CN106011190B - 一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，通过液体发酵培养鸡枞菌，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物。本发明采用的天然对氨基苯甲酸及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单安全，且环境友好，容易实现工业化生产。

Description

一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，属于生物医药领域。
背景技术
对氨基苯甲酸，又名PABA等，是许多有机合成中一个重要前体及中间体，用于染料和医药中间体，可用于生产活性红M-80，M-10B，活性红紫X-2R等染料以及制取氰基苯甲酸生产药物对羧基苄胺。对氨基苯甲酸可用作防晒剂，其衍生物对二甲氨基甲酸辛酯，是优良的防晒剂。含有PABA结构单元的一些衍生物具有抗癌、抗肿瘤、抗乙型肝炎病毒等药理作用。PABA还可参与叶酸的合成，其氨基酸衍生物可用于二氢叶酸还原酶，胸苷酸合成酶，法尼基转移酶等酶抑制剂的合成，还可以作为合成具有抗糖尿病分子的活性片段。文献表明具有PABA结构单元的一些化合物能能够修饰过氧化氢酶激活受体（peroxisomeproliferator activated receptors， PPAR），具有较好的PPAR激动活性，可用于缓解治疗乳糖不难受症所导致的腹胀，腹痛。2-甲氧基-4-氨基苯甲酸为对氨基苯甲酸的衍生物，只在苯环2位的碳上多了一个甲氧基，可用于制备肠胃药甲氧氯普胺。
目前，对氨基苯甲酸及其衍生物2-甲氧基-4-氨基苯甲酸主要依靠化学合成。化学合成常会用到大量的化学试剂，会造成环境污染。为寻找安全和环境友好的药物制备技术，开展本发明的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法。
本发明所述制备方法通过液体发酵培养鸡枞菌，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物。
具体包括如下：
1) 真菌液体发酵：将鸡枞菌Termitomyces albuminosus斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方按重量比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和121 ℃灭菌30 min。采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30 ℃，发酵7-30天；所述菌株为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus )ZYB2016于2016年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016262，地址为武汉大学。
2) 发酵产物处理：液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
3) 天然对氨基苯甲酸及其衍生物的分离纯化：将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分。用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇＝100：0.1-10的溶剂洗脱，得到对氨基苯甲酸及其衍生物。
所述的衍生物包括2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。
本发明采用的天然对氨基苯甲酸及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单安全，且环境友好，容易实现工业化生产。
附图说明
图1所述对氨基苯甲酸的化学结构式。
图2所述2-甲氧基-4-氨基苯甲酸的化学结构式。
具体实施方式
本发明提供的天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其步骤为：
1)液体培养及发酵产物处理：将真菌Termitomyces albuminosus斜面菌种先接种于装有150mL马铃薯液体培养基的三角瓶中活化，活化条件为转速230 r/min，培养温度28℃，培养7天，再进行大批量的液体发酵，采用培养基配方为：每升水中含马铃薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1 Mpa，121 ℃灭菌30 min，置于25－28 ℃，180－230 r/min恒温摇床中培养。发酵15天后，用离心法将菌丝体与发酵液分离。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，所得萃取物用无水硫酸钠脱水，再用旋转蒸发仪于40℃条件下真空浓缩，得到有机粗提物浸膏。
化合物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用30%甲醇水洗脱，用TLC检测具有对氨基苯甲酸的组分并合并，用旋转蒸发仪除去洗脱剂后用甲醇溶解，再进行凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂，收集目标组分，接着进行正相硅胶层析，氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇（100:1）洗脱得到化合物对氨基苯甲酸。
对纯品进行核磁共振和质谱分析鉴定，根据核磁共振波谱数据，对化合物进行结构鉴定，可确定该化合物。
实施例1
用马铃薯葡萄糖培养基（每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，121℃灭菌30min），将活化后的菌株Termitomyces albuminosus液体发酵培养37 L，于28℃摇床培养 15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至1 L，发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用无水硫酸钠脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
将上一步骤中得到的3.1 g有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶(170 g)柱层析，用30%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL /min，每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分别取样进行薄层层析分析合并（展开剂为氯仿：甲醇＝10：1，显色剂为碘、10%硫酸乙醇或碘化铋钾），得到含有目标化合物的组分（186 mg）。
从上一步骤得到的组分(186 mg)，用甲醇溶解，进行凝胶(120g，Sephadex LH-20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到组分(90.2 mg)。
从上一步骤得到的组分(90.2 mg)，用甲醇溶解，再进行反相硅胶(120 g)柱层析，用30%甲醇水洗脱1 L，流速为15 mL /min，每管收集20 mL，每管旋转蒸发仪浓缩后，分管取样进行薄层层析分析合并，得到含有目标化合物的组分（20.1 mg）。
从上一步骤得到的组分(20.1 mg)进行正相硅胶层析（3 g 硅胶），氯仿装柱，干法上样，流动相为氯仿：甲醇（200:1），洗脱体积为750 mL，薄层层析检测合并得到纯化合物（14.8 mg）。
将上一步骤所得的化合物用氘代甲醇溶解，转移到核磁管中，测定核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY），并进行质谱和紫外光谱测定，并确定化合物结构。
从化合物的1H-NMR（δ 6.67，δ 7.88和它们之间的藕合常数J=9.3）和13C-NMR的化学位移值表明化合物中含有对位取代的苯环结构。另据13C-NMR化学位移值（170.3 s,163.5s,133.1 d×2,123.0 s,116.2 d×2）推测其为7个碳。根据高分辨质谱数据m/z：137.0233[M]+，理论计算m/z：137.0477，结合NMR波谱数据推测分子式为C7H7NO2。化合物的紫外最大吸收波长为252 nm (MeOH)。综合这些理化数据，确定化合物的结构为对氨基苯甲酸。
实施例2
用马铃薯葡萄糖培养基（每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，121℃灭菌30min），将活化后的菌株Termitomyces albuminosus液体发酵培养37 L，于28℃摇床培养 15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至1 L，发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用无水硫酸钠脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
将上一步骤中得到的3.1 g有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶(170 g)柱层析，用30%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL/min，每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分管取样进行薄层层析检测合并（展开剂为氯仿：甲醇＝10：1，显色剂为碘、10%硫酸乙醇或碘化铋钾），得到含有目标化合物的组分（281.9 mg）。
从上一步骤得到的组分(281.9 mg)，用甲醇溶解，进行凝胶(120g，Sephadex LH-20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到组分(138.6 mg)。
从上一步骤得到的组分(138.6 mg)，用甲醇溶解，再进行反相硅胶(120 g)柱层析，用30%甲醇水洗脱1 L，流速为15 mL/min，每管收集20 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分管取样进行薄层层析（分析合并，得到含有目标化合物的组分（103.3 mg）。
从上一步骤得到的组分(103.3 mg)进行正相硅胶层析（3.5 g 硅胶），氯仿装柱，干法上样，流动相为氯仿：甲醇（200:1），洗脱体积为1000 mL，薄层层析检测合并，得到纯化合物（83.1 mg）。
将上一步骤所得的化合物用氘代甲醇溶解，转移到核磁管中，测定核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY），并进行质谱和紫外光谱测定，并确定化合物结构。
从化合物的1H-NMR和13C-NMR的波谱数据表明化合物中含有取代的苯环结构（表1）。又根据13C-NMR的化学位移值（123.2 s，152.8 s，113.9 d，148.8 s，116.0 d，125.4 d，170.2 s，56.5 q）推测其含有8个碳。根据高分辨质谱数据m/z：167.0399 [M]+，理论计算值为m/z：167.0582，结合NMR波谱数据推测该化合物的分子式为C8H9NO3。化合物的紫外最大吸收波长为216 nm (MeOH)。综合以上波谱数据，确定化合物的结构为2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。
表1化合物的NMR波谱数据(氘代甲醇,500 M)
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其特征在于：通过液体发酵培养鸡枞菌，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物；
所述方法包括如下步骤：
1) 真菌液体发酵：将鸡枞菌Termitomyces albuminosus斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方按重量百分比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和121 ℃灭菌30 min；采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30 ℃，发酵7-30天；
2) 发酵产物处理：液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
3) 天然对氨基苯甲酸及其衍生物的分离纯化：将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分；用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将含有所述天然对氨基苯甲酸及其衍生物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇＝100：0.1-10的溶剂洗脱，得到对氨基苯甲酸及其衍生物；
所述鸡枞菌为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus )ZYB2016，已于2016年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016262；
所述的衍生物为2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1528118A (zh) * 2003-10-14 2004-09-15 敖宗华 鸡枞大规模液体深层发酵生产工艺

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