CN105602902A - 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 - Google Patents

一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法，包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；所述DC细胞培养试剂包括DC细胞培养试剂A和DC细胞培养试剂B，DC细胞培养试剂A包含GM-SCF和IL-4，DC细胞培养试剂B包含GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC；所述CIK细胞培养试剂包括CIK细胞培养试剂A和CIK细胞培养试剂B，CIK细胞培养试剂A包含INF-γ，CIK细胞培养试剂B包含OKT-3、IL-1α和IL-2；所述共培养试剂包含化合物Cephaloziellin？N和IL-2。本发明提供的DC-CIK细胞培养试剂和培养方法，可以获得高增殖力、高杀伤力的DC-CIK细胞。

Description

一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到***的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细胞疗法、TIL细胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。
树突状细胞(Dendriticcells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
DC和CIK共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫***功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法，以获得高增殖力、高杀伤力的DC-CIK细胞。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种DC-CIK细胞培养试剂，包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；所述DC细胞培养试剂包括DC细胞培养试剂A和DC细胞培养试剂B，DC细胞培养试剂A包含GM-SCF和IL-4，DC细胞培养试剂B包含GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC；所述CIK细胞培养试剂包括CIK细胞培养试剂A和CIK细胞培养试剂B，CIK细胞培养试剂A包含INF-γ，CIK细胞培养试剂B包含OKT-3、IL-1α和IL-2；所述共培养试剂包含化合物CephaloziellinN和IL-2。
进一步地，所述的DC-CIK细胞培养试剂还包括含有血浆的无血清培养基。
进一步地，所述无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。
进一步地，所述DC细胞培养试剂A中，GM-SCF的浓度为100～500U/mL，IL-4的浓度为100～500U/mL。
进一步地，所述DC细胞培养试剂B中，GM-SCF的浓度为100～300U/mL，IL-4的浓度为200～400U/mL，TNF-α的浓度为300～500U/mL，MDC的浓度为5～15ng/mL。
进一步地，所述CIK细胞培养试剂A中，INF-γ的浓度为500～900U/mL。
进一步地，所述CIK细胞培养试剂B中，OKT-3的浓度为60～100ng/mL、IL-1α的浓度为100～200U/mL，IL-2的浓度为600～800U/mL。
进一步地，所述共培养试剂中，IL-2的浓度为100～500U/mL。
进一步地，所述共培养试剂中，化合物CephaloziellinN的浓度为20～40μg/mL。
一种利用上述DC-CIK细胞培养试剂培养DC-CIK细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞和悬浮细胞；
步骤S2，采用DC细胞培养试剂A培养所述贴壁细胞，培养4～6天后，采用DC细胞培养试剂B培养24～48h，得到DC细胞；采用CIK细胞培养试剂A培养所述悬浮细胞，培养1～3天后，采用CIK细胞培养试剂B继续培养7～8天，继续培养过程中每隔3天补加IL-2，获得CIK细胞；
步骤S3，将步骤S2中的DC细胞和CIK细胞混合，采用所述共培养试剂培养5～8天，得到DC-CIK细胞。
本发明的优点：
本发明提供的培养试剂可以培养出增殖力高、杀伤力强的DC-CIK细胞。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
本发明化合物CephaloziellinN的制备方法参见文献：SecondaryMetabolitesfromtheChineseLiverwortCephaloziellakiaeri,J.Nat.Prod.2013,76,1700-1708。
实施例1：DC-CIK细胞培养
(一)单个核细胞分离
1、外周血或脐带血40mL，500～800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000～3000g离心5min，上清血浆2～8℃备用；
2、下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液:Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3、500～700g离心15～30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1、获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200～400g离心5min，清洗两遍；
2、加无血清培养基(含5％自体血浆)重悬细胞，按2～8×106/mL接种T75培养瓶中静置1～5h，获得贴壁细胞；
3、贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为300U/mL、IL-4为300U/mL进行培养；
4、三天后补加GM-SCF为300U/mL、IL-4为300U/mL，培养至4～6天后换液，同时添加GM-SCF为20U/mL、IL-4为30U/mL、TNF-α为400U/mL、MDC为10ng/mL，培养36h，得到目的DC细胞。
(三)CIK细胞培养
1、DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一T75培养瓶中并计数，根据计数结果，调整细胞密度为5～15×105/mL进行CIK培养；
2、第1天添加细胞因子INF-γ700U/mL，自体血浆5％；第2天添加细胞因子OKT-380ng/mL、IL-1α150U/mL、IL-2700U/mL；
3、每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加5％的自体血浆)，维持细胞密度5～20×105/mL，并添加700U/mL的IL-2。
(四)DC细胞和CIK细胞共培养
CIK培养至7天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加300U/mL的IL-2和30μg/mL的化合物CephaloziellinN，培养7天后获得DC-CIK细胞。
实施例2：实施例1对比，仅DC细胞和CIK细胞共培养时不添加CephaloziellinN
(一)单个核细胞分离
1、外周血或脐带血40mL，500～800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000～3000g离心5min，上清血浆2～8℃备用；
2、下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液:Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3、500～700g离心15～30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1、获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200～400g离心5min，清洗两遍；
2、加无血清培养基(含5％自体血浆)重悬细胞，按2～8×106/mL接种T75培养瓶中静置1～5h，获得贴壁细胞；
3、贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-SCF为300U/mL、IL-4为300U/mL进行培养；
4、三天后补加GM-SCF为300U/mL、IL-4为300U/mL，培养至4～6天后换液，同时添加GM-SCF为20U/mL、IL-4为30U/mL、TNF-α为400U/mL、MDC为10ng/mL，培养36h，得到目的DC细胞。
(三)CIK细胞培养
1、DC细胞培养第2步中未贴壁的细胞转移至另一T75培养瓶中并计数，根据计数结果，调整细胞密度为5～15×105/mL进行CIK培养；
2、第1天添加细胞因子INF-γ700U/mL，自体血浆5％；第2天添加细胞因子OKT-380ng/mL、IL-1α150U/mL、IL-2700U/mL；
3、每隔3天补加无血清培养基(第1、4天加5％的自体血浆)，维持细胞密度5～20×105/mL，并添加700U/mL的IL-2。
(四)DC细胞和CIK细胞共培养
CIK培养至7天，DC细胞和CIK细胞混合培养，同时添加300U/mL的IL-2，培养7天后获得DC-CIK细胞。
实施例3：效果实施例
分别测定实施例1和实施例2共培养7天后DC-CIK细胞的数量和存活率，以及对K562肿瘤细胞的杀伤力。
肿瘤杀伤试验流程具体如下：
分别取杀伤性细胞(效应细胞)和肿瘤细胞(靶细胞K562)，按效应细胞：靶细胞为20:1进行试验，即取靶细胞1×105，效应细胞分别取2×106，共培养4h。
同时做1组靶细胞自然凋亡
通过酶标仪检测靶细胞死亡后分泌的蛋白成分鉴定，确定靶细胞自然凋亡量和各组杀伤后靶细胞死亡量，计算：杀伤组死亡的靶细胞量减去自然凋亡的细胞量，再除以靶细胞总量，得到杀伤效率值。
结果见下表。
组别 DC-CIK细胞的数量 DC-CIK细胞存活率(％) 杀伤效率值(％)
实施例1 2.1×1010 97.5 90.5
实施例2 5.8×109 95.6 70.2
上述结果表明，本发明提供的DC-CIK细胞培养试剂和培养方法，可以获得高增殖力、高杀伤力的DC-CIK细胞。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；所述DC细胞培养试剂包括DC细胞培养试剂A和DC细胞培养试剂B，DC细胞培养试剂A包含GM-SCF和IL-4，DC细胞培养试剂B包含GM-SCF、IL-4、TNF-α和MDC；所述CIK细胞培养试剂包括CIK细胞培养试剂A和CIK细胞培养试剂B，CIK细胞培养试剂A包含INF-γ，CIK细胞培养试剂B包含OKT-3、IL-1α和IL-2；所述共培养试剂包含化合物CephaloziellinN和IL-2。
2.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：还包括含有血浆的无血清培养基。
3.根据权利要求2所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。
4.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述DC细胞培养试剂A中，GM-SCF的浓度为100～500U/mL，IL-4的浓度为100～500U/mL。
5.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述DC细胞培养试剂B中，GM-SCF的浓度为100～300U/mL，IL-4的浓度为200～400U/mL，TNF-α的浓度为300～500U/mL，MDC的浓度为5～15ng/mL。
6.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述CIK细胞培养试剂A中，INF-γ的浓度为500～900U/mL。
7.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述CIK细胞培养试剂B中，OKT-3的浓度为60～100ng/mL、IL-1α的浓度为100～200U/mL，IL-2的浓度为600～800U/mL。
8.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述共培养试剂中，IL-2的浓度为100～500U/mL。
9.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养试剂，其特征在于：所述共培养试剂中，化合物CephaloziellinN的浓度为20～40μg/mL。
10.一种利用权利要求1～9任一所述DC-CIK细胞培养试剂培养DC-CIK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞和悬浮细胞；
步骤S2，采用DC细胞培养试剂A培养所述贴壁细胞，培养4～6天后，采用DC细胞培养试剂B培养24～48h，得到DC细胞；采用CIK细胞培养试剂A培养所述悬浮细胞，培养1～3天后，采用CIK细胞培养试剂B继续培养7～8天，继续培养过程中每隔3天补加IL-2，获得CIK细胞；
步骤S3，将步骤S2中的DC细胞和CIK细胞混合，采用所述共培养试剂培养5～8天，得到DC-CIK细胞。
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