩項適應症。除此之外，奧布替尼還在中國開展治療邊緣區淋巴瘤(MZL)、中樞神經系統淋巴瘤(CNSL)、華氏巨球蛋白血症(WM)及彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)在內的多種B細胞淋巴瘤的臨床試驗。
B細胞惡性淋巴瘤藥物開發的另一個重要靶點為CD19，其在B細胞惡性腫瘤上異常高表達，如大多數B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)等，因此成為重要的免疫治療靶點，有9款針對該靶點的藥物在全球獲批上市，包括單抗、雙抗、抗體毒素偶聯藥物（ADC）、嵌合抗原受體T細胞治療（CAR-T），其中，Tafasitamab是一款靶向CD19的新型的人源化Fc增強的單克隆抗體。與CD19結合後，Tafasitamab通過以下途徑介導B細胞裂解：1）與免疫效應細胞（如NK細胞、γδT細胞和巨噬細胞）結合；2）直接誘導細胞死亡（凋亡）。與具有未修飾Fc結構域的抗體相比，Tafasitamab的Fc結構域包含2個氨基酸取代S239D和I332E (Lazar et al., 2006)），提高了對效應細胞上啟動型Fcγ受體的親和性，尤其是對Fcγ受體IIIa，顯著增強Tafasitamab的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）。
來那度胺可啟動T細胞釋放細胞因數干擾素γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2），從而刺激NK細胞活性增強並誘導NK細胞增殖(Gribben et al., 2015; Kotla et al., 2009)。此外，來那度胺還能誘導NK細胞上的FcγRIII表達增加，該受體與Tafasitamab結合親和力較高(Lapalombella et al., 2008)。已發表的體外實驗結果表明，來那度胺可增強Tafasitamab介導的NK細胞活化和ADCC活性(Awan et al., 2010)。來那度胺也可以直接作用於腫瘤細胞，引起腫瘤細胞G0-G1細胞週期阻滯；P21
Cip1/Waf1和AP-1轉錄增強，促進NK-κB細胞通路啟動等方式引起直接腫瘤殺傷(Gribben et al., 2015)。
Tafasitamab
Tafasitamb是一種屬於免疫球蛋白（Ig）G1亞類的Fc增強人源化單克隆抗體（mAb）。其與B淋巴細胞表面的CD19抗原結合，從而導致B細胞耗竭。Tafasitamab是一種抗腫瘤藥物，ATC分類編碼為L01XC35。Tafasitamab是在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中通過重組DNA技術產生的，它是以二硫鍵連接的糖基化四聚體形式，由兩條相同的含有451個氨基酸重鏈和兩條相同的含有219個氨基酸κ輕鏈組成。Tafasitamab在重鏈序列的301位具有N-連接糖基化位點。Tafasitamab的品質約為150 KDa。兩條重鏈上各連接有一個單聚糖（US 10,617,691，CN 107660151 B）。Tafasitamab稱為MOR00208，被公開於美國專利10,617,691，該專利中關於MOR00208的資訊均作為參考文獻被援引至本申請。
Tafasitamab的可變重鏈VH序列為(SEQ ID NO: 1），EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFT
SYVMHWVRQAPGKGLEWIGYI
NPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCAR
GTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1)，其中包含重鏈的CDR1 (SYVMH, SEQ ID NO: 2), CDR2 (NPYNDG, SEQ ID NO: 3), and CDR3序列 (GTYYYGTRVFDY, SEQ ID NO: 4) ，如底線所示。
Tafasitamab的可變輕鏈VL序列為(SEQ ID NO: 5)：
DIVMTQSPATLSLSPGERATLSC
RSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIY
RMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYC
MQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO 5)，其中包含輕鏈CDR1 (RSSKSLQNVNGNTYLY, SEQ ID NO: 6), CDR2 (RMSNLNS, SEQ ID NO: 7), and CDR3序列 (MQHLEYPIT, SEQ ID NO: 8)，如底線所示。
Tafasitamab重鏈恒定結構域CH的序列如下：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：9)
Tafasitamab輕鏈恒定結構域CL的序列如下：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：10)。
奧布替尼
奧布替尼化學名：2-(4-苯氧基苯基)-6-[1-(丙-2-烯醯基)呱啶-4-基]吡啶-3-甲醯胺，分子式：C26H25N3O3分子量：427.5。其結構如下：
聯合用藥的協同係數分析
本發明涉及的協同係數的計算使用SynergyFinder網頁版應用程式（https://synergyfinderplus.org）分析藥物組合的協同作用，SynergyFinder包含Bliss、Loewe、HSA和ZIP等4個數學模型，4個模型的側重點不同，分別為：假設具有協同作用的藥物組合藥效大於單個藥物最大藥效(HSA)、假設每個藥物獨立產生作用，即單藥獨立作用的乘法效應(Bliss)、假設藥物不與自身相互作用且每個藥物具有相同的最大藥效(Loewe)以及與假設單藥不影響彼此的效力(ZIP)(Güvenç Paltun et al., 2021)，4種模型的計算方法見(Ianevski et al., 2020)。本研究中使用的是Loewe模型，協同得分的定義為：0分認為沒有效應，＜ -10分認為有強拮抗作用，-10~0分認為有拮抗作用，0~10分認為有疊加效應，＞10分認為有協同作用。
本發明涉及的是一種用於CD19抗原陽性表達的B細胞惡性腫瘤的治療方案。該治療方案是將BTK抑制劑奧布替尼與抗CD19特異性抗體或抗原特異性結合片段的聯合用於治療。
在特定實施例中，抗原特異性結合片段可能是Fab, Fab’, F(ab’)
2或單鏈可變區（scFv）。
在一個實施例中，抗CD19特異性抗體或CD19抗原特異性結合片段由重鏈VH和輕鏈VL構成，其中VH包含CDR1（SEQ ID NO: 2）、CDR2（SEQ ID NO: 3）和CDR3（SEQ ID NO: 4）序列，VL包含CDR1（SEQ ID NO: 6）、CDR2（SEQ ID NO: 7）和CDR3（SEQ ID NO: 8）序列。
在一個實施例中，抗CD19抗體或CD19抗原結合片段特異性由重鏈VH（SEQ ID NO: 1）和輕鏈VL（SEQ ID NO: 5）構成。
在一個優選實施例中，抗CD19抗體是Tafasitamab，或一段至少有95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，僅存在非CDR區或恒定區的差異。序列差異如氨基酸改變，特別是保守氨基酸的取代是本領域所熟知的。
本發明的治療方案能有效用於CD19抗原陽性的B細胞惡性腫瘤的治療，如非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性成淋巴細胞白血病的治療。非霍奇金氏淋巴瘤包括濾泡性淋巴瘤、黏膜相關樣組織淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套細胞淋巴瘤和邊緣區淋巴瘤。
CD19和BTK是B細胞惡性腫瘤的兩個關鍵致病靶點。本發明用CD19特異性抗體（如Tafasitamab）靶向CD19抗原，用奧布替尼靶向BTK。在不受任何特定理論約束情況下，Tafasitamab和奧布替尼聯合誘導CD19依賴性和BTK依賴性直接腫瘤殺傷，並具有協同腫瘤殺傷作用。
奧布替尼具有很強的激酶選擇性，不抑制白細胞介素-2-誘導性T細胞激酶（ITK）的活性。因此，Tafasitamab與奧布替尼聯用保留了Tafasitamab的ADCC活性。同樣不受到任何特定理論約束下，奧布替尼和Tafasitamab兩藥聯用同時啟動了BTK依賴性和CD19依賴性B細胞腫瘤殺傷。
本發明中奧布替尼可以口服給藥，劑量在50-250毫克/天或100-200毫克/天之間。奧布替尼可以在28天的治療週期中以約150mg的劑量每天一次口服給藥。奧布替尼可以每天在同一時間或大致相同的時間給藥，如空腹或飯後給藥。
本發明涉及的CD19特異性抗體Tafasitamab的給藥方式如下：使用靜脈給藥（IV）方式，基於體重的劑量範圍為每天8-30 mg/kg。在28天的治療週期內，給藥劑量為12 mg/kg，分別於第1週期第1、4、8、15、22天，第2-3週期第1、8、15、22天，第4-12週期第1、15天給藥。第13周開始直至疾病持續進展前，無疾病進展的病人將得到持續的奧布替尼單藥或與Tafasitamab兩藥聯用的治療。
本發明中涉及的“大約”或“約”(“About”)，表示結果中各數值上下浮動10%。
奧布替尼和抗CD19特異性抗體Tafasitamab可以同時或順序給藥。例如，奧布替尼可以在Tafasitamab給藥前服用，或奧布替尼和Tafasitamab可以同時或基本上同時給藥；奧布替尼也可以在Tafasitamab之後服用。
在一個實施例中，本發明還包括向受試者施用來那度胺。來那度胺是一種免疫調節劑，化學名稱為3-（7-氨基-3-氧代-1H-異吲哚-2-基）呱啶-2，6-二酮。來那度胺用於調節患者的免疫應答，還具有直接的腫瘤殺傷作用。
來那度胺可以口服5-25 mg /天的固定劑量。來那度胺可以口服約5毫克/天、10毫克/天、15毫克/天、20毫克/天和25毫克/天。
在一個實施例中，奧布替尼在Tafasitamab和來那度胺之前服用。在另一個實施例中，奧布替尼與Tafasitamab和來那度胺同時或基本同時給藥。在又一個實施例中，奧布替尼在Tafasitamab和來那度胺之後服用。
Tafasitamab與來那度胺和奧布替尼三藥聯合使用時，三種藥物都具有直接的腫瘤殺傷作用。此外，當奧布替尼與來那度胺和Tafasitamab三藥聯用時，Tafasitamab仍保留其較強的ADCC活性。三種藥物聯合使用具有協同增效作用，以免疫細胞啟動方式增強了腫瘤細胞的殺傷作用。
B 細胞惡性腫瘤具有高度異質性，個體患者由於其獨特的發病機制，可能對單藥治療的應答不盡相同。本發明的三藥聯用治療方案，通過多種作用機制（MOA）的疊加或協同效應，能給對奧布替尼、Tafasitamab和來那度胺具有不同臨床敏感性的患者提供更有效的治療選擇。在奧布替尼不敏感的腫瘤細胞中，三藥聯用可增強腫瘤殺傷效果。同樣，在Tafasitamab不敏感的腫瘤細胞中，三藥聯用也可以增強對腫瘤細胞的殺傷。本發明為CD19陽性B細胞惡性腫瘤提供了一種新的治療選擇。
本發明進一步提供了一種包含奧布替尼和Tafasitamab的配套治療方案，該方案也可以進一步包括來那度胺。在一個實施例中，奧布替尼以片劑或膠囊方式儲存。在一個實施例中，Tafasitamab是凍乾粉製劑方式儲存。在一個實施例中，Tafasitamab製劑在專利WO2018002031（US20190322742）中有詳細描述。在一個實施例中，來那度胺是片劑或膠囊方式儲存。奧布替尼以50mg規格片劑儲存於藥瓶中。Tafasitamab以200mg凍乾粉製劑的單劑量小瓶提供。來那度胺提供裝有2.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg或25mg各種規格膠囊的藥瓶。本發明的配套治療方案包含了奧布替尼、Tafasitamab和/或來那度胺的服用說明書。
在一個實施例中，奧布替尼以50mg /天至150mg /天的固定劑量口服給藥，Tafasitamab根據體重以8mg / kg至30mg / kg靜脈內給藥，來那度胺以5mg /天至25mg/天固定劑量給藥。
在28天的治療週期內，奧布替尼可以每天同一時間以150mg/天的劑量口服給藥。Tafasitamab可以在第1週期的第1，4，8，15，22天，週期2-3的第1，8，15，22天，週期4-12的第1天和第15天靜脈（IV）給藥。來那度胺可以在週期1-12每個週期的第1-21天，以每天25mg的劑量口服給藥。伊布替尼是一種小分子BTK抑制劑，通過與BTK不可逆結合能抑制B細胞增殖和存活。伊布替尼是第一個獲批的BTK抑制劑，與奧布替尼屬於同類藥物。本發明發現，當與Tafasitamab聯合用藥時，奧布替尼比伊布替尼具有療效優勢。
本發明比較了奧布替尼和伊布替尼分別與Tafasitamab聯用對後者ADCC活性的影響，奧布替尼維持了Tafasitamab的ADCC活性，但是伊布替尼降低或抑制了Tafasitamab的ADCC活性，並且伊布替尼與Tafasitamab聯用在某些實驗中呈現拮抗作用。
本發明還比較了Tafasitamab與來那度胺兩藥，分別與奧布替尼或伊布替尼三藥聯用時對Tafasitamab ADCC活性的影響。奧布替尼與來那度胺組合完全保留了Tafasitamab的ADCC功能，但是伊布替尼與來那度胺兩藥聯合抑制了Tafasitamab的ADCC效應。
本發明發現，奧布替尼在兩藥（與Tafasitamab聯用）和三藥（與Tafasitamab和來那度胺聯用）組合給藥中均優於伊布替尼，特別是400nM的給藥劑量，該劑量接近於奧布替尼和伊布替尼臨床相關有效劑量對應的的血漿暴露量。
以下實施例將對本發明做進一步闡述。這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
具體實施方式
實施例
1
、
TMD-8, RS4;11
和
REC-1
細胞
CD19
抗原表達驗證
TMD-8是一株人彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）細胞系，RS4;11為人急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞系，REC-1為人套細胞淋巴瘤（MCL）細胞系，本實施例中首先用流式細胞儀檢測了這些細胞系膜表面CD19的表達水準，將細胞與10μg/ml Tafasitamab或同型對照抗體室溫孵育20分鐘，洗掉未結合的Tafasitamab，加入1μL PE螢光素標記的抗人IgG-Fc抗體室溫避光孵育20分鐘，用NovoCyte Quanteon流式細胞儀(安捷倫)檢測CD19的結合比例。TMD-8，RS4;11 和REC-1細胞表面均表達CD19抗原（近100%），表達水準為RS4;11＞REC-1＞TMD-8。三種細胞結合Tafasitamab的百分比（%）和平均螢光強度（MFI）見圖1和表1。
表 1. 不同細胞系CD19表達強度比較
實施例 2 、奧布替尼與 Tafasitamab 兩藥聯用不抑制 Tafasitamab 基於報告基因的 ADCC 活性
| 細胞系 | CD19+ 細胞的百分比（% ） | CD19+ 的平均螢光強度 |
| TMD-8 | 99.74 | 267035 |
| RS4;11 | 99.98 | 374045 |
| REC-1 | 99.98 | 277610 |
抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（ADCC）是Tafasitamab的重要作用機制，Tafasitamab的Fc端的蛋白工程化已被用於改善其與FcγR的結合，所產生的抗體對FcγR的親和力相對于天然IgG1提高約100倍，使ADCC和ADCP得到顯著增強。與具有未修飾Fc結構域的抗體相比，Tafasitamab的Fc結構域進行了修飾（包含2個氨基酸取代S239D和I332E (Lazar et al., 2006)），提高對效應細胞上啟動型Fcγ受體的親和性，其中與Fcγ受體IIIa的親和力增幅最大。Tafasitamab的Fab端與CD19抗原結合的同時，其Fc端與NK細胞膜表面FcγRIIIA結合進而刺激NK細胞啟動，NK細胞中FcγR信號傳導部分依賴於ITK信號調控通路的啟動，ITK啟動了鈣信號傳導，顆粒酶釋放並誘導靶細胞殺傷(Khurana et al., 2007)，ITK和BTK同屬於TEC激酶家族，具有很高的同源性，Dubovsky等人報導伊布替尼（PCI -32765）不可逆的結合ITK激酶(Dubovsky et al., 2013)，進而抑制抗CD20抗體Rituximab的ADCC活性(Da Roit et al., 2015；Yu et al., 2021)。
在ADCC的報告基因實驗中，用北京康源博創生物科技有限公司構建的Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158作為效應細胞與CD19
+的TMD-8靶細胞按照1：1效靶比共同孵育4小時，此效應細胞的胞外區過表達高親和力FcγRⅢA CD16a-V158，與靶細胞TMD-8，和不同濃度的Tafasitamab（500 ng/mL起始，5倍稀釋）共孵育，抗體Fc端結合胞外區高親和力CD16a-V158啟動NFAT-luc2螢光素酶報告系統，通過CLARIOstar® Plus多功能酶標儀（BMG LABTECH）檢測螢光素酶強度以顯示Tafasitamab的ADCC活性。使用GraphPad Prism 7.0軟體分析資料，利用非線性回歸參數擬合S型曲線Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogIC
50-X)*HillSlope))來擬合數據得出劑量-效應曲線，其中Bottom表示螢光信號下限值，代表S曲線的下漸進線，Top表示螢光信號的上限值，代表著S曲線的上漸近線，IC
50為螢光信號增長速度開始發生變化的濃度值，即半效反應濃度（IC
50）。HillSlope為吸光度增加速率參數，相當於曲線的斜率，並由此計算IC
50值。
如圖2A和表2所示，奧布替尼與Tafasitamab聯用部分增強了Tafasitamab基於報告基因的ADCC活性。Tafasitamab單藥、或分別與400 nM和4000 nM奧布替尼兩藥聯用，其ADCC的IC
50分別為3.02 ng/mL, 2.18 ng/mL和2.93 ng/mL。雖然未達到顯著差異，但能看到奧布替尼聯合Tafasitamab比Tafasitamab單藥的ADCC活性有少許增強。在Tafasitamb的最高濃度點500 ng/mL，400 nM和4000 nM的奧布替尼與Tafasitamab聯用的ADCC活性相較于Tafasitamab單藥均有顯著性提高(p ＜ 0.001@400 nM，p ＜ 0.0001@4000 nM，Oneway ANOVA)，參見表2。伊布替尼在4000 nM高濃度情況下完全抑制了Tafasitamab的ADCC活性，在400 nM處理下顯著的抑制了Tafasitamab的ADCC活性(p ＜ 0.01@400 nM，p ＜ 0.0001@4000 nM，Oneway ANOVA)，見圖2A和表2。
使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同計算，結果如圖2B-D所示，4000 nM和400 nM兩個劑量下，奧布替尼與Tafasitamab兩藥聯用呈現疊加效應，其協同分數的平均值為3.72，然而伊布替尼與Tafasitamab的協同分數平均值為-11.61。
基於報告基因的ADCC實驗結果表明，奧布替尼略微增強了Tafasitamab的ADCC活性，兩藥聯用呈現疊加效應，但是伊布替尼抑制了Tafasitamab的ADCC效應，兩藥聯用呈現對ADCC的拮抗作用
表2. Tafasitamab聯合奧布替尼或伊布替尼時基於報告基因的ADCC活性
N/A：未檢測到。IC
50：半數抑制濃度。Emax：最大效應值。 ** p ＜ 0.01 vs. Tafasitamab組, **** p ＜ 0.0001 vs. Tafasitamab組。
| 處理組 | IC 50 (ng/mL) | Emax (Fold change) |
| Tafasitamab | 3.02 | 20.85 |
| Tafasitamab + 奧布替尼 4000 nM | 2.18 | 27.83 **** |
| Tafasitamab + 奧布替尼 400 nM | 2.93 | 24.61 ** |
| Tafasitamab + 伊布替尼 4000 nM | N/A | 1.07 **** |
| Tafasitamab + 伊布替尼 400 nM | 2.63 | 8.26 **** |
來那度胺作為免疫調劑劑，能促進CD28分子磷酸化，增強T細胞、NK細胞啟動；也直接參與調控細胞因數的分泌，促進IL-2，IFN-γ細胞因數釋放，同時抑制促炎細胞因數如TNFα釋放；來那度胺還可以直接促進腫瘤細胞的凋亡(Kotla et al., 2009)，因此Tafasitamab聯合來那度胺已經獲得FDA以及EMA有條件的批准，用於治療不適合自體幹細胞移植條件的復發或難治彌漫性大B細胞淋巴瘤成人患者。我們進一步利用報告細胞系研究奧布替尼與Tafasitamab聯合來那度胺三藥聯用對Tafasitamab ADCC活性的影響。
如圖3A和表3所示，1000 nM濃度的來那度胺和Tafasitamab分別與400 nM或4000 nM的奧布替尼三藥聯用，Tafasitamab的ADCC活性被保留，IC
50分別為2.39 ng/mL和2.36 ng/mL，相比Tafasitamab單藥和Tafasitamab聯合來那度胺（IC
50分別為3.02 ng/mL和2.17 ng/mL），無顯著差異。Emax反應了ADCC的最大活性，奧布替尼的三藥聯用與單藥或兩藥聯用在Tafasitamab最高濃度500ng/mL下的Emax值也相當，除了低劑量奧布替尼（400 nM）治療組約為降低（Emax = 18.9倍，p ＜ 0.01與Tafasitamab和來那度胺組合組相比）。相反，400 nM濃度伊布替尼三藥聯用顯著地降低了Tafasitamab的ADCC活性(IC
50= 2.04 ng/mL and Emax = 8.8-fold)，與Tafasitamab和來那度胺兩藥聯用組相比也顯著降低（p ＜ 0.0001）；高劑量4000 nM的伊布替尼進一步降低了Tafasitamab的ADCC活性，IC
50值無法擬合，Emax也只有1.92-fold（p ＜ 0.0001）。
使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同計算，4000 nM和400 nM兩個劑量下，奧布替尼與Tafasitamab和來那度胺聯用呈現出了非常微弱的拮抗效應，無統計學意義（平均協同作用得分= -0.94，p = 0.13，圖3B）;而與伊布替尼的三藥聯用則呈現出了強拮抗效應，二者協同分數的平均值為-11.63，p值為0.024（p ＜0.05）（如圖3C所示）。不同劑量水準下協同作用評分的動態變化如圖3D所示。在3種藥物組合中，奧布替尼很好地保留了的ADCC活性，但伊布替尼顯著抑制其ADCC功能。
綜上所述，在ADCC報告基因系統測定中，奧布替尼在兩藥或三藥組合中略微增強或很好地保留了Tafasitamab的ADCC活性，而伊布替尼的聯用卻抑制了Tafasitamab的ADCC活性。
表3. Tafasitamab聯合來那度胺與奧布替尼或伊布替尼時基於報告基因的ADCC活性
N/A：未檢測到。** p ＜ 0.01 vs. Tafasitamab + Lenalidomide 組, **** p ＜ 0.0001 vs. Tafasitamab + Lenalidomide組。
實施例 3 、奧布替尼不影響 Jurkat 效應細胞中 ITK 的磷酸化
| 處理組 | IC 50 (ng/mL) | Emax (Fold change) |
| Tafasitamab | 3.02 | 20.85 |
| Tafasitamab + 來那度胺 1000 nM | 2.17 | 20.64 |
| Tafasitamab + 來那度胺 1000 nM + 奧布替尼 4000 nM | 2.39 | 20.20 |
| Tafasitamab + 來那度胺 1000 nM + 奧布替尼 400 nM | 2.36 | 18.90** |
| Tafasitamab + 來那度胺 1000 nM + 伊布替尼 4000nM | N/A | 1.92**** |
| Tafasitamab + 來那度胺 1000 nM + 伊布替尼 400nM | 2.04 | 8.80**** |
為了進一步研究奧布替尼和伊布替尼在與Tafasitamab聯用時對Tafasitamab的ADCC活性影響的機制。選擇在Tafasitamab啟動ADCC過程中發揮重要作用的酪氨酸激酶ITK作為研究物件。ITK是TEC激酶家族中與BTK具有很高的同源性的一種酪氨酸激酶，在ADCC發揮作用的過程中，ITK接收NK細胞膜表面FcγR啟動信號而活化，進而促進下游鈣信號傳導，促使NK細胞釋放顆粒酶，從而實現對靶細胞殺傷。因此，本發明比較了TMD-8與Jurkat細胞系共培養系統中，奧布替尼和伊布替尼對Jurkat細胞中ITK磷酸化水準的影響。
收穫處於對數生長期的細胞並採用血小板計數器進行細胞計數。用台盼藍排斥法檢測細胞活力，確保細胞活力在90%以上。調整效應和靶細胞的細胞濃度；按照1：1的比例鋪細胞，效應細胞和靶細胞的總量為2 x 10^6 / 孔，將6孔板中的細胞置於37℃、5% CO
2、95%濕度條件下培養1小時。配製奧布替尼和伊布替尼溶液，在每孔加入10 µL藥物溶液，終濃度為4000 nM。分組如下：1.單藥組：Tafasitamab（3個濃度點），奧布替尼（4000 nM），伊布替尼（4000 nM）；2.聯合用藥組：Tafasitamab + 奧布替尼（4000 nM），Tafasitamab + 伊布替尼（4000 nM）；對照組(Veh, Vehicle)為DMSO。
將已加藥的6孔板中的細胞置於37 ℃、5% CO
2條件下繼續培養6小時。收集6孔板中的樣品，離心去上清後，加入70 µL RIPA裂解液，置於冰上裂解30分鐘，然後12000 rpm離心10分鐘，轉移上清至標記清晰的1.5 mL無菌離心管備用。上清加入4×上樣緩衝液，95 ℃加熱變性10分鐘。使用4-12% Tris-Glycine (Life Technologies, Carlsbad, CA)進行蛋白凝膠電泳，然後用半幹轉印電泳儀(Hoefer，MA)將蛋白轉移到PVDF膜。轉印後的PVDF膜用封閉液(LI-COR, Lincoln, NE)封閉1小時，然後與適當比例稀釋的一抗在4°C孵育過夜。孵育結束後，用1×TBST洗5次，然後加入LI-COR螢光標記的二抗(LI-COR, Lincoln, NE)，孵育1小時。孵育結束後，1×TBST洗5次後，于Odyssey® CLx成像系統(LI-COR, Lincoln, NE)上掃描成像。
試驗結果顯示，Tafasitamab單藥在各濃度對BTK和ITK蛋白的磷酸化水準和總蛋白水平均無明顯影響（圖4A-C）。BTK抑制劑和Tafasitamab聯用結果表明，奧布替尼和伊布替尼的聯用組均顯著下調了BTK的磷酸化水準（圖4A和4B），奧布替尼和伊布替尼在兩藥聯用中的BTK磷酸化水準與總蛋白的比值分別下降約73.5%和81.5%（圖4B）。有趣的是，與對照組相比，所有奧布替尼單藥或兩藥聯用組的磷酸化ITK蛋白均未改變（圖4A-C）；與之相反，伊布替尼和Tafasitamab聯用導致ITK蛋白的磷酸化水準明顯降低，平均值為53.7% (圖4A-C），由此證明ITK磷酸化的脫靶抑制僅與伊布替尼有關，而與奧布替尼無關。
總之，BTK抑制劑伊布替尼和奧布替尼在TMD-8和Jurkat共培養測定中均可有效抑制BTK磷酸化。然而，這兩種BTK抑制劑對ITK的磷酸化呈現不同的活性，即伊布替尼能有效抑制ITK磷酸化，這至少部分解釋了其在Tafasitamab的ADCC活性中的拮抗作用；另外，奧布替尼是一種高選擇性的BTK抑制劑，對ITK活性沒有抑制作用，這賦予其保留Tafasitamab的ADCC活性的能力。
實施例 4 、奧布替尼不影響 Tafasitamab 介導的原代 NK 細胞對 CD19+ 腫瘤細胞系的殺傷
基於報告基因的ADCC活性結果提供了強有力的證據，表明高選擇性BTK抑制劑奧布替尼在兩藥或三藥組合中適度增強或很好地保留了Tafasitamab的ADCC活性，而伊布替尼由於其對ITK的脫靶作用而抑制了Tafasitamab的ADCC活性。為了進一步驗證來自不同健康供體的人外周血單核細胞（PBMC）的原代NK細胞是否具有相同的作用，用不同健康供體人外周血單核細胞PBMC來源的原代NK細胞作為效應細胞，分別用CD19+的RS4;11（ALL）和REC-1（MCL）細胞系作為靶細胞，進行ADCC殺傷實驗。正常的人PBMC通常含有60%的CD3+ T細胞、10%～20%的CD56+ NK細胞和10%的CD14+單核細胞。效靶比E:T=30:1的條件下，將PBMC來源的原代NK細胞與靶細胞RS4;11或REC-1共同孵育4小時或16小時。
Tafasitamab和奧布替尼/伊布替尼兩藥聯用的研究中，我們用1.6 μM的細胞標記染料CFSE（Carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，羧基螢光素琥珀醯亞胺酯，BD，#565082）標記靶細胞，測試藥物奧布替尼或伊布替尼設計兩個濃度點，分別為4000和400 nM，Tafasitamab進行梯度稀釋，起始濃度為10 μg/mL，用完全培養基梯度系列稀釋5倍，共9個濃度點，最後加入PBMC，在37℃共孵育4小時。孵育結束後，用PBS清洗細胞兩遍，每孔加入100 μL含2 μL 7-AAD的PBS溶液染色，室溫避光孵育10分鐘，Tafasitamab的ADCC活性由靶細胞的裂解速率測定，用NovoCyteQuanteon流式細胞儀(安捷倫)進行檢測。
圖5A顯示在供體1來源的原代NK細胞介導的ADCC實驗中，Tafasitamab單藥具有濃度依賴的ADCC活性，低濃度的伊布替尼聯用不影響Tafasitamab的ADCC活性，但是4000 nM高濃度的伊布替尼完全抑制了Tafasitamab的ADCC活性，與之相比，400 nM濃度下奧布替尼增強了Tafasitamab的ADCC活性，提高濃度至4000 nM並未影響Tafasitamab的ADCC活性。使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同計算，結果如圖5B-D所示，奧布替尼和伊布替尼的協同分數的平均值分別為5.51和-5.81。圖5D顯示，奧布替尼在4000 nM劑量時，不影響Tafasitamab的ADCC功能，但在400 nM劑量下實現了增效作用；而伊布替尼伊布替尼在4000nM的劑量下呈現強烈的拮抗作用，在400nM的劑量下沒有效果。
圖5E和表4顯示在供體2來源的原代NK細胞介導的ADCC實驗中，Tafasitamb對RS4;11細胞具有很強的ADCC活性，其單藥的最大腫瘤裂解率（Emax）在10 μg/mL處理組達到72.24%，與400 nM奧布替尼聯用完全保留了Tafasitamab的ADCC活性，擬合曲線幾乎與Tafasitamb單藥完全重合，4000 nM高濃度的奧布替尼對Tafasitamab的ADCC活性有輕微的抑制（Emax為46.34%），相反，當與400nM或4000nM劑量的伊布替尼聯合使用時，Tafasitamab的ADCC活性受到嚴重抑制，無法擬合IC
50值，Emax分別為23.18%和6.44%。使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同計算，結果如圖5F-H所示，奧布替尼和伊布替尼的平均協同分數分別為-8.61和-45.6，伊布替尼呈現明顯的拮抗作用（p = 0.0046）。如圖5H顯示，奧布替尼在4000nM劑量下也顯示出拮抗作用，但在400nM劑量下保留了Tafasitamab的ADCC活性，兩個劑量的奧布替尼與Tafasitamab聯用對ADCC活性的影響沒有統計學意義（p = 0.37）。
儘管來自不同供體的NK細胞活性存在差異，但是通過原代NK細胞介導的ADCC活性分析，進一步驗證了基於報告基因ADCC活性的結果，兩種不同的方法共同驗證了BTK抑制劑與Tafasitamab的兩藥聯用，奧布替尼比伊布替尼更好地維持了Tafasitamab的ADCC功能，特別是在400nM的較低劑量給藥水平。
表 4. Tafasitamab 聯合奧布替尼或伊布替尼在原代 PBMC 來源 NK 細胞的 ADCC 活性
N/A：未檢測到。
| 處理組（PBMC 供體2 ） | IC 50 (ng/mL) | Emax (% Lysis) |
| Tafasitamab | 1.76 | 72.24 |
| Tafasitamab + 奧布替尼 4000 nM | 3.66 | 46.34 |
| Tafasitamab + 奧布替尼 400 nM | 2.47 | 67.55 |
| Tafasitamab + 伊布替尼 4000 nM | N/A | 6.44 |
| Tafasitamab + 伊布替尼 400 nM | N/A | 23.18 |
接下來用PBMC來源的原代NK細胞探索奧布替尼對Tafasitamab聯合來那度胺的ADCC活性影響。用1.6 μM的CFSE標記靶細胞REC-1，加入測試藥物，奧布替尼或伊布替尼測試2個濃度點，分別為400 nM和4000nM，來那度胺的測試濃度為1000 nM，Tafasitamab進行梯度稀釋，起始濃度為10 μg/mL，用完全培養基梯度系列稀釋5倍，共10個濃度點，最後加入攜帶高親和力FcγRIIIA 158 V/V基因型的PBMC用作效應細胞，在37℃共孵育16小時。孵育結束後，用PBS清洗細胞兩遍，每孔加入100 μL含2 μL 7-AAD的PBS溶液染色，室溫避光孵育10分鐘，用NovoCyteQuanteon流式細胞儀(安捷倫)檢測靶細胞的活性。
如圖6A所示，在400 nM和4000 nM兩個劑量下，低濃度的奧布替尼幾乎不影響Tafasitamab和來那度胺聯用的ADCC活性，高濃度的奧布替尼則有部分抑制。同樣在兩個測試濃度下，伊布替尼顯著的降低了Tafasitamab和來那度胺聯用的ADCC活性。這與報告細胞系的活性結果一致，體外原代NK細胞的ADCC活性結果也提示，與Tafasitamab和來那度胺的3藥聯用，奧布替尼由於能夠維持Tafasitamab的ADCC活性，與伊布替尼相比呈現聯合用藥的療效優勢。
使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同分析，結果如圖6B-D所示，奧布替尼和伊布替尼的平均協同分數分別為-4.1和-20.01。奧布替尼在400 nM劑量時，聯合用藥對Tafasitamab的ADCC活性無影響或有較弱的濃度依賴的疊加效應，但在4000 nM劑量時，則呈現拮抗效應，而伊布替尼在這兩個劑量下，均呈現出了強拮抗效應。
用PBMC來源的原代NK細胞作為效應細胞，進一步驗證了奧布替尼在兩藥物或3藥物聯用中保留Tafasitamab的ADCC活性方面優於伊布替尼，特別是在400nM的低劑量下。值得注意的是，400nM劑量的BTK抑制劑也有臨床相關性，該劑量接近於奧布替尼或伊布替尼的臨床有效劑量下患者的血漿暴露量。
實施例 5 、奧布替尼聯合 Tafasitamab 以及來那度胺改善直接的腫瘤殺傷力
Tafasitamab對表達CD19的B細胞惡性腫瘤具有直接細胞毒性，Tafasitamab的Fc端與FcγR的強親和力，在FcγR介導的抗體交聯作用下，進一步增強其細胞殺傷活性。我們通過將抗人的IgG Fc的二抗包被在細胞培養板上，來增強Tafasitamab的FcγR交聯和對RS4；11（ALL）和TMD-8（DLBLC）細胞的直接細胞殺傷活性。另外，來那度胺也被證實具有直接的腫瘤殺傷作用(Kim et al., 2013)，奧布替尼抑制BTK活性，從而導致BCR信號傳導通路阻斷和對腫瘤細胞生長的抑制。
為進一步研究Tafasitamab和來那度胺以及奧布替尼三藥聯用時，是否存在不依賴於免疫調節的直接腫瘤殺傷活性。用20 μg/mL 的human IgG包被96-U孔板，100 μL/孔，4℃包被過夜。次日，棄掉包被液後，加入不同濃度的Tafasitamab，每孔加入40 μL Tafasitamab溶液，37℃孵育2小時。依據細胞生長特性，于96-U孔板中，每孔接種40 μL共3000個受試細胞（RS4;11），再分別加入Tafasitamab和奧布替尼或伊布替尼，各10 μL，來那度胺濃度為1000 nM，奧布替尼濃度為400 nM，在37℃培養72小時。培養結束後，取出96-U孔板平衡至室溫，加入50 μL的CTG-Glo試劑(Promega, Madison, WI)，輕微震盪混勻，於30分鐘內用Envision多功能微孔板檢測儀(Perkin Elmer, Waltham, MA)檢測螢光信號。
如圖7A所示，RS4;11細胞對來那度胺單藥很敏感（1000nM來那度胺引起RS4;11細胞殺傷，腫瘤裂解率為84%），對Tafasitamab中度敏感（0.64 ng/mL單藥作用下導致2.4% RS4;11細胞凋亡，16 ng/mL促進24%的RS4;11細胞凋亡），但是對奧布替尼不敏感（0%的細胞殺傷）。Tafasitamab和奧布替尼兩藥聯用明顯增強了RS4;11腫瘤殺傷，殺傷率為58-66%。在與來那度胺聯用的兩藥或三藥中，即Tafasitamab /來那度胺或Tafasitamab /來那度胺/奧布替尼，來那度胺驅動了有效腫瘤殺傷，導致腫瘤溶解率為83%至87%。
如圖7B所示，TMD-8細胞對所有三種單藥呈現中等敏感，1000nM來那度胺的腫瘤細胞裂解率為45%，奧布替尼為42%，系列濃度梯度Tafasitamab裂解率為14-29%。Tafasitamab無論與來那度胺還是奧布替尼兩藥聯用均增強了腫瘤殺傷，腫瘤細胞裂解率分別為52-71%和47-55%。Tafasitamab和來那度胺聯合奧布替尼三藥聯用進一步提高了腫瘤殺傷作用，腫瘤裂解率升至91-94%。
綜上所述，在奧布替尼與Tafasitamab和來那度胺聯用對直接腫瘤裂解活性的評估中發現，不同的B細胞腫瘤，無論它們對測試藥物的單藥反應如何，3藥聯用都可以有效增強腫瘤細胞殺傷作用。這一發現反映了一種備受關注的臨床現象，即B細胞惡性腫瘤具有高度異質性。個體患者由於其獨特的發病機制，可能對單一藥物的反應不盡相同，但是，奧布替尼與Tafasitamab和來那度胺的聯合用藥可能通過疊加或協同的腫瘤殺傷作用來提供有效的治療方案。
實施例 6 、奧布替尼增強了 Tafasitamab 與來那度胺聯用在 PBMC 共培養條件下腫瘤細胞的殺傷活性
來那度胺聯合Tafasitamab可以通過不同的作用機理促進腫瘤細胞殺傷，1）來那度胺增強NK細胞和γδT細胞介導的Tafasitamab的ADCC活性，2）來那度胺增強CD4+, CD8+T效應T細胞活性，從而增強對CD19+T細胞的殺傷作用，3）來那度胺和Tafasitamab均可以可以直接促進腫瘤細胞凋亡，產生直接腫瘤殺傷作用。為了研究奧布替尼是否可以在免疫細胞存在的情況下提高Tafasitamab和來那度胺的腫瘤殺傷活性，通過體外靶細胞與PBMC共培養來模擬以上三種機制綜合作用下3藥聯用對靶細胞的殺傷。
REC-1（MCL）細胞系作為靶細胞，在效靶比為1:1的條件下與PBMC共培養。用1.6 μM的CFSE標記靶細胞，加入測試藥物（奧布替尼測試2個濃度點，為400 nM和4000 nM，來那度胺的測試濃度為1000 nM，Tafasitamab進行梯度稀釋，起始濃度為10 μg/mL，用完全培養基梯度系列稀釋5倍，共10個濃度點），最後加入PBMC，在37℃共孵育72小時。孵育結束後，用PBS清洗細胞兩遍，每孔加入100 μL含1 μL 7-AAD的PBS溶液染色，室溫避光孵育10分鐘，用NovoCyte Quanteon流式細胞儀(安捷倫)檢測靶細胞的活性。
結果如圖8A所示，奧布替尼或來那度胺的單藥僅誘導基線水準的腫瘤細胞殺傷。在低效靶比（:T=1:1）條件下，Tafasitamab單藥的殺傷活性很弱，Tafasitamab和奧布替尼聯用並沒有增強REC-1腫瘤細胞殺傷，Tafasimab聯合來那度胺可以很好的增強Tafasitamab的殺傷效果，最大裂解率（Emax）為46%（Tafasitamab @10μg/ mL）；而當奧布替尼和Tafasimab以及來那度胺三藥聯用時，Tafasitamab濃度梯度依賴的腫瘤殺傷進一步增強，Emax為61%（Tafasitamab @10μg/ mL）。
使用SynergyFinder對聯合用藥進行協同計算，比較Tafasitamab／奧布替尼／來那度胺三藥與Tafasitamab／來那度胺兩藥聯用的差異。結果如圖8B-C所示，奧布替尼的協同分數的平均值為16.31，表明三藥聯用有強協同作用，這種協同作用在奧布替尼劑量為50nM的較低劑量下比在400nM下更為突出，協同效應具有統計學顯著差異，p = 0.018，充分顯示了三藥聯合的潛在治療獲益。
實施例 7 、 Tafasitamab 與來那度胺和奧布替尼聯用增強了對 REC-1 小鼠異種移植瘤模型的體內抗腫瘤藥效
為了進一步確認Tafasitamab和來那度胺與奧布替尼聯用的治療益處，構建了REC-1的小鼠異種移植瘤模型，分別設置溶劑對照組，奧布替尼單藥組、Tafasitamab/來那度胺兩藥組，以及三藥聯用組，進行了體內腫瘤模型療效研究。
本實驗將45只6~8周齡的雌性CB17 SCID小鼠（由北京維塔爾河實驗動物科技有限公司提供）分別皮下接種1 x 10^6 REC-1細胞。腫瘤接種後第3天，根據體重將40只荷瘤小鼠隨機分為4組（每組10只）。根據預定的方案施用測試物品，如表5所示。
表 5. Tafasitamab 與來那度胺和奧布替尼聯用對 REC-1 小鼠異種移植瘤模型的體內藥效研究給藥方案
PO: 口服給藥；IV: 靜脈注射；QD: 每天1次；BID: 每天2次；BIW: 每週2次。
| 組別 | 處理組 | 動物數量 | 劑量（mg/kg ） | 給藥體積（mL/kg ） | 給藥方式 | 給藥時間 |
| 1 | 溶劑對照組 | 10 | - | 10 | PO | QD+BID |
| 2 | 奧布替尼 | 10 | 1 | 10 | PO | BID |
| 3 | Tafasitamab+來那度胺 | 10 | 3+30 | 10 | IV/PO | BIW*3weeks +QD |
| 4 | Tafasitamab+來那度胺+奧布替尼 | 10 | 3+30+1 | 10 | IV/PO/PO | BIW*3weeks +QD+BID |
在這項研究中，每週監測小鼠的腫瘤體積和體重3次。腫瘤體積超過2,000 mm
3的動物將被安樂死，這也是我們用於生存分析的腫瘤體積上限。
如圖9A所示，1mg/kg奧布替尼適度抑制REC-1腫瘤生長，3mg/kg的Tafasitamab和30mg/kg的來那度胺聯合給藥顯示出中等藥效；而Tafasitamab與來那度胺和奧布替尼的3藥聯用更加顯著抑制了REC-1腫瘤的生長。在整個研究過程中，任何給藥組的動物體重均沒有異常變化（圖9B）。在小鼠存活分析中，生存曲線如圖9C所示，存活率如表6所示，資料表明3藥聯用具有明顯的生存獲益，分組後38天（PG-D38）該組所有荷瘤小鼠均免於死亡，與其他治療組相比顯著改善存活率（p ＜ 0.0001）。
與體外藥效結果一致，REC-1異種移植腫瘤小鼠模型的體內藥效進一步證明了Tafasitamab與來那度胺和奧布替尼聯用可以在動物體內腫瘤模型中治療獲益。
表 6. Tafasitamab 、來那度胺和奧布替尼給藥後 REC-1 荷瘤小鼠的存活率
****p ＜ 0.0001
實施例 8 、奧布替尼和 Tafasitamab 聯合來那度胺分別在邊緣區淋巴瘤和彌漫性大 B 細胞淋巴瘤中的臨床安全性總結
| Survival Rate | 分組後27 天 | 分組後29 天 | 分組後31 天 | 分組後33 天 | 分組後35 天 | 分組後38 天 |
| 溶劑對照組 | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% |
| 奧布替尼，1 mg/kg | 50% | 30% | 20% | 20% | 10% | 0% |
| Tafasitamab+來那度胺，3+30 mg/kg | 100% | 100% | 100% | 100% | 70% | 40% |
| Tafasitamab+來那度胺+奧布替尼， 3+30+1 mg/kg | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100%**** |
在一項評價奧布替尼治療復發或難治性邊緣區淋巴瘤（r/r MZL）安全性和有效性的多中心、開放性臨床II期註冊研究（ICP-CL-00104）中，截至資料統計日期，共有111例受試者接受了奧布替尼治療，均納入安全性分析集，設置安全性終點為根據CTCAE V4.03評價的不良事件、生命體征和實驗室結果異常。中位治療時間為11.27個月（範圍：0.1，35.9個月）。76.6%的受試者治療時間超過5.5個月，治療時間達到至少11.0個月的受試者占53.2%。總體受試者依從性較好，中位藥物相對暴露強度為99.40%。安全性分析在111例安全性分析集中進行分析。安全性指標包括不良事件、實驗室檢查、生命體征、心電圖等。按照訪視對心電圖、臨床實驗室檢查等指標檢查結果，及其較基線的變化情況進行匯總，並以交叉表（根據正常值範圍或研究者對臨床意義的判斷）的形式列出所有完成的檢查項目及其例數和百分比。生命體征包括（血壓、體溫、心率、呼吸等），對生命體征資料進行描述，包括各時間點的值及其相對基線的改變量。
該研究描述了不良事件的數量和發生率，研究藥物相關不良事件，嚴重不良事件，以及導致停藥的不良事件。根據CTCAE分級匯總不良事件的發生率，列出所有不良事件的受試者清單。同時合併伊布替尼藥品說明書（Ibrutinib Label FDA 2022）的安全性資料，匯總如表7所示。
房顫和房撲是伊布替尼重要的不良事件，與脫靶效應有關，伊布替尼已有報導≥3級房顫和/或房撲發生率為3.7%。與之相反，本研究中未發生藥物相關的≥3級房顫和/或房撲事件。第二原發惡性腫瘤是BTK抑制劑需要特別關注的不良事件，本試驗觀察到1例第二原發惡性腫瘤，為胃腺癌且與研究藥物有關。而其他BTK抑制劑均有觀察到第二原發惡性腫瘤，且最低發生率為10%。本試驗中所有111例受試者中較少觀察到腹瀉，發生率僅為3.6%，且多為1-2級事件，與MZL人群發生率類似，其顯著低於伊布替尼43.0%的發生率。高血壓是伊布替尼的又一常見不良事件，在接受伊布替尼治療的受試者中發生率為14.0%，其中5.0%為3/4級事件。本試驗中高血壓發生3例（2.7%），≥3級及以上的有2例（1.8%）。
表7. BTK抑制劑治療復發難治MZL常見≥10%治療相關不良事件（TRAEs）列表
（奧布替尼 vs 伊布替尼）
NA：無法得到。
| 不良反應 | 奧布替尼 | 伊布替尼 1 | ||
| 研究ICP-CL-00104（N=111）* | 研究1121（N=63） | |||
| 所有級別（%） | 3級或4級（%） | 所有級別（%） | 3級或4級（%） | 所有級別（%） |
| 感染及侵染類疾病 | ||||
| 上呼吸道感染 | 1.8 | 9.9 | 0 | 21 |
| *** | 0 | 4.5 | NA | NA |
| 感染性肺炎 | 6.3 | 7.2 | 10 | 11 |
| 鼻竇炎 | 0 | 2.7 | 0 | 19 |
| 支氣管炎 | 0 | 0.9 | 0 | 11 |
| 胃腸系統疾病 | ||||
| 腹瀉 | 0.9 | 3.6 | 5 | 43 |
| 腹痛 | 0 | 1.8 | 2 | 16 |
| 噁心 | 0 | 0.9 | 0 | 25 |
| 消化不良 | 0 | 2.7 | 0 | 19 |
| 口腔黏膜炎 | 0 | 0 | 2 | 17 |
| 便秘 | 0 | 0 | 0 | 14 |
| 上腹痛 | 0 | 0.9 | 0 | 13 |
| 嘔吐 | 0 | 1.8 | 2 | 11 |
| 皮膚及皮下組織類疾病 | ||||
| 青腫 | 0 | 3.6 | 3 | 41 |
| 皮疹 | 0 | 16.2 | 2 | 29 |
| 瘙癢 | 0 | 2.7 | 3 | 19 |
| 各種肌肉骨骼及結締組織疾病 | ||||
| 骨骼肌肉疼痛 | 0 | 0 | 3 | 40 |
| 關節痛 | 0 | 2.7 | 2 | 24 |
| 肌痙攣 | 0 | 0 | 3 | 19 |
| 血管與淋巴類疾病 | ||||
| 出血 | 4.5 | 16.2 | 2 | 30 |
| 高血壓 | 1.8 | 2.7 | 5 | 14 |
| 全身性疾病及給藥部位各種反應 | ||||
| 疲乏 | 0 | 0.9 | 6 | 44 |
| 外周水腫 | 0.9 | 3.6 | 2 | 24 |
| 發熱 | 0 | 3.6 | 2 | 17 |
| 呼吸系統、胸及縱隔疾病 | ||||
| 咳嗽 | 0 | 5.4 | 2 | 22 |
| 呼吸困難 | 0 | 0 | 2 | 21 |
| 代謝及營養類疾病 | ||||
| 食欲減退 | 0 | 0 | 2 | 16 |
| 高尿酸血症 | 0 | 5.4 | 0 | 16 |
| 血白蛋白過少 | 0 | 0 | 0 | 14 |
| 血鉀過少 | 0 | 0 | 0 | 13 |
| 各類神經系統疾病 | ||||
| 頭暈 | 0 | 0.9 | 0 | 19 |
| 頭痛 | 0 | 0 | 0 | 13 |
| 精神類疾病 | ||||
| 焦慮 | 0 | 0 | 2 | 16 |
奧布替尼觀察到的不良事件主要是血液系統毒性和感染，總體發生率較低，臨床觀察和對症治療後多數恢復，無需調整奧布替尼劑量（如表8所示）。綜上所述，奧布替尼引起的治療風險均在可控範圍內，具有優異的安全性和整體耐受性。
表8. BTK抑制劑治療復發難治MZL常見血液學相關實驗室檢查異常列表
（奧布替尼 vs 伊布替尼）
NA：無法得到。
| 不良反應 | 奧布替尼 | 伊布替尼 1 | ||
| 研究ICP-CL-00104（N=111） | 研究1121（N=63） | |||
| 所有級別（%） | 3級或4級（%） | 所有級別（%） | 3級或4級（%） | 所有級別（%） |
| 血小板計數降低 | 1.8 | 17.1 | 6 | 49 |
| 血紅蛋白降低 | 0 | 0 | 13 | 43 |
| 中性粒細胞計數降低 | 7.2 | 24.3 | 13 | 22 |
| 貧血 | 3.6 | 27.0 | NA | NA |
該臨床試驗證實奧布替尼相比伊布替尼治療復發或難治性MZL受試者耐受性更好，大多數的不良事件發生率均低於伊布替尼等其他BTK抑制劑的報導結果。
另外，在一項評價來那度胺聯合Tafasitamab (曾用名：MOR00208)治療復發性或難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤（R/R DLBCL）患者的安全性和療效的II期、單臂、開放性、多中心臨床研究中（L-MIND，研究編號NCT02399085），Tafasitamab和來那度胺聯合治療的耐受性良好，治療期間觀察到的不良事件（Treatment Emergent Adverse Event，TEAE）反映了來那度胺的既定安全性特徵。
研究治療的中位暴露持續時間為9.2個月（範圍0.2 - 32.1個月）；30例（37.0%）患者接受了Tafasitamab和來那度胺的聯合治療期（12個週期）。34例（42.0%）患者從第13週期開始繼續接受Tafasitamab單藥治療。大多數TEAE為CTCAE 1級（743/1464例次）或2級（428/1464例次）。最常報告的 ≥3 級血液學TEAE為中性粒細胞減少症（39例 [48.1%] 患者）、血小板減少症（14例 [17.3%] 患者）、發熱性中性粒細胞減少症（10例 [12.3%] 患者）、白細胞減少症（7例 [8.6%] 患者）和貧血（6例 [7.4%] 患者）。最常報告的 ≥3 級非血液學TEAE為肺炎（5例 [6.2%] 患者）和低鉀血症（5例 [6.2%] 患者）。
綜上，奧布替尼治療邊緣區淋巴瘤的臨床資料顯示，其安全性優於伊布替尼，L-MIND臨床試驗也證實Tafasitamab聯合來那度胺治療彌漫性大B細胞淋巴瘤的安全性。這些臨床資料潛在支援奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用的臨床安全性優於伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用。
實施例 9 、奧布替尼在復發 / 難治的邊緣區淋巴瘤中單藥有效性臨床資料總結
在評估奧布替尼治療復發/難治的邊緣區淋巴瘤（r/r MZL）的有效性和安全性的II期多中心、開放性臨床試驗（ICP-CL-00104）中，奧布替尼給藥劑量為150 mg，每天一次（QD）。截至資料統計時間，共計90例受試者經病理中心確診為MZL，被納入修正全分析集（mFAS）中，主要研究終點為由獨立評估委員會（IRC）根據Lugano 2014標準進行評價的總體緩解率（ORR），次要終點為ORR、無進展生存期（PFS）、緩解持續時間（DOR）、起效時間（TTR）、疾病進展時間（TTP）、總生存期（OS）等，已在臨床研究中廣泛使用並得到認可。截至資料統計時間，IRC評價的總體緩解率ORR為58.9%（95% CI: 48.0, 69.2），最佳療效結果CR為8例（8.9%），PR為45例（50.0%）。mFAS中有83例受試者既往接受過抗CD20單抗的治療，由IRC評價的ORR為57.8%（95% CI: 46.5, 68.6），最佳療效結果CR為8例（9.6%），PR為40例（48.2%）
如上所述，奧布替尼在150 mg每天給藥（QD）劑量下治療復發或難治性邊緣區淋巴瘤MZL達到了預期的有效性結果，總體緩解率較歷史資料明顯提高，且臨床療效持續時間長，研究結果令人鼓舞。在經病理中心覆核確診為MZL的修正全分析集（mFAS）中，74例（82.2%）受試者基線期淋巴瘤分期≥III期。在總體較為晚期的受試者中，奧布替尼仍取得了令人鼓舞的療效結果。截至資料收集日期（中位元隨訪時間為18.9個月），IRC評估的mFAS受試者的總體緩解率（ORR）明顯優於伊布替尼（46%），完全緩解（CR）和部分緩解（PR）的受試者均比伊布替尼有所提高，如表9所示，奧布替尼在MZL受試者的治療中展示了良好的療效。
表9. 奧布替尼與伊布替尼在復發/難治MZL中總體最佳療效的比較(r/r MZL)
NE：未達到。
1伊布替尼說明書FDA 2020，
2(Noy et al., 2020)。
實施例 10 、奧布替尼固體分散體的製備
| 奧布替尼 | 伊布替尼 1 | ||
| 受試者 | N=90 | N=63 | |
| 中位隨訪時間(月) | 18.9 | 19.4 1 | 33.1 2 |
| ORR（%） | 58.9 | 46 | 58 |
| CR | 8.9 | 3.2 | 10 |
| PR | 50.0 | 42.9 | 48 |
| mDOR（月） | NE | NE | 27.6 |
| 12個月緩解率(%) | 87.6 | - | - |
| mTTR（月） | 5.5 | 4.5 | 5.6 |
奧布替尼為固體分散製劑，用以提高藥物溶解度和體內吸收。
將50mg奧布替尼片劑散裝藥物和200mg賦形劑羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯912G / AS-MG溶解在甲醇中，甲醇用作製備固體分散體的溶劑，之後在製備過程中去除。固體分散體通過噴霧乾燥得到，分散比為1：4。將固體分散體與200mg甘露醇200SD、10mg羥丙甲纖維素EXF、20mg交聯羧甲基纖維素鈉（幹法制粒）混合，通過幹法制粒工藝製備顆粒，與10mg交聯羧甲基纖維素鈉SD-711、6mg二氧化矽和4mg硬脂酸鎂混合，壓縮成12mm圓形片劑，最後裝瓶和作標記，最後獲得成品。
實施例 11 、 Tafasitamab 注射液的製備
CD19抗體Tafasitamab是一種白色至淡黃色凍幹粉末，以含200 mg Tafasitamab的一次性20 mL容量的玻璃小瓶提供。將其重懸於5 mL注射用水（WFI）中，產生約5.4 mL含有40 mg/mL Tafasitamab、25 mM檸檬酸鹽緩衝液、200 mM海藻糖和0.02%（w/v）聚山梨酯20（pH 6.0）的製劑。重懸後，將Tafasitamab轉移到含有0.9%氯化鈉注射液的250mL輸液袋中進行稀釋，然後靜脈滴注連續給藥2小時。
實施例 12 、 Tafasitamab 與來那度胺聯合奧布替尼治療復發 / 難治性 B 細胞非霍奇金氏淋巴瘤（ r/r B-NHL ）的臨床試驗方案
這項研究是一項開放標籤、單臂、多佇列研究，旨在評估Tafasitamab和來那度胺聯合奧布替尼治療復發/難治性非霍奇金氏淋巴瘤 （NHL）患者的安全性和有效性。研究方案總結參見圖10。Tafasitamab和來那度胺的劑量與獲批劑量相同，奧布替尼的劑量為150mg，每日一次（QD）。
本研究包括四組不同淋巴瘤組織病理學類型的復發/難治性B-NHL患者，如下所示：
佇列 A：彌漫性大 B 細胞淋巴瘤 （DLBCL）
佇列 B：套細胞淋巴瘤 （MCL）
佇列 C：濾泡性淋巴瘤 （FL）
佇列 D：邊緣區淋巴瘤 （MZL）。
每個佇列中招募10至20名患者。符合納入標準的受試者根據淋巴瘤的組織病理學類型進入相應的佇列。所有受試者接受12個週期的組合治療，然後用奧布替尼維持直至疾病進展。詳細的加藥策略如圖10所示。
主要研究終點是研究人員根據Lugano 2014標準評估的總緩解率（ORR），次要終點是緩解持續時間（DOR）、無進展生存期（PFS）、反應時間（TTR）、總生存期（OS）、安全性和PK等。使用Clopper-Pearson精確二項分佈方法，用達到完全緩解（CR）或部分緩解（PR）的應答者的數量和百分比（95%置信區間）定性描述療效結果。事件時間指標（如DOR、PFS、TTR和OS）使用 Kaplan-Meier （KM）方法進行統計描述。
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無
[圖1]表示了不同B淋巴瘤細胞系中CD19的表達水準
[圖2A]表示了奧布替尼或伊布替尼與Tafasitamab聯用時，基於報告基因的ADCC活性
[圖2B]表示了奧布替尼與Tafasitamab兩藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖2C]表示了伊布替尼與Tafasitamab兩藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖2D]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數曲線圖
[圖3A]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺時，基於報告基因的ADCC活性
[圖3B]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖3C]表示了伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖3D]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitama以及來那度胺三藥聯用時，基於報告基因的ADCC活性的協同分數曲線圖
[圖4A]表示了用免疫印跡方法評價Tafasitamab單藥或Tafasitamab與奧布替尼 / 伊布替尼聯用在各濃度對共培養條件下靶細胞TMD-8中BTK蛋白的磷酸化水準的影響和效應細胞Jurkat中ITK蛋白的磷酸化水平均的影響
[圖4B]表示了Tafasitamab單藥或Tafasitamab與奧布替尼 / 伊布替尼聯用在各濃度下對共培養條件下靶細胞TMD-8中磷酸化的BTK蛋白/BTK總蛋白比值變化的曲線圖
[圖4C]表示了Tafasitamab單藥或Tafasitamab與奧布替尼 / 伊布替尼聯用在各濃度下對共培養條件下效應細胞Jurkat中磷酸化的ITK蛋白/ITK總蛋白比值變化的曲線圖
[圖5A]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab時，原代NK細胞介導的ADCC活性(供體1)
[圖5B]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖(供體1)
[圖5C]表示了伊布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖(供體1)
[圖5D]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數曲線(供體1)
[圖5E]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab時，原代NK細胞介導的ADCC活性(供體2)
[圖5F]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖(供體2)
[圖5G]表示了伊布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖(供體2)
[圖5H]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab兩藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數曲線(供體2)
[圖6A]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺時，原代NK細胞介導的ADCC活性
[圖6B]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖6C]表示了伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數分佈圖
[圖6D]表示了奧布替尼或伊布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用時，原代NK細胞介導的ADCC活性的協同分數曲線圖
[圖7A]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺單藥、兩藥或三藥聯用促進對RS4;11細胞的直接腫瘤殺傷
[圖7B]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺單藥、兩藥或三藥聯用促進對TMD-8細胞的直接腫瘤殺傷
[圖8A]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用呈現對REC-1腫瘤細胞直接或免疫細胞依賴的腫瘤殺傷作用
[圖8B]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用對REC-1細胞腫瘤殺傷的協同分數分佈圖
[圖8C]表示了奧布替尼聯合Tafasitamab以及來那度胺三藥聯用對REC-1細胞腫瘤殺傷的協同分數曲線圖
[圖9A]表示了奧布替尼單藥、Tafasitamab與來那多胺兩藥聯用、以及奧布替尼、Tafasitamab與來那多胺三藥聯用在REC-1腫瘤細胞異植體模型的體內藥效
[圖9B]表示了奧布替尼單藥、Tafasitamab與來那多胺兩藥聯用、以及奧布替尼、Tafasitamab與來那多胺三藥聯用的REC-1荷瘤小鼠的相對體重變化
[圖9C]表示了奧布替尼單藥、Tafasitamab與來那多胺兩藥聯用、以及奧布替尼、Tafasitamab與來那多胺三藥聯用的REC-1荷瘤小鼠的存活曲線圖
[圖10]表示了Tafasitamab和來那多胺分別與奧布替尼聯用治療復發難治的B細胞霍奇金淋巴瘤的開放、多中心的臨床研究方案
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Claims (7)
- 一種用於CD19抗原陽性B細胞惡性腫瘤的治療方案，包括向有需要的患者施用奧布替尼和抗CD19特異性抗體或CD19抗原結合片段，其中抗CD19特異性抗體的VH包括CDR1 (SEQ ID NO：2)，CDR2（SEQ ID NO：3）和CDR3（SEQ ID NO：4）的氨基酸序列；抗CD19特異性抗體的VL包括CDR1 (SEQ ID NO：6，CDR2（SEQ ID NO：7）和CDR3（SEQ ID NO：8）的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的治療方案，其VH的序列為SEQ ID NO: 1的序列，VL的序列為SEQ ID NO: 5。
- 如請求項1所述的治療方案，其中抗CD19特異性抗體是Tafasitamab。
- 根據請求項1-3中任一項所述的治療方案，其中奧布替尼以每天50-150 mg的劑量口服給藥，Tafasitamab根據體重以每天12-24 mg/kg的劑量靜脈給藥。
- 根據請求項1-3中任一項所述的治療方案，進一步包括向患者注射來那度胺。
- 根據請求項5所述的治療方案，其中奧布替尼以每天50-150 mg的劑量口服給藥，Tafasitamab以每天12-24 mg/kg的劑量靜脈滴注給藥，來那度胺根據體重每天給藥5-25 mg。
- 根據請求項1-6中任一項所述的治療方案，其中B細胞惡性腫瘤包括非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病或急性淋巴細胞白血病。
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