CN110960546B - MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用，属于肿瘤治疗技术领域，所述MicroRNAs包括miR‑15a和/或miR‑20b。在本发明中，所述miR‑15a和/或miR‑20b的表达通过抑制索拉非尼诱导肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡，来增强索拉非尼治疗肝癌的作用。本发明中的miR‑15a、miR‑20b参与肝癌细胞索拉非尼耐药的作用，为肝癌的治疗及逆转索拉非尼耐药提供新的潜在药靶。因此本发明具有较强的理论和现实意义。

Description

MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用。

背景技术

肝癌(肝细胞癌)是我国常见的恶性肿瘤，据国家癌症中心2019年1月发布的癌症统计报告显示其发病率居第四位，死亡率居第二位。在世界范围内肝癌也是死亡率最高的5种癌症之一，严重威胁人类健康和生命。肝癌起病隐匿，早期症状不明显，确诊时往往已到中晚期。手术，肝移植和局部消融是针对早期患者的主要治疗方法，然而超过70％的手术和局部消融患者在5年内复发。同样，术后复发也是肝癌肝移植面临的主要问题。为此，***化疗和靶向治疗成为中晚期肝癌患者的主要治疗手段。然而由于肝癌细胞具有很强的耐药性，现有肝癌治疗药物的效果都很不理想。因此，研究和探索肝癌细胞的耐药机制，发掘耐药分子靶点和标记物，对肝癌新药研发和用药指导具有重要意义。

传统化疗药物在肝癌的治疗上收效甚微，而索拉非尼的问世，使肝癌的治疗获得了巨大突破。索拉非尼(Sorafenib)是一种小分子多靶点口服抗癌药，在2007年被美国FDA批准用于治疗不可切除的肝细胞癌。2008年被正式批准进入我国市场，成为第一个用于治疗晚期肝癌的一线用药及手术和肝移植后的辅助用药。在机理上，索拉非尼不仅能抑制VEGFR、PDGFR、FLT3和KIT受体酪氨酸激酶的活性，还能强效抑制RAF激酶。因此，索拉非尼既能抑制血管新生又能直接抑制肿瘤细胞增殖。SHARP、Oriental等临床研究显示，索拉非尼治疗晚期肝癌相比安慰剂可显著延长患者生存期(SHARP研究：10.7个月对7.9个月，P＝0.00058；Oriental研究：6.5个月对4.2个月，P＝0.014)。这些关键性研究，奠定了索拉非尼治疗晚期肝癌的一线地位，使其成为进展期肝癌的标准一线疗法，并被多部国内外指南推荐为肝癌治疗标准。我国2011版《原发性肝癌诊疗规范》也推荐索拉非尼为全身治疗首选方案。

在过去的十年间，索拉非尼成为肝癌患者错失传统治疗手段时，或者传统治疗疗效不佳时可供选择的唯一一线药物。尽管二线靶标药物瑞戈非尼(regorafenib)以及二线免疫药物PD-1抑制剂近两年疗效引人注意，然而，前期临床数据表明，对索拉非尼治疗失败后的患者进行二线药物临床试验多以失败告终。但是由于原发性及获得性耐药的原因，索拉非尼的疗效始终不尽如人意。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用，MicroRNAs中的miR-15a和/或miR-20b的表达增强了索拉非尼治疗肝癌的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用；

所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。

本发明还提供了MicroRNAs在制备促进索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的药物中的应用；

所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。

本发明还提供了MicroRNAs在制备抑制索拉非尼诱导肝癌细胞增殖的药物中的应用；

所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。

优选的，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂和乳剂中的一种或几种。

本发明提供了MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用，所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b，所述miR-15a和/或miR-20b的表达通过抑制索拉非尼诱导肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡，来增强索拉非尼治疗肝癌的作用。

附图说明

图1-1为显示了Cas9文库筛选索拉非尼耐药(增敏)基因流程示意图；

图1-2为显示了miR-15a和miR-20b的茎环序列示意图；

图2-1为显示了肝癌细胞株MHCC-LM3分别转染miR-15a和20b mimics后转录水平的过表达情况；

图2-2为显示了miR-15a和20b过表达增加了索拉非尼处理引起的细胞死亡率；

图2-3为显示了转染了miR-15a和miR-20b的Focus肝癌细胞对索拉非尼作用敏感性增加；

图2-4为显示了图2-3实验中凋亡细胞百分比统计图；

图2-5为显示了转染了miR-15a和miR-20b的Huh7肝癌细胞对索拉非尼作用敏感性增加；

图2-6为显示了图2-5实验中凋亡细胞百分比统计图；

图3-1为显示了CCK8实验miR-15和miR-20b对肝癌细胞MHCC-LM3在索拉非尼处理下存活能力的影响；

图3-2为显示了CCK8实验miR-15和miR-20b对肝癌细胞Focus在索拉非尼处理下存活能力的影响；

图3-3为显示了转染了miR-15a和miR-20b的肝癌细胞MHCC-LM3及对照细胞在索拉非尼作用下形成平板克隆能力的影响；

图3-4为显示了图3-3中MHCC-LM3细胞形成的细胞团数目统计图；

图4为显示了动物实验中miR-15a和miR-20b对索拉非尼治疗移植瘤的疗效的影响，其中，A和B分别显示了miR-15a和20b的过表达减弱了索拉非尼处理下MHCC-LM3细胞在裸鼠皮下形成肿瘤的能力。

具体实施方式

本发明提供了MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用；所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。在本发明中，当所述增强剂中包括miR-15a和miR-20b时，两种以任意质量比混合。本发明对所述增强剂的剂型没有特殊限定，采用医学上可接受的剂型即可。本发明对所述增强剂中miR-15a和/或miR-20b的含量以及采用的辅料及辅料含量没有特殊限定，采用常规制备各种剂型使用的辅料种类和辅料用量即可，采用各种剂型中常规含有活性物质的含量即可。本发明对所述增强剂的制备方法没有特殊限定，采用常规剂型的常规制备方法即可。

本发明提供了MicroRNAs在制备促进索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的药物中的应用；所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。在本发明中，当所述药物中包括miR-15a和miR-20b时，两种基因以任意质量比混合。在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂和乳剂中的一种或几种。本发明对所述药物中miR-15a和/或miR-20b的含量以及采用的辅料及辅料含量没有特殊限定，采用常规制备各种剂型使用的辅料种类和辅料用量即可，采用各种剂型中常规含有活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规剂型的常规制备方法即可。

本发明提供了MicroRNAs在制备抑制索拉非尼诱导肝癌细胞增殖的药物中的应用；所述MicroRNAs包括miR-15a和/或miR-20b。在本发明中，当所述药物中包括miR-15a和miR-20b时，两种基因以任意质量比混合。在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂和乳剂中的一种或几种。本发明对所述药物中miR-15a和/或miR-20b的含量以及采用的辅料及辅料含量没有特殊限定，采用常规制备各种剂型使用的辅料种类和辅料用量即可，采用各种剂型中常规含有活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规剂型的常规制备方法即可。

实施例1～4中用到的试验操作如下：

(1)细胞系和试剂

MHCC-LM3、Huh7和FOCUS肝癌细胞来自中国科学院上海细胞库。采用含10％胎牛血清的DMEM培养基,置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养肝癌细胞。0.25％的胰蛋白酶(含EDTA)用于消化细胞。

索拉非尼(Sorafenib；Cell Signaling Technology)被制备为DMSO溶解的10mM储备溶液。出于实验目的，在添加至细胞培养物之前将药物稀释在新鲜培养基中。在检测miR-15a-5p和miR-20b-5p在肝癌细胞对索拉非尼敏感性上所起作用的实验中，对照组用DMSO代替索拉非尼进行处理。将对应于人miR-15a-5p和miR-20b-5p合成的mimics(GenePharma；Shanghai，China)和阴性对照miR-NC(GenePharma)制备为不含RNA酶的水中的20μM储备溶液。

(2)慢病毒包装及肝癌过表达稳定株的构建

1)将293T细胞培养于含有10％FBS、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中常规培养。

2)待其生长到80％左右密度时，将空质粒CMV-PGK-Puro、重组质粒CMV-hsa-miR-15a-PGK-Puro、CMV-hsa-miR-20b-PGK-Puro(Genomeditech；Shanghai，China)和包装质粒psPAX2、pMD2.G按比例加入装有1.5mL无血清培养基的离心管中，混匀。另将转染试剂

3000加入装有1.5mL无血清的培养基中，将两管试剂混匀，室温放置5min后，加入细胞培养液中，于细胞培养箱中培养4-6h。

3)除去转染液，加入含血清DMEM培养基，继续培养72h。吸取细胞上清液到离心管中，低速离心，0.45μm过滤，在4℃20000r/min条件下超速离心2h，收集浓缩液。

4)构建过表达稳定株

加入病毒液感染细胞，加入终浓度为4μg/ml polybrene。24h后吸出含病毒的培养基，加入完全培养基，培养箱中培养48h后，换上终浓度为1μg/ml的Puromycin的培养基，筛选稳定转导的细胞株(两至三天换一次液)。

(3)目标miRNA mimics转染肝癌细胞

1)接种细胞至70-90％汇合度时转染。

2)使用Opti-MEM培养基稀释

3000试剂(2管)，充分混匀。

3)使用Opti-MEM培养基稀释miRNA mimics，并在每管已稀释的

3000试剂中加入稀释的miRNA mimics(1:1比例)。

4)室温孵育5分钟，滴加入细胞中。

5)37℃孵育细胞2-4天，然后分析转染细胞。

(4)细胞生长曲线的测定

1)将不同种类的肝癌细胞根据其生长特性按3-5×10³/100μl/孔计算细胞总量，充分消化细胞后，稀释到所需浓度，接种于96孔板内。每天每组三复孔，按5-7天接种细胞。

2)待细胞基本贴壁后加入索拉非尼观察细胞状态和数目。用CCK-8显色剂(CellCounting Kit-8，DOJINDO，Japan)进行显色反应，每100μl培养液加10μl CCK-8，37℃，5％CO₂培养箱放置孵育1h 15min，酶标仪测定450nm处的吸光度，记录细胞实际的起始密度。

3)显微镜下观察细胞形态，固定时间间隔测量，记录细胞生长状况。

4)一般测5至7天。待测定结束后，收集数据进行处理，绘出图表。

(5)细胞克隆形成实验

1)将miR-NC和miR-15a、miR-20b过表达肝癌稳定株MHCC-LM3，按一定数目接种于6孔板，培养24h待其贴壁后，加入适当浓度的索拉非尼，以检测索拉非尼对这些稳定细胞株长期处理的影响。

2)培养2-3周，其间每隔3-5天更换新鲜培养液并加索拉非尼处理，直至有肉眼可见的细胞克隆形成。

3)吸去培养皿内的培养基，将6孔板置于冰上并用预冷的PBS(4℃)漂洗2次。

用预冷的100％甲醇(4℃)固定10min。

4)将细胞从冰上取出，室温平衡，然后用结晶紫染色液覆盖细胞染色。室温下孵育10min，弃去结晶紫染色，用蒸馏水洗涤细胞数次，直至染液不再流出。

5)克隆形成染色结果拍照，按照相同的标准(细胞克隆大小)对每个培养皿上的细胞克隆进行计数。

(6)裸鼠成瘤实验

1)所用小鼠为5-6周大小的雄性BLAB/c裸鼠，购买自上海斯莱克实验动物有限公司。

2)取miR-NC和miR-15a、miR-20b过表达肝癌稳定株MHCC-LM3细胞，以1×10⁶个相同数量注射入裸鼠腹部皮下。

3)随机将小鼠分为两组：实验组使小鼠连续索拉非尼灌胃，对照组连续DMSO灌胃。

4)观察瘤体的生长情况，在约4-8周待最大瘤体直径达15mm时牺牲小鼠，瘤体拍照并称重。

(7)流式Annexin V-FITC/PI双染法

1)将Binding Buffer(10×)稀释成1×Bindingbuffer工作液备用(1ml BindingBuffer(10×)需加入9ml无菌去离子水)。

2)对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500-1000g离心5min收集细胞。

3)收集细胞后，加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。

4)在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶cell/ml。

5)吸取100μl细胞悬液(细胞总数为1×10⁵cell)至一新管中，加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。

6)流式细胞仪检测：

染色孵育后，每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。

设置经凋亡诱导的正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用FlowJo等软件进行分析，绘制散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

(8)台盼蓝染色法

1)配制4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时用PBS稀释至0.4％。

2)胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。

3)染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀。(终浓度0.04％)

4)计数：在3分钟内，分别计数活细胞和死细胞。

5)镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

6)统计细胞死亡率：死亡率(％)＝死细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。

(9)细胞RNA抽提

采用TRIzol Reagent(Invitrogen)试剂抽提RNA，具体操作如下：

1)细胞株RNA抽提，取对数生长期的细胞，吸取培养液，根据培养皿的面积加入相应量的TRIzol试剂(1ml TRIzol/10cm²)裂解细胞，吹打几次，将裂解下来的细胞收集至无RNA酶的EP管中室温放置5分钟。

2)按比例向离心管中加入氯仿(200μl/1ml TRIzol)，迅速剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟，4℃，12000×g条件下离心15分钟。

3)将上层水相尽可能地转移至新的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀5次，室温静置10分钟，4℃，12000×g条件下离心10分钟，此时可见RNA沉淀。

4)将上清倒掉，加入75％乙醇(1ml/1ml TRIzol)，混匀，洗涤RNA，离心4℃，7500×g条件下离心5分钟。

5)弃上清，尽可能除尽残留乙醇，沉淀自然干燥5-10min(注意切勿完全干燥)；加入30-50μl DEPC H₂O，吹吸几次，溶解RNA沉淀。

6)酶标仪测定RNA浓度及纯度OD 260/280(1.8-2.0)；凝胶电泳观察有无降解，-80℃保存。

(10)RNA的逆转录

用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)逆转录。

所用引物信息如下：

(SEQ ID No.1)R:gtgcagggtccgaggt；

(SEQ ID No.2)miR-15a-F:gagtagcagcacataatgg；

(SEQ ID No.3)miR-15a-RT:

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacaaac；

(SEQ ID No.4)miR-20b-F:gagcaaagtgctcatagtg；

(SEQ ID No.5)miR-20b-RT；

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctacct；

(SEQ ID No.6)U6-F：ctcgcttcggcagcaca；

(SEQ ID No.7)U6-RT：aacgcttcacgaatttgcgt。

具体操作如下：

1)在无核酸酶的EP管中加入以下组分：

置于PCR仪中，70℃，5分钟，然后立即在冰上冷却5min。

2)在上述体系中再加入以下组分：

轻轻混匀后，置于PCR仪中，37℃，60min。

逆转得到的cDNA置于4℃保存。

(11)实时定量PCR

实时定量PCR反应使用

Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd.Dalian,China)的反应体系，利用Thermal CyclerDice^TM Real Time System(TP800实时荧光定量PCR仪，TaKaRa)进行操作。定量PCR的扩增产物长度以80bp–150bp最为合适(可以延长至300bp)。

反应体系如下：

反应条件：

溶解曲线分析步骤：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

95℃ 15sec

解离时间为4sec。

荧光本底信号和阈值采用仪器设置的默认值，每次PCR反应结束后会自动生成，Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定阈值(基线荧光强度的10倍)时所经历的循环数；每个模板做3个复管，得到的Ct值取平均值；平均值减去相应模板的内参基因(U6)的Ct平均值，得到ΔCt。采用2-△△Ct方法计算miR-15a-5p和miR-20b-5p表达量。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CRISPR/Cas9敲除文库筛选参与肝癌索拉非尼耐药的基因

利用CRISPR/Cas9组学慢病毒文库感染MHCC-LM3肝癌细胞，通过Puromycin筛选，细胞培养7-10代，待细胞遗传背景稳定后加入索拉非尼处理细胞，经过两轮处理，抽提加索拉非尼前后该肝癌细胞的基因组DNA(前后样品均有3个重复)，经PCR/RNA-seq检测sgRNA的富集情况，筛选流程示意图如图1-1。

最终经深度测序分析，找到了两个sgRNA含量变化差异较大的候选靶点microRNAs，即miR-15a和miR-20b(图1-2)。与加药前相比，耐药细胞中miR-15a的sgRNA含量上升了38倍，miR-20b的sgRNA含量上升了59倍，因为sgRNA和其靶向基因是负调控关系，所以sgRNA含量上升则miR-15a和miR-20b表达是下降的。筛库结果表明miR-15a和20b的缺失促进肝癌细胞对索拉非尼的抵抗。反之，miR-15a和20b的表达则增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。

实施例2

外源表达miR-15a和miR-20b促进索拉非尼诱导的肝癌细胞凋亡

化学合成miR-15a和miR-20b的mimics，转染肝癌细胞Huh7，Focus和MHCC-LM3。(1)分别提取转染miR-15a和miR-20b mimics后的MHCC-LM3细胞的RNA，并逆转成cDNA后，利用qPCR技术检测miR-15a和miR-20b转录水平的表达情况，结果显示二者显著提高(图2-2)。(2)经mimics转染的肝癌细胞MHCC-LM3和Huh7培养48h后，分为两组，即：DMSO对照组和索拉非尼处理组，药物处理48小时后，胰酶消化细胞，配制终浓度为0.04％的台盼蓝用于死细胞染色，统计细胞死亡率：死亡率(％)＝死细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％，发现索拉非尼处理组中miR-15a和miR-20b过表达的细胞死亡率显著增加(图2-2)。(3)此外，转染后的肝癌细胞，以70％密度接种于六孔板中，分成两组(DMSO对照组和索拉非尼处理组)，48h后使用AnnexinV/PI双染法利用流式细胞仪检测索拉非尼诱导的细胞凋亡情况，发现miR-15a和miR-20b过表达的细胞凋亡显著增加(图2-3至图2-6)。

实施例3

外源表达miR-15a和miR-20b抑制索拉非尼诱导的肝癌细胞增殖

为了进一步探究miR-15a和miR-20b在索拉非尼诱导的肝癌细胞中所起到的作用，利用生长曲线和克隆形成实验检测了短期和长期索拉非尼处理肝癌细胞情况下，miR-15a和miR-20b所起到的作用。

将分别转染了miR-15a和20b的mimics的肝癌细胞MHCC-LM3和Focus，取对数生长期细胞，以每孔5*10³个细胞接种于96孔板中，待其完全贴壁后，加入索拉非尼处理为实验组，DMSO处理为对照组，利用CCK8试剂盒检测了5天的细胞生长情况，实验结果表明miR-15a和miR-20b的过量表达抑制了索拉非尼诱导的肝癌细胞增殖能力(图3-1和图3-2)，说明分别加入两条microRNA的模拟物和索拉非尼共同作用于肝癌细胞，能够提升索拉非尼的疗效。

此外，构建表达pri-miR-15a和pri-miR-20b的过表达慢病毒，感染肝癌细胞后经加入puromycin筛选获得稳定细胞株；分成两组，索拉非尼处理组和DMSO对照组，以2*10³个/孔的对数生长期细胞接种于六孔板中，进行平板克隆形成实验，检测索拉非尼对这些稳定细胞株长期处理的影响(图3-3和图3-4)。

利用上述检测细胞凋亡和存活的方法检测发现miR-15a和miR-20b的表达增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。

实施例4

miR-15a和miR-20b在体内增强肝癌细胞对索拉非尼敏感性

体外实验已经明确表明miR-15a和20b增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，接下来利用荷瘤裸鼠模型来研究miR-15a和miR-20b的表达对索拉非尼处理下肝癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。将1×10⁶个分别过表达的miR-15a或miR-20b的MHCC-LM3细胞(慢病毒感染形成稳定细胞株)和对照细胞注射入裸鼠腹部皮下，随机将小鼠分为两组：实验组使小鼠连续索拉非尼灌胃，对照组连续DMSO灌胃。观察瘤体的生长情况，在约4-8周待最大瘤体直径达15mm时牺牲小鼠，瘤体拍照并称重。结果表明miR-15a和miR-20b的过表达有效抑制索拉非尼处理下的肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力(图4中的A和B)，即miR-15a和miR-20b增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。

索拉非尼的耐药问题是制约肝癌患者预后及获益的重要因素。本发明通过CRISPR/Cas9组学筛选，鉴定出miR-15a和miR-20b作为增强索拉非尼敏感性的候选靶点，并通过设计一系列细胞和动物实验阐明miR-15a、miR-20b参与肝癌细胞索拉非尼耐药的作用，为肝癌的治疗及逆转索拉非尼耐药提供新的潜在药靶。因此该研究具有较强的理论和现实意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市东方医院

<120> MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtagcagc acataatgg 19

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaaac 50

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcaaagtg ctcatagtg 19

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (3)

1.MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用；

所述MicroRNAs为miR-15a和/或miR-20b；

所述miR-15a的前体核苷酸序列为：

ccuuggaguaaaguaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg；

所述miR-20b的前体核苷酸序列为：

aguaccaaagugcucauagugcagguaguuuuggcaugacucuacuguaguaugggcacuuccaguacucaaagugcucauagugcagguag。

2.MicroRNAs在制备促进索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的药物中的应用；

所述MicroRNAs为miR-15a和/或miR-20b；

所述miR-15a的前体核苷酸序列为：

ccuuggaguaaaguaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg；

所述miR-20b的前体核苷酸序列为：

aguaccaaagugcucauagugcagguaguuuuggcaugacucuacuguaguaugggcacuuccaguacucaaagugcucauagugcagguag。

3.MicroRNAs在制备提高索拉非尼抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用；

所述MicroRNAs为miR-15a和/或miR-20b；

所述miR-15a的前体核苷酸序列为：

ccuuggaguaaaguaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg；

所述miR-20b的前体核苷酸序列为：

aguaccaaagugcucauagugcagguaguuuuggcaugacucuacuguaguaugggcacuuccaguacucaaagugcucauagugcagguag。

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