CN106085960A - 一种培养dc细胞的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种培养DC细胞的培养基及培养方法。本发明所述培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3；所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介素4、GM‑CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM‑CSF的RPMI1640培养基；所述组分3为含有牛血清白蛋白、CD40L、GM‑CSF和白介素4的RPMI1640培养基。结果显示采用所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤的杀伤能力也大大提高。同时避免了血清的使用，减少了病原微生物的风险。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种培养DC细胞的培养基及培养方法。
背景技术
DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。国际上已经有通过利用DC细胞制作的肿瘤疫苗，就是通过DC细胞的抗原提呈能力，将肿瘤细胞抗原提呈给T细胞，从而使得T细胞能够针对性的杀伤肿瘤。而DC细胞在血液中的含量并不高，因此通过体外培养来获得大量的DC细胞在免疫细胞治疗方面具有非常重大的意义。
通常用于培养DC细胞的培养方案是：通过获取外周血中的贴壁细胞，然后用含有10％FBS、500U/mL的GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基培养6天，再加入20ng/mL的TNF-α刺激DC细胞成熟2天。
然而DC细胞很难被增殖，采用现有的方法培养DC细胞后DC细胞的增殖倍数大都仅在几倍或者几十倍，因此往往需要大量抽取病人血液以获取足够数量的DC细胞来致敏其他T细胞，而病人由于自身疾病的关系，能够抽取的血液量较少，并且其中DC细胞的含量更少，就更加难以扩增。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种培养DC细胞增殖倍数大的培养基及培养方法。采用本发明所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤的杀伤能力也大大提高。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3；所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基；所述组分3为含有牛血清白蛋白、CD40L、GM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。
其中GM-CSF为粒细胞集落刺激生物因子，CD40L为肿瘤坏死因子相关激活蛋白。
作为优选，所述培养DC的培养基中，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
在一些实施方案中，所述培养DC的培养基中，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
在一些实施方案中，所述培养DC的培养基中，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
在另一些实施方案中，所述培养DC的培养基中，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
本发明还提供了一种DC的培养方法，包括以下步骤：
1)第0天将单个核细胞用权利要求1所述培养基的组分1重悬，37℃，5％CO2培养48小时；
2)第2天向培养基中添加白介素14和白介素2继续培养；
3)第4天补加权利要求1所述培养基的组分2，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分2，到第10天；
4)第10天向培养基中加入CD40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分3，到第16天；
5)第17天加入TNFα培养24小时；
6)第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC细胞。
其中，本发明所述的培养方法中步骤1)所述重悬后的细胞密度优选为5×105个/ml-1×106个/ml。
本发明所述的培养方法中步骤3补加权利要求1所述培养基的组分2后的细胞密度优选为5×105个/ml-1×106个/ml。
本发明所述的培养方法中步骤4补加权利要求1所述培养基的组分3后的细胞密度优选为5×105个/ml-1×106个/ml。
本发明所述的培养方法在第2天向培养基中添加白介素14和白介素2。其中添加白介素14至终浓度35ng/ml，添加白介素2至终浓度50ng/ml。
在本发明培养第10天时向培养基中添加CD40L。所述CD40L的添加量为至终浓度15ng/ml。
在本发明培养第17天时向培养基中添加TNFα，刺激DC细胞成熟，所述TNFα的添加量为至终浓度10ng/ml。
本领域技术人员可以理解，本发明所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种培养DC细胞的培养基及培养方法。本发明所述培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3；所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基；所述组分3为含有牛血清白蛋白、CD40L、GM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。本发明所述培养DC的方法，将单个核细胞所述培养基的组分1重悬，37℃，5％CO2培养48小时；第2天向培养基中添加白介素14和白介素2继续培养；第4天补加权利要求1所述培养基的组分2，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分2，到第10天；第10天向培养基中加入CD40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分3，到第16天；第17天加入TNFα培养24小时；第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC细胞。试验结果显示本发明培养的DC细胞CD86+CD11c+的比例以及DC细胞增殖倍数高于现有培养方法。且培养获得的DC细胞对肿瘤细胞的杀伤效果远远高于现有培养方法。表明采用本发明所述培养基培养的DC细胞的抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强，对肿瘤的杀伤能力也大大提高。同时避免了血清的使用，减少了病原微生物的风险。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明本发明所述K562细胞，为购买自美国ATCC。
实施例1 DC细胞培养
培养基配方：
组分1：
组分2：
组分3：
培养方法：
第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养48小时。
第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
第4天计算细胞数，按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2，到第10天。
第10天向培养基中加入15ng/ml的CD40L，之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分3，到第16天。
第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFα刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。
第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
实施例2 DC细胞培养
培养基配方：
组分1：
组分2：
组分3：
培养方法：
第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养48小时。
第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
第4天计算细胞数，按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2，到第10天。
第10天向培养基中加入15ng/ml的CD40L，之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分3，到第16天。
第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFα刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。
第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
实施例3 DC细胞培养
培养基配方：
组分1：
组分2：
组分3：
培养方法：
第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用组分1重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养48小时。
第2天向培养基中添加35ng/ml白介素14和50ng/ml白介素2。
第4天计算细胞数，按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2。之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分2，到第10天。
第10天向培养基中加入15ng/ml的CD40L，之后每3天按照5×105-1×106/ml的密度向培养瓶补加组分3，到第16天。
第17天向培养瓶中加入10ng/ml的TNFα刺激DC细胞成熟，刺激时间为24小时。
第18天将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
对比例
第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用RPMI1640培养基重悬至密度为5×105-1×106/ml，放入培养瓶中培养箱中37℃，5％CO2培养3小时。
弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10％FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天。
再加入20ng/mL的TNF-α刺激DC细胞成熟2天。
将DC细胞和K562细胞进行共培养，48小时后即可收获DC细胞成品。
实施例4 CIK细胞培养
抽取20ml外周血用含有10％FBS的RPMI1640培养基重悬，按照1×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mL IFN-λ，在37℃、5％CO2的培养箱诱导培养CIK细胞；
第2天补加50-150U/mL的IL-1α、10-50ng/ml的OKT-3以及100-1000U/ml的IL-2溶液继续培养；
之后每3天补充含有10％FBS和1000U/ml IL-2的RPMI1640培养基，保持细胞密度在5×105/ml。直到第20天。
试验例：
检测实施例1-3及对比例收获的DC细胞的流式数据和增殖倍数。结果见表1和表2。
然后分别取第21天收获的实施例1-3及对比例DC细胞和实施例4收获的CIK细胞混合放置24小时。检测DC细胞和CIK细胞的混合液的细胞杀伤数据。结果见表3。
表1流式数据对比
| 细胞分组 | 实施例1 | 实施例3 | 实施例5 | 对比例 |
| CD86+CD11c+ | 86％ | 81％ | 75％ | 18％ |
表2细胞增殖倍数比较
| 细胞分组 | 实施例1 | 实施例3 | 实施例5 | 对比例 |
| 增殖倍数 | 82 | 73 | 68 | 8 |
CD86+和CD11c+是存在于DC细胞的表面标志物，它们在细胞中的比例说明了DC细胞含量的多少。表1结果显示实施例1-3培养获得的DC细胞中CD86+CD11c+的比例明显高于对比例。而表2结果显示实施例1-3培养获得的DC细胞增殖倍数要远远高于对比例，表明本发明所述培养基对于DC细胞的增殖有着较强的促进作用。
表3对靶细胞杀伤数据对比
| 细胞分组 | 实施例1 | 实施例3 | 实施例5 | 对比例 |
| 杀伤结果 | 96％ | 89％ | 86％ | 43％ |
杀伤数据是测量混合后的免疫细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力，杀伤百分比越高，说明免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果越好，细胞质量越好。表3结果显示实施例1-3培养获得的DC细胞对肿瘤细胞的杀伤效果要远远高于对比例。采用本发明所述培养基培养DCDC细胞抗原提呈能力更强，对T细胞的致敏能力更强。
Claims (10)
1.一种培养DC的培养基，包括组分1、组分2和组分3；所述组分1为含有牛血清白蛋白、白介素4、GM-CSF和干细胞生长因子SCF的RPMI1640培养基；所述组分2为含有牛血清白蛋白、白介素14、白介素2、白介素4和GM-CSF的RPMI1640培养基；所述组分3为含有牛血清白蛋白、CD40L、GM-CSF和白介素4的RPMI1640培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，
所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述组分1的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分2的RPMI1640培养基中各成分含量为：
所述组分3的RPMI1640培养基中各成分含量为：
6.一种DC的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)第0天将单个核细胞用权利要求1所述培养基的组分1重悬，37℃，5％CO2培养48小时；
2)第2天向培养基中添加白介素14和白介素2继续培养；
3)第4天补加权利要求1所述培养基的组分2，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分2，到第10天；
4)第10天向培养基中加入CD40L，之后每3天补加权利要求1所述培养基的组分3，到第16天；
5)第17天加入TNFα培养24小时；
6)第18天加入K562细胞共培养48小时，收获DC细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述重悬后的细胞密度为5×105个/ml-1×106个/ml；步骤3补加权利要求1所述培养基的组分2后的细胞密度为5×105个/ml-1×106个/ml；步骤4补加权利要求1所述培养基的组分3后的细胞密度为5×105个/ml-1×106个/ml。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)添加白介素14至终浓度35ng/ml，添加白介素2至终浓度50ng/ml。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)添加CD40L至终浓度15ng/ml。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5)添加TNFα至终浓度10ng/ml。
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