CN106086214A - miR‑149‑5p作为临床诊断或抑制肝癌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及miR‑149‑5p作为临床诊断或抑制肝癌的应用。通过荧光定量PCR检测miR‑149‑5p在不同组织中的表达情况，将miR‑149‑5p作为肝癌早期诊断的分子标志物。以miR‑149‑5p的miRNA为目的基因，构建miR‑149‑5p的过表达载体，制备含有miR‑149‑5p表达载体的药物，通过离体施用或体内施用的途径给药。本发明发现miR‑149‑5p 在肝癌组织中的表达发生明显下调。miR‑149‑5p在肝癌的发生和发展过程中起着重要的调控作用，miR‑149‑5p能够显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，miR‑149‑5p可望用于制备防治肝癌的药物。

Description

miR-149-5p作为临床诊断或抑制肝癌的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及miR-149-5p作为临床诊断或抑制肝癌的应用。
背景技术
microRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码小RNA分子，长度约为18-25个核苷酸。miRNA广泛参与原核和真核生物体内基因表达的调控，对生物的发育、细胞的分化、增殖与凋亡，以及疾病的发生、发展和转归都起着重要作用。miRNAs被认为是一个主要的基因调节器。
功能性miRNA的产生主要分为以下几个连续的阶段，首先在核内转录生成长度约为80个核苷酸并带有茎环结构的初始miRNA（pri-miRNA），在由复合体的共同剪切作用下，pri-miRNA被处理成约为70个核苷酸长度的前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA被RAN-GTP和外转蛋白5共同运输至细胞质中，并被核酸酶Dicer切去茎环结构生成长度约为22个核苷酸的miRNA：miRNA双链。随后在miRNA诱导的沉默复合体的作用下，成熟的单链miRNA通过碱基反向互补靶向一个或多个基因mRNA的3’非编码区域（3’UTR），特异性地降解或沉默mRNA水平，抑制翻译的进行，从而达到对基因表达的调控作用。大量的证据表明，miRNA在肿瘤组织中会出现异常表达，在肿瘤的发生和发展过程中起着促进或抑制肿瘤发生的作用。
肝癌已成为世界上第五大肿瘤，在因肿瘤造成的死亡中占据第三位。原发性肝癌的发病原因和确切的分子机制尚不明确，目前多认为是环境和遗传等多重因素作用的结果。肝癌起病隐匿，恶性程度较高且进展迅速，病人出现症状时多已进展至中晚期，治疗难度极大且生存率低，因此筛查有效的生物标志物对于肝癌的早期诊断和预后具有重要意义。近年来的研究发现，miRNA能够从细胞周期、细胞凋亡、血管生成、化生、转移等各个阶段参与肝癌的发生和发展。如miR-21，miR-221/222，miR-155等在肝癌中表达上调，提示它们可能起着原癌基因的作用；而miR-122，miR-101，miR-200家族，let-7 miRNA家族等在肝癌中发生下调，提示它们可能起着抑癌基因的作用。因此寻找新的与肝癌发生相关的miRNA，研究其作用机制并将其用于肝癌的诊断和治疗将非常有意义。
近来，miR-149-5p被发现可以抑制多种肿瘤的发生，如神经胶质瘤，胃癌，结直肠癌，乳腺癌，小细胞肺癌，提示miR-149-5p是一个抑癌基因。miR-149-5p作为肝癌诊断标志物和miR-149-5p作为一种肝癌抑制基因的用途未见文献报道。
发明内容
为解决肝癌不能早期诊断，肝癌得不到有效抑制的的技术难题，本发明公开了miR-149-5p作为临床诊断或抑制肝癌的应用。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
miR-149-5p作为临床诊断肝癌的应用，通过荧光定量PCR检测miR-149-5p在不同组织中的表达情况，将miR-149-5p作为肝癌早期诊断的分子标志物。
miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，以miR-149-5p的miRNA为目的基因，构建miR-149-5p的过表达载体，制备含有miR-149-5p表达载体的药物，通过离体施用或体内施用的途径给药。
所述miRNA为miR-149-5p的初始miRNA、miR-149-5p的前体miRNA或成熟的miR-149-5p中的一种或多种。
所述成熟的miR-149-5p为如SEQ ID NO：1所示的RNA序列、添加化学基团修饰的RNA序列或如SEQ ID NO.2所示的DNA序列中的一种或多种。
所述过表达载体为病毒表达载体或真核表达载体。
所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体。
所述真核表达载体为pCMV-myc表达载体、pcDNA3.0、pcDNA3.1或在表达载体的基础上经改造的载体。
所述药物为颗粒剂、缓释剂、显微注射剂、转染剂型或表面活性剂。
所述药物离体施用（ex vivo途径）；将miR-149-5p或含如SEQ ID NO：2所示的DNA的载体在体外导入或转染入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。
所述药物体内施用（in vivo途径）；将miR-149-5p或含如SEQ ID NO：2所示的DNA的载体直接导入体内，所述载体为病毒型或非病毒型，也可为裸DNA或RNA。
本发明的有益效果在于：
第一：本发明通过可靠的miRNA 荧光定量PCR方法，筛选发现新的miRNA标志物miR-149-5p 在肝癌组织中的表达发生明显下调。与传统的蛋白标志物相比，该标志物的灵敏度高，特异性强，可作为肝癌早期诊断的临床诊断标志物。
第二：本发明通过大量的实验数据证明，miR-149-5p在肝癌的发生和发展过程中起着重要的调控作用，miR-149-5p能够显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，miR-149-5p可望用于制备防治肝癌的药物。
附图说明
图1为荧光定量PCR分析miR-149-5p在人类不同组织或器官，正常肝脏细胞和肝癌细胞中的表达差异分析；其中L-02细胞系为正常肝脏细胞，HepG2及CRL-8024是肝癌细胞系。
图2为荧光定量PCR分析miR-149-5p（图A）和PHLPP2（图B）在原发性肝癌中的表达；其中正常组织来源于肝癌患者的正常肝脏组织（n=5）；癌旁组织来源于肝癌患者的癌旁肝脏组织（n=5）；癌组织（n=5），U6 rRNA作为miR-149-5p的内参对照。β-actin作为PHLPP2的内参对照。
图3为图示不同软件预测的miR-149-5p与PHLPP2的靶向结合位点；其中TargetScan软件（图A），miRanda软件（图B）及Diana Tools软件（图C）在线分析显示的PHLPP2 mRNA的3’UTR区域与miR-149-5p种子区的结合位点。
图4为PHLPP2在miR-149-5p过表达的肝癌细胞中的双荧光素酶报告实验。
图5为荧光定量PCR分析，A：在肝癌细胞内转染成熟miR-149-5p模拟物（mimic）或miR-149-5p抑制剂（inhibitor）后，细胞内成熟miR-149-5p水平的变化；B：在肝癌细胞内转染成熟miR-149-5p模拟物或miR-149-5p抑制剂后，细胞内PHLPP2水平的变化。
图6为细胞增殖曲线分析转染miR-149-5p对肝癌细胞增殖的影响。
图7为划痕实验分析转染miR-149-5p对肝癌细胞迁移的影响；A：肝癌细胞转染成熟miR-149-5p模拟物 24，48小时后，肝癌细胞的迁移情况，B：肝癌细胞转染成熟miR-149-5p 模拟物24，48小时后，肝癌细胞的迁移能力示意图。
具体实施方式
本发明所述的“miR-149-5p”除非另有所指，当提及miR-149-5p时，其包括初始miR-149-5p（pri-miRNA）、miR-149-5p前体（pre-miRNA）和成熟miR-149-5p。
本发明所用的术语“加工”是指从DNA获得成熟miR-149-5p的整个生物过程，虽然加工过程的具体机制尚未完全清楚，但并不妨碍“加工”的实现。在真核细胞内，加工过程可自行完成并产生pri-miRNA、pre-miRNA和成熟miRNA。其中所述的DNA并不限于其具体来源，可以包括染色体DNA和载体DNA，但并不局限于上述2种。
以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下组织、细胞、试剂、仪器的类型及型号、或性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。
下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。
主要材料：
人肝癌细胞系HepG2 中国医学科学院基础医学研究所
人胚肾细胞系293T 中国医学科学院基础医学研究所
Tri reagent 江苏恩莫阿赛生物技术有限公司
无核酸酶水 美国ambion公司
miRNA及抑制剂 广州锐博生物科技有限公司
脂质体2000 美国Invitrogen公司
BioTeke miRNA cDNA第一链合成试剂盒 北京百泰克生物技术有限公司
限制性内切酶 日本TaKaRa公司
Dual-Luciferase Reporter Assay System 美国Promega公司
2×SYBR Green qPCR Mixture 美国ABI公司
引物 上海生工生物工程股份有限公司
注：除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通过市售获得。
一、 miR-149-5p的组织表达分析检测
1. 肝癌临床样品的采集
正常肝脏组织及原发性肝癌组织由河南大学附属淮河医院普外科提供。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，迅速切成小块于冻存管中置于液氮中保存备用。
2. RNA抽提
每100 mg组织加入1 mL Tri reagent，置于冰上充分匀浆破碎组织块，室温下静置5分钟后，加入1/10倍Tri reagen体积的的BCP溶液，涡旋混匀15秒后室温静置10分钟。4 ℃，13400g室温离心15分钟；将上清液转移至新的1.5 mL离心管，加入等倍上清体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次后，室温静置10分钟，4 ℃，13400g离心10分钟后，吸除上清，加入500 μL的75%乙醇溶液（无RNA酶水新鲜配制），轻吹悬浮清洗RNA，4 ℃，13400g离心5分钟沉淀RNA。吸除上清后，置于室温通风处晾干，干燥5分钟左右。加入适量无核酸酶水并置于55 ℃水浴10分钟，待充分溶解后测定OD260和OD280吸收值。一般认为A260/A280在1.8-2.1之间可以初步判定总RNA质量较好。
3. 荧光定量PCR检测miR-149-5p水平
取2 μg RNA作为模板，使用针对miRNA的miRNA cDNA第一链合成试剂盒（BioTeke）
对miRNA进行加Poly (A) 尾并反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用针对miR-149-5p的引物及PCR 2×SYBR Green qPCR Mixture，在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR条件为：50 °C 20秒；95 °C 10分钟；95 °C 1分钟；60 °C 1分钟，重复40个循环；测得样本miR-149-5p扩增的CT值，以内参基因U6的CT值进行标准化校正；同时扩增靶基因PHLPP2，以beta-actin为内参基因进行校正。所得CT值使用2-Δ∆CT法进行计算，比较不同样本间miR-149-5p含量的差异。
结果：如图1所示与正常肝脏组织相比，miR-149-5p在原发性肝癌组织中的表达明显降低，下降约50%（P=0.01）。表明miR-149-5p的异常降低与肝癌的发生密切相关。
二、miR-149-5p靶基因的预测
由于miR-149-5p在肝癌组织中的表达发生明显降低，因此可以推测miR-149-5p在正常肝脏组织中发挥抑癌基因的功能。利用生物信息学软件可以预测miR-149-5p潜在的靶基因。为提高预测的准确性，利用三种常用的miRNA在线预测软件，miRanda，Diana Tools和TargetScan，寻找与肝癌相关的miR-149-5p靶基因。
结果：如图3所示，设定被两种以上的分析软件同时预测成功定义为阳性靶基因。最终确定PHLPP2 mRNA的3’UTR区域与miR-149-5p的种子区具有潜在的结合位点。
三、miR-149-5p可有效识别靶基因PHLPP2并影响其表达
1. 细胞培养
人肝癌细胞系HepG2在DMEM培养基（Thermo, USA）中进行培养。培养基中含有10%胎牛血清（Gibco, USA）、青霉素（100 U/mL）和链霉素。所有细胞置于37 °C培养箱、5% CO2条件下培养。
2. 细胞转染
miRNA购自广州锐博公司，HepG2细胞铺板约20小时后至60%左右密度后开始转染，转染设置成熟miR-149-5p组、成熟miRNA通用阴性对照组、miR-149-5p抑制剂组、miRNA抑制剂通用阴性对照组。所用转染试剂为脂质体2000（Invitrogen），转染方法参照说明书进行。
3. miR-149-5p水平及靶基因水平的检测
转染后继续培养48 小时，收集细胞。按照实施例1中的方法，抽取细胞的总RNA，反转录后利用荧光定量PCR的方法，检测转染后HepG2细胞内成熟miR-149-5p水平的变化，同时检测靶基因PHLPP2水平的变化情况。所用PHLPP2正向引物如SEQ ID NO：3所述；PHLPP2反向引物如SEQ ID NO：4所述。内参对照β-actin正向引物如SEQ ID NO：5所述；内参对照β-actin反向引物如SEQ ID NO：6所述。
结果：如图2所示正常组织来源于肝癌患者的正常肝脏组织（n=5）；癌旁组织来源于肝癌患者的癌旁肝脏组织（n=5）；癌组织（n=5）。U6 rRNA作为miR-149-5p的内参对照。β-actin作为PHLPP2的内参对照。荧光定量PCR分析显示，转染200 pmol成熟miR-149-5p可显著提高HepG2细胞内miR-149-5p的表达水平（P=0.01），并可明显抑制内源性PHLPP2基因的转录水平（P=0.048）；由于miRNA抑制剂只是通过反向互补竞争性结合内源性miRNA，并不改变其体内表达水平，因此转染400 pmol的miR-149-5p抑制剂后，HepG2细胞内并未检测到miR-149-5p表达水平的变化（P=0.78），但内源性PHLPP2的mRNA水平发生明显上调（P=0.047）如图5所示。这一实验证明通过外源性方法提高或降低体内成熟miR-149-5p的水平是切实可行的，并可以有效改变其靶基因PHLPP2 mRNA的表达水平。
四、荧光素酶报告实验证明miR-149-5p对靶基因PHLPP2的直接调节作用
人源PHLPP2基因的3’UTR区域用下列引物进行PCR扩增：
PHLPP2-3’UTR-F如SEQ ID NO：7所述；PHLPP2-3’UTR-R如SEQ ID NO：8所述。PCR扩增产物克隆到pmirGLO载体（Promega）荧光素酶基因的下游，构建野生型重组载体PHLPP2-WT-pmirGLO；同时以该载体为模板，使用定点突变试剂盒（QuikChange II XL Site-DirectedMutagenesis Kit, Agilent Technologies），突变PHLPP2基因3’UTR区域与miR-149-5p种子区结合的序列，构建突变型重组载体PHLPP2-mut-pmirGLO。突变引物为：mut-PHLPP2-3’UTR正向引物：如SEQ ID NO：9所述；mut-PHLPP2-3’UTR反向引物：如SEQ ID NO：10所述。
上述两种质粒载体分别与成熟miR-149-5p和成熟miRNA通用阴性对照共转染293T细胞，所用转染试剂为Lipofectamine 2000（Invitrogen），48小时后按照双荧光素酶报告基因检测***（Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega）提供的方法处理细胞，在多功能酶标仪上检测荧光值，所有转染组均含有三个复孔，实验结果为三次独立重复实验所得。
结果：如图4所示，与阴性对照共转染组相比，miR-149-5p能够使PHLPP2-WT-pmirGLO的荧光素酶活性下降35%左右（P=0.03），但对PHLPP2的3’UTR区域进行点突变后，荧光素酶活性恢复正常，P＜0.01。这一结果表明，在肝癌细胞内miR-149-5p通过直接结合PHLPP2 mRNA 3’UTR区域上的序列干扰其翻译过程，并可能由此影响肝癌细胞的增殖和迁移如图6所示。
五、 miR-149-5p可以抑制肝癌细胞HepG2的增殖
采用直接计数法检测细胞的增殖情况。将5 × 104 个HepG2细胞铺于6孔培养皿中，按照实施例3中的方法，转染成熟miR-149-5p（200pmol）及成熟miRNA通用阴性对照（200pmol）。 于转染后一天消化细胞，使用0.05%的台盼蓝溶液染色对每孔活细胞进行计数，连续计数6天。每个转染组设置三个重复孔。
结果：如图7所示与对照组相比，转染成熟miR-149-5p一天后，肝癌细胞的生长速度即发生明显降低（P=0.01），且随着时间的延长，对肝癌细胞增殖的抑制效应愈加明显。表明过表达miR-149-5p可以有效抑制肝癌细胞的增殖。
六、 miR-149-5p可以抑制肝癌细胞HepG2的迁移能力
将HepG2细胞铺于6孔培养皿中，转染前细胞生长至60%左右密度为宜，按照实施例3中的方法，转染成熟miR-149-5p及成熟miRNA通用阴性对照。转染24小时后用200 μL无菌移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，PBS清洗三次去除划下的细胞，加入不含血清的培养基继续培养细胞。按0，24，48小时在倒置显微镜下拍照。用Image Pro Plus 6.0软件测量划痕的面积和宽度。细胞的愈合率：(宽度1-宽度2)/ 宽度1，宽度1和宽度2分别为划痕在0小时和24/48小时的宽度，划痕宽度是划痕面积与长度的比值。
结果：与对照组相比，转染miR-149-5p 24小时后，肝癌细胞的迁移能力并未发生明显变化（P=0.23），但转染48小时后肝癌细胞的迁移能力明显降低（P=0.04），表明miR-149-5p能够显著抑制肝癌细胞的迁移能力。
统计学分析：所有数据取三次独立重复实验的平均值，标准差（SD）利用GraphPadPrism 5中的方法进行数据分析。P < 0.05认为具有统计学意义。
本发明请求保护的范围并不局限于具体实施方式的描述。

Claims (8)

1.miR-149-5p作为临床诊断肝癌的应用，其特征在于：通过荧光定量PCR检测miR-149-5p在不同组织中的表达情况，将miR-149-5p作为肝癌早期诊断的分子标志物。
2.miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：以miR-149-5p的miRNA为目的基因，构建miR-149-5p的过表达载体，制备含有miR-149-5p表达载体的药物，通过离体施用或体内施用的途径给药。
3.如权利要求2所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述miRNA为miR-149-5p的初始miRNA、miR-149-5p的前体miRNA或成熟的miR-149-5p中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述成熟的miR-149-5p为如SEQ ID NO：1所示的RNA序列、添加化学基团修饰的RNA序列或如SEQ ID NO.2所示的DNA序列中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述过表达载体为病毒表达载体或真核表达载体。
6.如权利要求2或5所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体。
7.如权利要求2或5所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述真核表达载体为pCMV-myc表达载体、pcDNA3.0、pcDNA3.1或在表达载体的基础上经改造的载体。
8.如权利要求2所述的miR-149-5p作为抑制肝癌的应用，其特征在于：所述药物为颗粒剂、缓释剂、显微注射剂、转染剂或表面活性剂。
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曹亚玲等: "miR-149-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义", 《第三军医大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604569A (zh) * 2021-08-04 2021-11-05 广州医科大学 miR-6883-3p在制备用于抗肝癌或肝癌预后评估产品中的应用
CN113604569B (zh) * 2021-08-04 2023-11-17 广州医科大学 miR-6883-3p在制备用于抗肝癌或肝癌预后评估产品中的应用

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