CN106086192A - 他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多重PCR‑荧光标记探针对他克莫司个性化用药相关基因的分型检测方法，根据CYP3A4和CYP3A5编码基因上与他克莫司代谢相关性较高的三个特异SNP位点，设计三对扩增引物和三个荧光探针，采用PCR仪扩增中待测三段DNA序列，利用荧光探针与扩增产物的杂交，检测反应体系中的杂交峰，以基于野生型和突变型标准质粒的构建及检测确定用以基因分型的标准杂交峰所显示的Tm值为结果判断标准。本发明的方法灵敏度高、特异性强、操作简便，结果观察直观明了，两种基因型差异显著，易于分型。适用于对他克莫司药物代谢相关基因三个SNP位点的一管三重的快速检测。

Description

他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种多重PCR-荧光探针对他克莫司个性化用药相关基因的分型检测方法。具体地说，是一种通过标准品比对实现靶基因分型的多重荧光PCR技术对他克莫司个性化用药相关基因检测分型方面的应用。
背景技术
他克莫司(FK506)是一种免疫抑制剂，广泛用于器官移植排斥反应的预防。目前临床上采用的是“标准”的给药方法，常规使用剂量为0.1～0.12mg/kg，但是FK506的治疗指数较窄，不同个体间药动学差异大，使得标准剂量给药方式达不到预期的治疗效果，甚至导致急性排斥反应和毒副作用的发生，加之FK506是肾移植后患者需要终生服用的免疫抑制剂，且价格较贵，因此FK506有必要进行个体化给药。细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一组含有亚铁血红素蛋白酶系。它主要存在于人类肝脏，对外源物处置以及内源物代谢起重要作用。CYP3A是CYP450超家族中表达最为丰富的酶，参与40％～60％临床常用药物的代谢。FK506是CYP3A酶的底物，CYP3A酶参与FK506D的代谢，酶的表达水平及生物活性差异可能会导致FK506的个体间差异。而CYP3A基因多态性会影响CYP3A酶的生物活性，所以CYP3A基因多态性是造成FK506个体间差异的重要原因。基因多态性对FK506药物浓度的影响导致其治疗窗狭窄，个体药物代谢差异很大，临床上必须严密监测血药浓度以保证其达到安全、有效的治疗浓度，这是FK506临床应用的一个难点。但也正因如此，FK506代谢相关的研究一直备受关注，各领域研究人员采用不同技术手段,进行更为精确细致的基因多态性分析，通过检测基因型，确定免疫抑制剂的初始剂量，在临床上为患者制定出最佳治疗方案，以期提高疗效，减少不良反应的发生，将现阶段用于所有患者的标准治疗方案转变为更有效的针对单个患者的个体化精准用药。
以往常用的检测类似SNP的方法主要有限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，单链构象多态性法(PCR-SSCP)，变性梯度凝胶电泳法(denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)，等位基因特异性PCR(allele specific PCR,ASPCR)等以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，以及另一类以DNA测序、DNA芯片检测、飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测，变性高效液相色谱(DHPLC)法和探针法为代表的以高通量或荧光标记为主要技术特点的新检测方法。其中前一类的检测方法均需要进行PCR反应后处理操作，普遍存在步骤多，周期长的缺陷，而第二类检测方法中以高通量为特点的检测方法虽然可轻松实现大样本的短时间检测，且灵敏度及自动化程度高，但高昂的成本成为其难以推广应用的技术短板。而以荧光标记为技术特点的检测方法，包括荧光染料检测、Taqman探针，荧光双链置换探针、荧光共振能量转移探针(FRET探针)、分子信标探针检测等方法，以其较高的检测特异性及敏感性，闭管低污染的检测过程以及低廉的检测成本为优势在中通量的检测中得到广泛的应用。
其中，分子信标是一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光。分子信标具有背景信号低、灵敏度高、识别特异性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点，在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。当无靶序列存在时，分子信标呈颈环结构，颈部的荧光基团与淬灭基团在空间上非常接近，此时发出的荧光被淬灭基团几乎完全吸收并以热能的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标的环部序列与靶序列特异性结合，形成的双链杂交体比分子信标的颈环结构更稳定，此时荧光基团与淬灭基团彼此分开，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，即可检测到荧光。其中识别的特异性强的优势，在检测SNP时一个位点就需要两个不同基因型的两个探针，这样一方面很难实现多个位点(2个以上位点)的同时检测，另外也增加的实验成本。
目前所采用的实时PCR方法多为单一荧光PCR方法，每次只能检测一个SNP位点，检测速度和灵敏度难以满足要求。随着他克莫司药物代谢相关SNP位点的相继发现，多个位点同时检测、综合分析以对临床用药进行更具有说服力的指导成为亟待开发的技术方法。
发明内容
本发明目的是克服上述已有的基因SNP检测方法缺陷，提供一种以CYP3A4基因的两个SNP位点：rs55951658，rs28371759，CYP3A5基因的一个SNP位点：rs776746为检测目标的PCR多色探针定性检测技术，其探针是优化过的，其特异性稍微低一些，它可以同时和野生型及突变型结合，根据杂交后不同基因型产生不同温度的杂交峰的差异，实现与他克莫司药物代谢相关SNP位点的一管多重、灵敏、准确、快速的定性检测。
实现上述目的的具体方案是：
本发明涉及的PCR荧光标探针技术检测他克莫司药物代谢相关SNP位点的方法，包括以下步骤：
a.在CYP3A4基因的两个SNP位点:rs55951658，rs28371759，CYP3A5基因的一个SNP位点：rs776746上下游选择分别选择100-500bp左右的的片段作为靶序列，分别合成3对引物；
b.根据上述3个SNP位点，设计合成分子信标，3个分子信标探针序列及修饰的荧光基团和淬灭基团为rs55951658:FAM/BHQ1，rs28371759:ROX/BHQ2，rs776746：HEX/BHQ1；
c.提取待测标本中的DNA，使用步骤a中的引物、步骤b中的探针，与其他PCR反应体系成分混合，进行实时荧光定量检测；
d.根据检测反应结束后所形成的荧光杂交峰的位置，即所显示的Tm值作为判断标准：rs55951658(野/突)：65℃/62℃；rs28371759(野/突)：66℃/63℃；rs776746(野/突)：59℃/64℃，对样品3个SNP位点进行分型。
本发明方法的荧光定量PCR反应检测体系为：
所述的荧光定量PCR反应检测的反应条件是：95℃预变性5min；55个循环中：85-95℃变性15s，58-60℃引物退火45s，72℃延伸70s；72℃彻底延伸10min；95℃变性1min；40℃探针退火杂交1min；熔解曲线从50℃～90℃每升温1℃记录5次。
所述靶序列扩增引物和探针分别为：
rs55951658：
引物1:5’-AGGTGACACTATAGAATATTCCACTGGTGAAGGTTGG-3’
引物2:5’-GTACGACTCACTATAGGGAACCCATCACCCAGTAGACAG-3’；
rs55951658探针1：5’-CGCCTCGCTATAGAGAGGCACTTTTCGAGGCG-3’或，
rs55951658探针2：5’-CATCCTCGCTATAGAGAGGCACTTTGAGGATG-3’；
rs28371759：
引物3:5’-AGGTGACACTATAGAATACTTAGGGATTTGAGGGCTTC-3’
引物4:5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCGTGGTTTCATAGCCAG-3’；
rs28371759探针1：5’-CGGCCATCGGAGCTCGTGCCG-3’或，
rs28371759探针2：5’-CACGCGATCGGAGCTCGCTG-3’；
rs776746：
引物5:5’-AGGTGACACTATAGAATAACGTATGTACCACCCAGCT-3’
引物6:5’-GTACGACTCACTATAGGGA AAGAGTCTCACACAGGAGC-3’；
rs776746探针1：5’-CGGGGTGTCTTTCATATCTCTTCCCCG-3或，
rs776746探针2：5’-GGGAAGAGATATGAAAGACAATCCC-3’；
最优选为上述rs55951658探针2，rs28371759探针2，或rs776746探针1。
其中划线标粗部分为SNP位点；
本发明是针对他克莫司药物代谢相关基因SNP位点三重检测而设计，具有快速准确、灵敏特异等特点。突出特点在于将3个相关的位点放在同一反应体系内扩增检测，利用优化过的探针与扩增产物的杂交，检测反应体系中的杂交峰，基于不同基因型的靶序列所形成的杂交峰所显示的Tm值为结果判断标准。
附图说明
图1，rs 55951658分型结果
图2，rs28371759分型结果
图3，rs776746分型结果
图4，三位点三重体系检测
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于以下实施例：
实施例1：单个位点探针检测不同基因型标准品质粒
实验流程：(1)含有目标SNP位点的野生型标准品质粒的制备：根据NCBI SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)获取rs55951658，rs28371759，和rs776746三个位点的序列信息(包含SNP位点上下游个500bp),设计好三对扩增引物：
rs55951658F:CCTGTCCCCACCAGATTCAT，
rs55951658R:CTTGTCTGTCTCCACTCCGT；
rs28371759F:GCCCACATTCTCGAAGACCT，
rs28371759R:CAGAGCCAGCACGTTTTACA；
rs776746F:TCTCCCCTCAAGTCCTCAGA，
rs776746R:TTCACTAGCCCGATTCTGCA。
用引物扩增DNA片段，获得的野生型标准品目的片段大小分别为：
rs55951658：543bp，
rs28371759：598bp，
rs776746：553bp，分别***到pGEM-T载体上，即是野生型标准品质粒。
(2)含有目标SNP位点的突变型标准品质粒的制备：定点突变第一轮PCR分别用F和Rm、Fm和R作为引物进行PCR反应。每个位点分别得到两条PCR产物，大小分别为rs55951658：150bp和414bp，rs28371759：248bp和371bp，rs776746：218bp和356bp，回收定点突变第一轮PCR中的上下游两段PCR产物作为模板进行第二轮PCR，得到突变型标准品的完整目的片段，大小分别为rs55951658：543bp，rs28371759：598bp，rs776746：553bp，分别再***到pGEM-T载体上，通过酶切鉴定及测序可以确定突变型标准品序列的准确。
(3)扩增体系的优化：
1)[Mg2+]
单独针对rs55951658位点进行[Mg2+]的梯度实验，分别设置3.0mM/μl、3.5mM/μl、4.0mM/μl、4.5mM/μl四个Mg2+浓度梯度，保持其他条件不变，进行扩增和溶解曲线检测实验，从扩增结果及探针杂交结果评估和确定最佳的[Mg2+]。综合考虑杂交峰情况、镁离子用量以及扩增特异性等条件，确定使用[Mg2+]：3.5mM/μl作为最终的体系用量。
2)探针量
分别设置0.1μM/μl和0.05μM/μl的探针量，保持其他条件不变，进行探针的扩增杂交检测实验，从探针杂交结果评估和确定最佳的探针量。从杂交峰的峰值高低以及尖锐程度综合考虑，确定使用0.05μM/μl的探针量作为最终的体系用量。
3)引物量
分别设置下游、上游引物量0.2μM，0.3μM，0.5μM，1.0μM，保持其他条件不变，进行探针的扩增杂交检测实验，从扩增结果和探针杂交结果综合评估和确定最佳的上下游引物量比值。通过对比发现，下游、上游引物量比值0.2-0.5μM时，对于扩增以及探针杂交的情况方面均无较大影响，最终确定使用的引物量0.3μM作为最终的体系方案。
4)单个位点探针的选择
在最终优化确定的扩增杂交体系中，对制备成功的标准品进行检测，进一步确认探针对SNP位点检测方法的可行性和准确性。通过对比每个位点的2-3个探针时，从扩增结果和探针杂交结果综合评估和确定最佳的探针分别是：rs55951658探针2，rs28371759探针2，rs776746探针1：作为最终的体系方案。
结果读取：rs55951658位点野生型的峰在65℃，突变型的在62℃(见图1)；rs28371759位点野生型的峰在66℃，突变型的在63℃(见图2)；rs776746位点野生型的峰在59℃，突变型的在64℃(见图3)。
实施例2：三个位点的三重荧光PCR扩增分型
首先尝试了三重体系检测预实验，利用构建好的各种基因型的标准品质粒做模板，实验结果显示在三重检测体系中三个位点的检测均可实现且相互之间没有干扰，并能正确的区分出三个位点的野生纯合子，杂合子和突变纯合子。
结果读取：rs55951658位点结果呈现在FAM通道，野生型的峰在65℃，突变型的在62℃，两个位置都有峰说明是杂合子；rs28371759位点结果呈现在ROX通道，野生型的峰在66℃，突变型的在63℃，两个位置都有峰说明是杂合子；rs776746位点结果呈现在HEX通道，野生型的峰在59℃，突变型的在64℃，两个位置都有峰说明是杂合子(图4)。
接着我们对96份人基因组DNA进行的分型实验，分型成功率达到100％，并与测序结果相比对，测序成功率94.7％，在这90个测序成功的样本中，分型结果一致性为100％。因此与分型的金标准测序来说，我们的新型分型技术的分型准确率达到100％，分型成功率也达100％，高于测序组。
最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，并不用做对本发明保护范围的限定。

Claims (10)

1.一种他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含检测CYP3A4基因和/或CYP3A5基因SNP位点的特异性引物和探针；所述SNP位点优选CYP3A4基因的SNP位点：rs55951658，rs28371759；和/或CYP3A5基因的SNP位点：rs776746。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为：
rs55951658：
引物1:5’-AGGTGACACTATAGAATATTCCACTGGTGAAGGTTGG-3’
引物2:5’-GTACGACTCACTATAGGGAACCCATCACCCAGTAGACAG-3’
rs28371759：
引物3:5’-AGGTGACACTATAGAATACTTAGGGATTTGAGGGCTTC-3’
引物4:5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCGTGGTTTCATAGCCAG-3’
rs776746：
引物5:5’-AGGTGACACTATAGAATAACGTATGTACCACCCAGCT-3’
引物6:5’-GTACGACTCACTATAGGGAAAGAGTCTCACACAGGAGC-3’。
3.权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述探针为荧光探针；所述荧光探针优选为：rs55951658探针1：5’-CGCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTTCGAGGCG-3’或，
rs55951658探针2：5’-CATCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTGAGGATG-3’；
rs28371759探针1：5’-CGGCCATCTGGAGCTCGTGCCG-3’或，
rs28371759探针2：5’-CACGCGATCTGGAGCTCGCTG-3’；
rs776746探针1：5’-CGGGGTGTCTTTCAATATCTCTTCCCCG-3或，
rs776746探针2：5’-GGGAAGAGATATTGAAAGACAATCCC-3’；
最优选为上述rs55951658探针2，rs28371759探针2，或rs776746探针1。
4.权利要求3所述试剂盒，其特征在于，修饰探针所使用的荧光基团选自FAM、ROX、或HEX；淬灭基团选自BHQ2或BHQ1。
5.CYP3A4基因的SNP位点rs55951658，rs28371759和/或CYP3A5基因的SNP位点rs776746在他克莫司个性化用药相关基因的分型检测中的应用。
6.一种利用多重PCR-荧光标记探针对他克莫司个性化用药相关基因进行分型的方法，其包括以下步骤：
a.根据CYP3A4基因的两个SNP位点：rs55951658，rs28371759，CYP3A5基因的一个SNP位点：rs776746的基因序列分别设计三对特异引物和三个荧光探针；
b.配制多重PCR扩增目标基因序列-多色探针检测的反应体系；
c.提取待测样本中的DNA,用步骤a.中的三对引物同时扩增出三段包含上述SNP位点的基因序列；
d.利用特异性探针与扩增产物的杂交，分别检测反应结束后杂交峰的位置指示的Tm值，根据Tm值判断SNP位点的基因型；
所述的三对特异引物序列优选为：
rs55951658：
引物1:5’-AGGTGACACTATAGAATATTCCACTGGTGAAGGTTGG-3’
引物2:5’-GTACGACTCACTATAGGGAACCCATCACCCAGTAGACAG-3’
rs28371759：
引物3:5’-AGGTGACACTATAGAATACTTAGGGATTTGAGGGCTTC-3’
引物4:5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCGTGGTTTCATAGCCAG-3’
rs776746：
引物5:5’-AGGTGACACTATAGAATAACGTATGTACCACCCAGCT-3’
引物6:5’-GTACGACTCACTATAGGGAAAGAGTCTCACACAGGAGC-3’；
所述的探针优选为：
rs55951658探针1：5’-CGCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTTCGAGGCG-3’或，
rs55951658探针2：5’-CATCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTGAGGATG-3’；
rs28371759探针1：5’-CGGCCATCTGGAGCTCGTGCCG-3’或，
rs28371759探针2：5’-CACGCGATCTGGAGCTCGCTG-3’；
rs776746探针1：5’-CGGGGTGTCTTTCAATATCTCTTCCCCG-3或，
rs776746探针2：5’-GGGAAGAGATATTGAAAGACAATCCC-3’；
最优选为上述rs55951658探针2，rs28371759探针2，或rs776746探针1。
7.权利要求6所述方法，其特征在于，修饰荧光探针所使用的荧光基团选自FAM、ROX、或HEX；淬灭基团选自BHQ2或BHQ1。
8.权利要求6或7所述方法，其特征在于，荧光探针为：
rs55951658探针1：5’-FAM-CGCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTTCGAGGCG-BHQ1-3’或，
rs55951658探针2：5’-FAM-CATCCTCGCTATAGAGATGGCACTTTGAGGATG-BHQ1-3’；
rs28371759探针1：5’-ROX-CGGCCATCTGGAGCTCGTGCCG-BHQ2-3’或，
rs28371759探针2：5’-ROX-CACGCGATCTGGAGCTCGCTG-BHQ2-3’；
rs776746探针1：5’-HEX-CGGGGTGTCTTTCAATATCTCTTCCCCG-BHQ1-3或，
rs776746探针2：5’-HEX-GGGAAGAGATATTGAAAGACAATCCC-BHQ1-3’；
优选为上述rs55951658探针2，rs28371759探针2，或rs776746探针1。
9.权利要求6-8任一项所述方法，其特征在于，PCR扩增目标基因序列-荧光标记探针分型检测的反应体系为：
三重体系-PCR：
。
10.权利要求6-9任一项所述方法，其特征在于，分型检测的反应条件是：95℃预变性5min；55个循环中：95℃变性15s，58-60℃引物退火45s，72℃延伸70s；72℃彻底延伸10min；95℃变性1min；40℃探针退火杂交1min；熔解曲线从50℃～90℃每升温1℃记录5次 。
CN201610478109.5A 2016-06-27 2016-06-27 他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒 Pending CN106086192A (zh)

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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254514A (zh) * 2017-05-12 2017-10-17 苏州人人基因科技有限公司 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途
CN108179180A (zh) * 2017-10-25 2018-06-19 广州和康医疗技术有限公司 一种对cyp3a5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒
CN108410961A (zh) * 2018-07-10 2018-08-17 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种检测cyp3a4、cyp3a5多态性位点的试剂盒及其方法
CN108841948A (zh) * 2018-06-07 2018-11-20 厦门为正生物科技股份有限公司 用于检测人细胞色素p450相关基因多态性的引物组、试剂盒及检测方法
CN108977526A (zh) * 2018-06-26 2018-12-11 苏州道尔盾基因科技有限公司 一种他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的检测方法及试剂盒
CN110551813A (zh) * 2019-10-18 2019-12-10 江苏先声医疗器械有限公司 用于检测风湿免疫疾病的药物代谢能力的相关snp位点的引物组、应用、产品及方法
CN110923311A (zh) * 2019-12-24 2020-03-27 广州市妇女儿童医疗中心 用于指导肾病综合征cyp3a5非表达型患儿使用他克莫司的多态性位点
CN112301114A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 上海利康精准医疗技术有限公司 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒
CN112301112A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 上海利康精准医疗技术有限公司 用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277443A (zh) * 2011-09-16 2011-12-14 协和干细胞基因工程有限公司 检测他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的试剂盒及扩增方法和检测方法
CN103198236A (zh) * 2012-01-06 2013-07-10 深圳华大基因科技有限公司 Cyp450基因型别数据库及基因分型、酶活性鉴定方法
CN103198238A (zh) * 2012-01-06 2013-07-10 深圳华大基因科技有限公司 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测
CN104805181A (zh) * 2015-03-26 2015-07-29 协和干细胞基因工程有限公司 一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277443A (zh) * 2011-09-16 2011-12-14 协和干细胞基因工程有限公司 检测他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的试剂盒及扩增方法和检测方法
CN103198236A (zh) * 2012-01-06 2013-07-10 深圳华大基因科技有限公司 Cyp450基因型别数据库及基因分型、酶活性鉴定方法
CN103198238A (zh) * 2012-01-06 2013-07-10 深圳华大基因科技有限公司 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测
CN104805181A (zh) * 2015-03-26 2015-07-29 协和干细胞基因工程有限公司 一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELENS L等: "CYP3A4*22: promising newly identified CYP3A4 variant allele for personalizing pharmacotherapy", 《PHARMACOGENOMICS》 *
GAURAB POKHREL(佳乌拉): "细胞色素CYP(450)3A4、3A5和2D6基因单核苷酸多态性对肾移植患者他克莫司代谢的影响", 《万方学位论文库》 *
WANG DANXIN等: "The Making of a CYP3A Biomarker Panel for Guiding Drug Therapy", 《JOURNAL OF PERSONALIZED MEDICINE》 *
江雅新等: "一种新型荧光探针—分子信标的研究及应用进展", 《分析化学》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254514A (zh) * 2017-05-12 2017-10-17 苏州人人基因科技有限公司 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途
CN107254514B (zh) * 2017-05-12 2020-03-17 上海奥根诊断技术有限公司 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途
CN108179180A (zh) * 2017-10-25 2018-06-19 广州和康医疗技术有限公司 一种对cyp3a5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒
CN108841948A (zh) * 2018-06-07 2018-11-20 厦门为正生物科技股份有限公司 用于检测人细胞色素p450相关基因多态性的引物组、试剂盒及检测方法
CN108977526A (zh) * 2018-06-26 2018-12-11 苏州道尔盾基因科技有限公司 一种他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的检测方法及试剂盒
CN108410961A (zh) * 2018-07-10 2018-08-17 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种检测cyp3a4、cyp3a5多态性位点的试剂盒及其方法
CN108410961B (zh) * 2018-07-10 2019-01-04 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种检测cyp3a4、cyp3a5多态性位点的试剂盒及其方法
WO2020011277A1 (zh) * 2018-07-10 2020-01-16 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种检测cyp3a4、cyp3a5多态性位点的试剂盒及其方法
CN112301114A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 上海利康精准医疗技术有限公司 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒
CN112301112A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 上海利康精准医疗技术有限公司 用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒
CN110551813A (zh) * 2019-10-18 2019-12-10 江苏先声医疗器械有限公司 用于检测风湿免疫疾病的药物代谢能力的相关snp位点的引物组、应用、产品及方法
CN110923311A (zh) * 2019-12-24 2020-03-27 广州市妇女儿童医疗中心 用于指导肾病综合征cyp3a5非表达型患儿使用他克莫司的多态性位点
CN110923311B (zh) * 2019-12-24 2023-04-18 广州市妇女儿童医疗中心 用于指导肾病综合征cyp3a5非表达型患儿使用他克莫司的多态性位点

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