CN105998083A - 一种蟾酥的提取方法及蟾酥制品 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种蟾酥的提取方法，其特征在于，提取步骤如下：先将中药蟾酥药材粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过15～25目筛后使用；以乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿‑甲醇溶液溶解，过LH‑20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物，并公开以蟾酥提取物做成复方，还公开了其在制备具有抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞药物中的应用。

Description

一种蟾酥的提取方法及蟾酥制品
技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种蟾酥的提取方法及蟾酥制品。
背景技术
癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，每年都有大量的人死于癌症。抗癌药物的研发一直是药学研究的热点。抗肿瘤药物中有74％是天然产物或其衍生物，如紫杉醇及其衍生物就是目前临床上应用效果比较好的抗肿瘤药物。因此，从天然产物中寻找抗癌化合物或先导化合物具有重要的意义。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种蟾酥的提取方法及蟾酥制品。
技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
一种蟾酥的提取方法，提取步骤如下：先将中药蟾酥药材粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过15～25目筛后使用；以乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物。
所述蟾酥的提取方法，用于浸泡的乙醇浓度为85-95％。
一种蟾酥制品，它所含的活性成分由下列重量份原料配比制备而成：蟾酥提取物1份、止咳草50份、鱼胆草60份、冬葵果55份、下果藤40份、土香薷60份，蟾酥提取物为上述方法制备而得。
上述蟾酥制品，制备方法步骤为：取上述除蟾酥提取物外其他药材合并，加水煎煮两次，合并煎液，浓缩至65℃时相对密度为1.10-1.20，加入乙醇，搅拌，使含醇量按体积百分比计算达65-85％，静置，过滤，滤液减压浓缩至65℃时相对密度为1.20-1.30并回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥，所得颗粒粉碎成干浸膏粉，加入蟾酥提取物和辅料，制成所需制剂。
所述蟾酥制品，制备方法中煎煮条件为：第一次加水量为药材重量的8-12倍量，煎煮1-2h，第二次加水量为药材重量的6-10倍量，煎煮1-2h。
所述蟾酥制品，制备方法中喷雾干燥条件为：进风温度为90-110℃，出风温度为60-90℃，物料温度为60-90℃，雾化压力为0.2-0.5兆帕，喷雾速度为1-10ml/s。
所述蟾酥制品在制备抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞药物中的应用。
蟾酥是蟾蜍表皮腺体的分泌物，白色乳状液体，有毒。干燥后可以入药。
止咳草，拉丁学名Limnophila aromatica(Lam.)Merr.Limnophila gratissima Blume，以全草入药。全年可采，洗净，鲜用或晒干。清肺止咳，解毒消肿。用于感冒，咳嗽，百日咳，毒蛇咬伤，痈疮肿毒。
鱼胆草为龙胆科獐牙菜属植物鱼胆草Swertia davidi Franch.的全草。夏秋采集，鲜用或晒干。清肺热，杀虫。用于湿热黄疸，喉头红肿，恶疮疥癣。
冬葵果为锦葵科植物冬葵Malva verticillata L.的干燥成熟果实。夏、秋二季果实成熟时采收，除去杂质，阴干。清热利尿，消肿。用于尿闭，水肿，口渴；***。
下果藤为鼠李科嘴签属植物大苞嘴签Gouania leptostachya DC.var.tonkinensis Pitard.，以茎、叶入药。全年可采。凉血解毒，舒筋活络。用于肢体麻木；外用治烧烫伤，疮疡。本发明以叶入药。
土香薷为唇形科香薷属植物土香薷Elsholtzia ciliata(Thunb.)Hyland.[E.patrini(Lepech.)Garcke]，以全草入药。夏、秋抽穗开花时采割，去净杂质晒干或鲜用。发汗，解暑，利尿。夏季感冒，发热无汗，中暑，急性胃肠炎，胸闷，口臭，小便不利。其余为药典品种。
有益效果：本发明中止咳草、鱼胆草、冬葵果解毒消肿为君药，下果藤、土香薷凉血解毒为臣药，蟾酥为佐使药，诸药相合，用于抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：取蟾酥药材1kg粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过15目筛后使用；以85％乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物。
实施例2：取蟾酥药材1kg粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过25目筛后使用；以95％乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物。
实施例3：取蟾酥药材1kg粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过20目筛后使用；以90％乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物。
实施例4：取止咳草50g、鱼胆草60g、冬葵果55g、下果藤40g、土香薷60g药材混合，加水煎煮两次，第一次加水为药材重量的8倍量，煎煮1.5h，第二次加水为药材重量的6倍量，煎煮1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(65℃)，加适量乙醇使含醇量(体积分数)达65％，搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.10(65℃)的浸膏，经喷雾干燥(条件为进风温度为100℃，出风温度为80℃，物料温度为70℃，雾化压力为0.2兆帕，喷雾速度为5ml/s。)，粉碎成干浸膏粉，再加入上述实施例1制备的蟾酥提取物2g、糊精50g，用适量80％乙醇润湿，制软材，过14目筛制粒，70℃干燥，60目整粒，得颗粒剂。
实施例5：取止咳草50g、鱼胆草60g、冬葵果55g、下果藤40g、土香薷60g药材混合，加水煎煮两次，第次加水为药材重量的10倍量，煎煮2h，第二次加水为药材重量的8倍量，煎煮1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15(65℃)，加适量乙醇使含醇量(体积分数)达75％，搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.25(65℃)的浸膏，经喷雾干燥(条件为进风温度为120℃，出风温度为90℃，物料温度为80℃，雾化压力为0.3兆帕，喷雾速度为7.5/s。)，粉碎成干浸膏粉，再加入上述实施例1制备的蟾酥提取物2g、淀粉50g，混合均匀，用适量80％乙醇润湿，制软材，过30目筛制粒，于70～80℃干燥，用60目筛整粒，压片，包糖衣，分装，外包装，送检合格，得成品。
实施例6：取止咳草50g、鱼胆草60g、冬葵果55g、下果藤40g、土香薷60g药材混合，加水煎煮两次，第一次加水为药材重量的10倍量，煎煮1.5h，第二次加水为药材重量的8倍量，煎煮1.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15(65℃)，加适量乙醇使含醇量(体积分数)达75％，搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.25(65℃)的浸膏，经喷雾干燥(条件为进风温度为120℃，出风温度为90℃，物料温度为90℃，雾化压力为0.4兆帕，喷雾速度为7.5/s。)，粉碎成干浸膏粉，过6号筛，加入上述实施例1制备的蟾酥提取物2g，再装入1号胶囊即可得成品。
实施例7：抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞增殖的实验研究资料
实验用细胞株：大鼠神经胶质瘤C6细胞，南京医科大学实验动物中心实验室细胞库，DMEM+10％FBS常规培养。
研究药物：按实施例1方法制备。
药液储液：称取100mg本发明，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μl doff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
实验试剂：DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419)；NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin(AMRESCO公司批号：2010/04)；EDTA(AMRESCO公司批号：2009/10)；Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司批号：2010242)；Streptomycin Sulfate(AMRESCO公司批号：2010382)；无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号：080310182)；MTT(Biosharp批号：0793)；PBS(实验室自配)；
实验器材：莱卡倒置显微镜(德国Leica型号：DM1L)；可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号：SPECTRA MAX 190)；CO2培养箱(FORMA型号：3111)；超净台(苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD)；纯水仪(美国Spring公司型号：S/N 020579)；精密移液器(法国吉尔森公司型号：P2)；电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BT323S)；全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号：MLS-3020)；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐(CBS型号：2001)；低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000)；0.2μm滤器(MILLIPORE型号：SLGP033RB)；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
实验方法：1)大鼠神经胶质瘤C6细胞用DMEM+10％FBS于37℃、5％CO2进行常规培养(10cm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml 0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5％CO2)常规培养。3)根据细胞生长情况，一般长至50％-70％，加入本发明溶液，继续培养24h。4)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：
细胞增值抑制率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。实验重复3次。
统计处理：采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。
实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对大鼠肾腺噬铬细胞瘤PC12细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1本发明对大鼠神经胶质瘤C6细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
注：与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001
实验结论：本发明可以抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞增殖，减少大鼠神经胶质瘤C6细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

Claims (7)

1.一种蟾酥的提取方法，其特征在于，提取步骤如下：先将中药蟾酥药材粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过15～25目筛后使用；以乙醇10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次，醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸溶解，抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得蟾酥粗提物，将蟾酥粗提物用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得蟾酥提取物。
2.如权利要求1所述蟾酥的提取方法，其特征在于，用于浸泡的乙醇浓度为85-95％。
3.一种蟾酥制品，其特征在于，它所含的活性成分由下列重量份原料配比制备而成：蟾酥提取物1份、止咳草50份、鱼胆草60份、冬葵果55份、下果藤40份、土香薷60份，蟾酥提取物为上述权利要求1的方法制备而得。
4.如权利要求3所述蟾酥制品，其特征在于，制备方法步骤为：取上述除蟾酥提取物外其他药材合并，加水煎煮两次，合并煎液，浓缩至65℃时相对密度为1.10-1.20，加入乙醇，搅拌，使含醇量按体积百分比计算达65-85％，静置，过滤，滤液减压浓缩至65℃时相对密度为1.20-1.30并回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥，所得颗粒粉碎成干浸膏粉，加入蟾酥提取物和辅料，制成所需制剂。
5.如权利要求4所述蟾酥制品，其特征在于，制备方法中煎煮条件为：第一次加水量为药材重量的8-12倍量，煎煮1-2h，第二次加水量为药材重量的6-10倍量，煎煮1-2h。
6.如权利要求4所述蟾酥制品，其特征在于，制备方法中喷雾干燥条件为：进风温度为90-110℃，出风温度为60-90℃，物料温度为60-90℃，雾化压力为0.2-0.5兆帕，喷雾速度为1-10ml/s。
7.如权利要求3所述蟾酥制品在抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞药物中的应用。
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