CN104714040B - 血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法 - Google Patents

血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中葡萄糖氧化酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是采用双试剂内空白法进行测定，通过试剂I中3-氨基-1，2，4-***抑制血红素过氧化氢酶活性来抑制干扰反应；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成过氧化氢和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐和4-氨基安替比林缩合成兰色醌亚胺，仪器在595-610nm波长处检测。本发明检测时不受溶血中血红素过氧化酶干扰，是一种能消除溶血内源性干扰，准确性更高的葡萄糖检测方法。

Description

血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法
技术领域
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中葡萄糖的双试剂测定方法。
背景技术
临床实验室常用GOD-PAP法测定血清葡萄糖，测定波长为520nm，但此法易受脂血、黄疸血、溶血的干扰而造成或高或低的影响，当溶血标本采用葡萄糖氧化酶法单试剂反应中，血红素中过氧化氢酶会分解葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生的过氧化氢，从而使产生的红色醌亚胺与葡萄糖不成等量关系，而使葡萄糖测定结果偏低；脂血、黄疸、溶血在中测定波长为520nm产较大吸光度，从而干扰葡萄糖测定，脂血、黄疸、溶血等对血清葡萄糖的测定影响主要是光谱吸收；当脂血、黄疸、溶血血清指数较大时，会超过仪器设置的样品限，仪器会报警提示可能对结果造成影响，测定反应的光吸收远小于血清指数的光吸收，测定信号被“淹没”，光信号的微小变化对测定结果产生较大波动。
为了克服葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖干扰，特别是溶血干扰，本发明采用了双试剂内空白测定方法，使用3-氨基-1，2，4-***通过抑制血红素过氧化氢酶活性来抑制干扰反应；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成过氧化氢和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)和4-氨基安替比林缩合成兰色醌亚胺，仪器在595-610nm波长处检测，本发明检测时不受溶血中血红蛋白产生的血红素过氧化酶干扰。采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐色原物，由于形成兰色醌亚胺，其测定波长为600nm,在脂血、黄疸、溶血等光谱吸收远小于520nm红色醌亚胺的光吸收，增加了反应信号和噪音的比值，提高了测定的准确性，因此，既降低了内源性干扰，有消除了血清指数的干扰，是准确性更高的葡萄糖检测方法。
本研究采用新的酚衍生物N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐为Tinder反应的色源，显色反应的灵敏度高，且生成的醌亚胺染料最大吸收波长为600nm等方法，溶血、黄疸、脂血等引起的干扰使用双试剂和新色原物后明显减小，各项方法学指标满足临床实际应用需要，具有选择性好、灵敏度高、测定简便等特点，适合临床推广应用，具备全自动生化分析仪的临床实验室使用。
发明内容
为解决溶血标本中血红素过氧化氢酶干扰问题及血清指数干扰问题，本发明设计了双试剂测定方法，试剂配方及使用方法如下：
试剂I：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-***0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300200μL。
试剂II：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶(POD)20KU、过氧化物酶15KU、Proclin-300200μL。
其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ中变旋酶反应，α型葡萄糖转化为β-D型葡萄糖，3-氨基-1，2，4-***抑制血红素过氧化氢酶活性，抑制干扰反应如反应式(1)(2)；加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成过氧化氢和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐和4-氨基安替比林缩合成兰色醌亚胺如反应式(3)(4)，仪器在595-610nm波长处检测，以样品与试剂Ⅰ反应为空白，由试剂Ⅱ反应产生的兰色醌亚胺计算出葡萄糖的含量。本发明检测时不受溶血、脂血、黄疸等血清干扰，不受溶血中血红蛋白产生的血红素过氧化酶的影响，不增加工作量与试剂成本，经济方便易行，是一种既能消除内源性干扰，又能消除溶血、脂血、黄疸干扰，准确性更高的葡萄糖检测方法。
本发明方法葡萄糖氧化酶法测定反应公式：
第一步反应
第二步反应
附图说明
附图是本发明测定健康人体葡萄糖的反应曲线图。
具体实施方式：
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a.试剂Ⅰ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-***0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300200μL；
b.试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶(POD)20KU、过氧化物酶15KU、Proclin-300200μL。
c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。
其中，3-氨基-1，2，4-***为过血红素过氧化氢酶的抑制剂，Proclin-300为液体高效防腐剂。
测定程序
双试剂法：在日本OLYMPUSAU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将2μl样品加入到150μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在600nm波长处检测，仪器自动计算出葡萄糖结果如图1，反应参数见表1。
表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
反应ODGLU计算值＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
葡萄糖浓度＝F×ODGLU
其中ODGLU是葡萄糖产生的吸光度；OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度；OD2是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度；SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积；R2V2是试剂Ⅱ的体积；F是校正因数。
加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，所以，由葡萄糖产生的醌亚胺的吸光度为：ODGLU＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即ODGLU＝OD2–(2+150)/(2+150+50)×OD1，只要测出OD1和OD2即可计算出葡萄糖的浓度。
下面通过采用两种不同的检测试剂检测血清中的葡萄糖,来进一步说明本发明的积极效果。
1.检测对象：健康体检人员68人，其中男性52人，平均年龄42.5岁；女性34人，平均年龄39.5岁，空腹采血。
2.试剂
2.1试剂：
(1)全国临床检验操作规程推荐方法按中华医学会推荐法配制:试剂Ⅰ：每升0.1mmol(pH7.0)磷酸盐缓冲液中溶解葡萄糖氧化酶1200U、过氧化氢酶1200U，4-氨基安替比林10mg；试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中溶解4-氯酚1g。测定时试剂I∶试剂II等量混合。样品∶试剂＝1∶150，37℃，反应8.1分钟520nm波长处终点法测定。
(2)本发明测定方法试剂Ⅰ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-***0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300200μL；试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶(POD)20KU、过氧化氢酶15KU、Proclin-300200μL。样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5.1分钟，600nm波长处终点法测定。
2.2标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。
3.仪器：日本OlympusAU2700型全自动生化分析仪4.方法将患者血清分为两组，正常血清组采用生化管采血，离心分离进行测定，溶血组采用部分冻融红细胞溶血进行测定。
3.实验结果比较：
3.1采用全国临床检验操作规程推荐方法和本发明方法分别测定溶血组和正常血清组结果比较如表2：
表2两种葡萄糖测定方法测定溶血组和非溶血组血糖结果比较(mmol/L)
在表2中，本发明方法和推荐方法在测定正常组患者血清葡萄糖时，测定结果无显著性差异t＝1.03,P>0.05；本发明方法和推荐方法在测定溶血组患者血清葡萄糖时，测定结果有显著性差异t＝11.45,P<0.05，测定结果偏低。在应用葡萄糖氧化酶法测定溶血标本时，不仅受到溶血中过氧化氢酶的干扰，而且受到血清颜色的光谱吸收干扰，而造成较大误差，本发明通过应用双试剂内空白、添加血红素过氧化氢酶抑制剂、改变色原物颜色等方法，增加了反应信号和噪音的比值，减少了干扰反应，显著提高了测定方法的准确性。

Claims (4)

1.一种血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法，其特征在于：采用双试剂内空白法进行测定，试剂Ⅰ中每升0.1mol磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-***0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300200μL，其中3-氨基-1，2，4-***为血红素过氧化氢酶抑制剂；试剂Ⅱ中每升0.1mol磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶20KU、过氧化物酶15KU、Proclin-300200μL，其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，仪器在595～610nm波长处检测，以样品与试剂Ⅰ反应为空白，由试剂Ⅱ反应产生的兰色醌亚胺计算出葡萄糖的含量，计算公式为：
ODGLU＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
葡萄糖浓度＝F×ODGLU
其中ODGLU是葡萄糖产生的吸光度，OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法，其特征在于试剂I中色原物为4-氨基安替比林；试剂Ⅱ中色原物为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐。
3.根据权利要求1所述血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中磷酸盐缓冲液的pH值为7.0±0.2。
4.根据权利要求1所述血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法，其特征在于测定的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶70～80∶20～30。
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