CN106053839A - 一种测定结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：缓冲液、加速剂、表面活性剂、无机盐离子、防腐剂、其溶剂为纯化水，试剂R2：缓冲液、助悬剂、表面活性剂、无机盐离子、防腐剂、抗人结合珠蛋白抗体、其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的结合珠蛋白的浓度。本发明具有操作方便、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
结合珠蛋白，又称触珠蛋白，是一种分子量为85000的酸性糖蛋白，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中，在CAM电泳及琼脂糖凝胶电泳中，结合珠蛋白位于α2区带，分子中有两对肽链（α链与β链）共同形成α2β2的四聚体。结合珠蛋白主要在肝脏合成，其降解也在肝脏，半衰期约为3.5～4天。
结合珠蛋白的主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，然后被单核-巨噬细胞***处理掉，正常情况下，人的红细胞在循环血中尽管不断受到机械损伤，但仍可保持其完整性，这与红细胞具有良好可塑性的细胞形态和血液微环境的相对稳定有关。当某种原因诱发红细胞在血管内破坏时，大量血红蛋白会释放到血液循环中，血红蛋白可以从人的肾脏滤过，造成肾脏损害，甚至造成不可逆转的肾功能损伤。当结合珠蛋白与游离血红蛋白结合成稳定的复合物后，由于其分子较大，不能从肾脏排出，这样可以阻止血红蛋白从肾小球滤过，避免游离血红蛋白对肾小管的损害，结合珠蛋白与游离血红蛋白结合成复合物后，呈现出新的抗原决定簇，可被单核细胞、巨噬细胞表面的血红蛋白清除受体（CD163）所识别并结合，之后被吞噬降解，从而除去了血循环中游离的血红蛋白，当检测发现血清结合珠蛋白含量下降时，结合病人的临床表现，可以确定是否发生了血管内溶血性疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和蚕豆病，以及先天性无结合珠蛋白血症等。还有一些其他类型的血管内溶血和部分血管外溶血时结合珠蛋白可降低，其降低的程度常与病性轻重相一致。
结合珠蛋白又是一种急性期时相反应蛋白，当机体处在应激状态时，血液中的结合珠蛋白明显增多，如心肌梗塞、肿瘤、炎症、创伤、感染等病理状态时，以及应用某些激素，如皮质激素和雄性激素后，其血清含量常有显著升高，并与严重程度和预后有关，研究结论表明，血清结合珠蛋白和铁蛋白含量的变化，对急性肺栓塞和深部静脉血栓形成的病人具有一定的诊断价值。另外在进行糖尿病合并血管病变患者的基础研究中，也发现血清结合珠蛋白含量与疾病进展发生相关性变化，HP基因型有可能是糖尿病冠状动脉病变的一个独立的风险因素，因此认为，对结合珠蛋白含量的动态监测，有益于糖尿病血管病变患者的治疗，尤其是在建立糖尿病患者血管病变预防策略时，具有十分重要的意义。
由于结合珠蛋白的合成与降解均在肝脏，并且在结合珠蛋白与血红蛋白的复合物形成与降解的过程中，结合珠蛋白不能重复利用，因此当肝脏功能出现问题时，体内的结合珠蛋白数量常发生明显的变化，合成不足则其含量减少，降解不足则其含量增多，此时化验检查血液中的结合珠蛋白含量是否减少或增加，对诊断肝脏疾病，判断疾病的预后，很有帮助。
目前市场上的测定结合珠蛋白的试剂普遍存在操作不便、测定准确度低的缺陷，因此需要进行改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺陷，而提供一种测定结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定结合珠蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
加速剂 15~45 g/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 10~300 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
助悬剂 10.0~30.0 ml/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 150~250 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯苯基醚中的一种，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用***胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯苯基醚中的一种，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
作为优选，本发明公开了一种测定结合珠蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 30g/L
吐温-80 15 ml/L
氯化钠 150 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
甘油 20 ml/L
吐温-80 14 ml/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 10.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明还公开了上述测定结合珠蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
加速剂 15~45 g/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 10~300 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
助悬剂 10.0~30.0 ml/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 150~250 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的结合珠蛋白的浓度。
作为优选，步骤（b）中,所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3：1。
作为优选，步骤（b）中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:150之间。
本发明的检测原理是：本发明所采用的免疫比浊法的反应原理是：样品中的结合珠蛋白可与试剂R2中的抗人结合珠蛋白抗体发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体免疫复合物，形成浊度，其浊度高低与样本中结合珠蛋白含量成正相关，通过测定浊度并与结合珠蛋白校准曲线进行换算，求出样品中结合珠蛋白的含量。
样本中结合珠蛋白的活性（g/L）= CS × （g/L）
式中：ΔAT 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中Hp的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本试剂中添加了助悬剂和加速剂，助悬剂有利于抗体的分散和稳定，加速剂则可以加速抗原抗体的反应，即使较微弱的变化也可以检测出来，提高了试剂分析灵敏度。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 30 g/L
吐温-80 15 ml/L
氯化钠 150 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
甘油 20 ml/L
吐温-80 14 ml/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 10.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 185 mmol/L
聚乙二醇-2000 45 g/L
聚氧乙烯苯基醚 10.0ml/L
氯化钾 300 mmol/L
苯甲酸钠 0.1g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 185 mmol/L
***胶 10.0 ml/L
聚氧乙烯苯基醚 10.0ml/L
氯化钾 250 mmol/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 18.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 30 g/L
吐温-80 15 ml/L
氯化钠 150 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
甘油 20 ml/L
吐温-80 14 ml/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 10.0 ml/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm，副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
3、检测步骤
（a）取210μl试剂R1与2μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入70μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中结合珠蛋白的活性（g/L）= CS × （g/L）计算出样本中的结合珠蛋白的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 185 mmol/L
聚乙二醇-2000 45 g/L
聚氧乙烯苯基醚 10.0ml/L
氯化钾 300 mmol/L
苯甲酸钠 0.1g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 185 mmol/L
***胶 10.0 ml/L
聚氧乙烯苯基醚 10.0ml/L
氯化钾 250 mmol/L
苯甲酸钠 0.1 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 18.0 ml/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm，副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
3、检测步骤
（a）取210μl试剂R1与2μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入70μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中结合珠蛋白的活性（g/L）= CS × （g/L）计算出样本中的结合珠蛋白的浓度。
表1为实施例1所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的结合珠蛋白的浓度为0.689 g/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（g/L） | 第2次（g/L） | 第3次（g/L） | 均值（g/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 0.677 | 0.685 | 0.683 | 0.682 | 1.06 |
| 实施例2 | 0.707 | 0.708 | 0.700 | 0.705 | 2.32 |
由表1可知，本发明所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的结合珠蛋白的浓度为2.00 g/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（g/L） | 第2次（g/L） | 第3次（g/L） | 均值（g/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 1.970 | 2.024 | 2.038 | 2.011 | 0.53 |
| 实施例2 | 1.946 | 2.049 | 1.918 | 1.971 | 1.45 |
由表2可知，本发明所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定结合珠蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种测定结合珠蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
加速剂 15~45 g/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 10~300 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
助悬剂 10.0~30.0 ml/L
表面活性剂 10.0~25.0 l/L
无机盐离子 150~250 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯苯基醚中的一种，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用***胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯苯基醚中的一种，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
聚乙二醇-8000 30 g/L
吐温-80 15 ml/L
氯化钠 150 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
甘油 20 ml/L
吐温-80 14 ml/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 10.0 ml/L
其溶剂为纯化水。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
加速剂 15~45 g/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 10~300 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
助悬剂 10.0~30.0 ml/L
表面活性剂 10.0~25.0 ml/L
无机盐离子 150~250 mmol/L
防腐剂 0.1~0.7 g/L
抗人结合珠蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的结合珠蛋白的浓度。
6.根据权利要求5所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中,所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3：1。
7.根据权利要求5所述的一种测定结合珠蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:150之间。
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| CN201610544881.2A CN106053839A (zh) | 2016-07-12 | 2016-07-12 | 一种测定结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法 |
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