CN105980398A - OspA的突变片段以及其相关方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗疏螺旋体感染的组合物和方法。具体地说，本发明涉及包含外表面蛋白A(OspA)的杂合C‑末端片段的多肽、编码所述多肽的核酸、特异性结合所述多肽的抗体、包含所述多肽和/或所述核酸和/或所述抗体的药物组合物(具体地适于用作药剂或者用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法中)、治疗或预防疏螺旋体感染的方法以及免疫受试者的方法。

Description

OspA的突变片段以及其相关方法和用途
发明领域
本发明涉及用于预防和治疗疏螺旋体(Borrelia)感染的组合物和方法。具体地说，本发明涉及一种包含外表面蛋白A(OspA)的杂合C-末端片段的多肽、一种编码所述多肽的核酸、一种特异性结合所述多肽的抗体、一种包含所述多肽和/或所述核酸和/或所述抗体的药物组合物(具体地适于用作药剂或用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法中)、一种治疗或预防疏螺旋体感染的方法以及一种免疫受试者的方法。
发明背景
在欧洲和北美，莱姆疏螺旋体病或莱姆病是最常报道的蜱传疾病。所述疾病是由感染虫媒传播的革兰氏阴性样螺旋体广义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi s.l.)引起，并且可涉及多种器官或组织，导致皮肤、心脏、肌肉骨骼和神经学病症。在大多数国家，莱姆疏螺旋体病不是应具报疾病；因此没有关于年发病率的准确数据可用。在美国，致病物为狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi s.s.)并且莱姆疏螺旋体病定位于东北部、大西洋中部和中北上部各州。在2010年，美国疾病控制与预防中心(CDC)报道了总计约30,000例莱姆疏螺旋体病。CDC在2013年更新的报告，将其他来源的诊断数据考虑在内，从而估计在美国每年新病例的实际数量更接近300,000(http：//www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.ht ml)。在欧洲，阿氏疏螺旋体(B.afzelii)和伽氏疏螺旋体(B.garinii)为莱姆疏螺旋体病的主要致病物，而且狭义伯氏疏螺旋体和巴伐利亚疏螺旋体(B.bavariensis)根据地理位置在较低程度上促成莱姆疏螺旋体病。莱姆疏螺旋体病的患病率在不同欧洲国家变化相当大，并且从西到东患病率总体逐渐增加。在多数欧洲国家，报道的莱姆疏螺旋体病病例数目自20世纪90年代早期开始逐渐增加(例如，捷克共和国、爱沙尼亚、立陶宛；参见Lyme borreliosis in Europe，2006年WHO报道)，并且病例的地理分布也有所扩大。
疏螺旋体属于螺旋体科家族，所述螺旋体科家族细分为医学上重要的密螺旋体(Treponema)属、钩端螺旋体(Leptospira)属和疏螺旋体属。广义伯氏疏螺旋体为约10-20μm长和0.2-0.5μm宽的螺旋状、运动活泼的革兰氏阴性菌，它在微量需氧的条件下生长。螺旋体细胞壁由细胞质膜组成，所述细胞质膜由肽聚糖和若干鞭毛围绕并且接着由松散结合的外膜围绕。
莱姆疏螺旋体病通常分阶段地发生，各阶段的特征为出现缓解和恶化的不同临床表现。阶段1，早期感染，由皮肤的局部感染组成；数天或数周后为阶段2，播散性感染；数月至数年后为阶段3，持续性感染。然而，感染为可变的；一些患者仅患有局部皮肤感染，而其他患者仅显示疾病后期表现，如关节炎。莱姆疏螺旋体病的不同临床症状也是由不同的广义伯氏疏螺旋物种感染引起。狭义伯氏疏螺旋体更经常地引起关节表现(关节炎)和心脏问题，阿氏疏螺旋体主要引起皮肤症状(游走性红斑EM和慢性萎缩性肢皮炎ACA)，而伽氏疏螺旋体牵涉大部分莱姆神经疏螺旋体病病例。
局部感染-感染的阶段1的最常见症状为游走性红斑，这出现于70％-80％的受感染人群中。这种皮肤损害之后通常为流感样症状，如肌痛、关节痛、头疼和发热。这些非特异性症状出现于50％的患有游走性红斑的患者中。
播散性感染-在阶段2期间，细菌从感染部位移动到血流中，到达远端组织和器官。在此阶段出现的神经学、心血管和关节炎症状包括脑膜炎、颅神经病变和间歇性发炎性关节炎。
持续性感染-感染的阶段3为慢性的并且发生于蜱叮咬之后数月至数年间。在北美最常见的症状为由狭义伯氏疏螺旋体感染所引起的风湿性关节炎。伽氏疏螺旋体引起的中枢神经***的持续性感染在阶段3期间导致更严重的神经学症状，并且阿氏疏螺旋体引起的皮肤的持续性感染导致慢性萎缩性肢皮炎。
在一些危险群体如农民、林业工人、徒步旅行者、跑步者或度假者中，正如在15岁以下的儿童和39岁与59岁之间的成人中一样，血清阳性率和疾病发病率增加，其中没有性别偏好。莱姆疏螺旋体病的这种增加的发病率与森林栖息地以及社会因素的改变有关。环境改变如森林片断化已导致啮齿动物捕食者如狐狸和猛禽类急剧减少，这进而导致老鼠数量增加，之后导致蜱数量增加。最近，不均衡的重新造林已增加鹿的数量并因此增加蜱的数量。郊区扩张和用于娱乐如露营和徒步旅行的林地区域使用的增加使人们与更大数目的疏螺旋体属蜱载体更深入地接触。所有这些因素共同导致疏螺旋体的更广泛分布和莱姆疏螺旋体病的更高发病率。
抗微生物剂为治疗疏螺旋体感染的基本方法。所使用的抗生素取决于疾病的阶段、症状和患者对药物的过敏性。抗生素疗程的长度也取决于疾病的阶段和症状的严重性。早期莱姆疏螺旋体病通常用口服四环素如多西环素和半合成青霉素如阿莫西林或青霉素V来治疗。关节炎和神经学病症用高剂量静脉内青霉素G或头孢曲松治疗。高至30％的莱姆疏螺旋体病患者不展示疏螺旋体感染的早期特征症状，这使得诊断和治疗均成问题。抗生素疗程可为较长的(长至数月)并且有时为无效的，并且因此在疏螺旋体领域，特别是在晚期疾病期间很有争议。即使在有效治疗疏螺旋体的情况下，患者也可在数年过后患有衰弱疲劳、疼痛或神经症状，这些称为治疗后莱姆病症状。通常，抗生素的使用可产生不希望的后果，如靶微生物发展出抗性。最终，抗生素疗法可有效地治愈莱姆疏螺旋体病，但没有对之后的感染提供保护。
单价血清型1-OspA-基疫苗(LYMErixTM)在美国得到批准并且在市场上销售，用于预防由狭义伯氏疏螺旋体引起的莱姆病，但所述疫苗是不再可用。此外，在欧洲和其他地方的不同血清型中的OspA序列的异质性妨碍了利用来自仅一种血清型的基于OspA的疫苗进行有效保护。
包含来自一种OspA血清型的近端部分连同来自另一种OspA血清型的远端部分的嵌合OspA分子在保留这两种亲本多肽的抗原特征的同时，可用于预防和治疗莱姆病或莱姆疏螺旋体病(WO2011/143617，WO2011/143623)。
目前，在市场上没有用于莱姆疏螺旋体病的预防性药剂，并且因此在本领域中需要开发可提供针对存在于美国、欧洲和其他地方的疏螺旋体的有效保护的这种药剂，特别是需要开发可提供同时针对若干种疏螺旋体血清型的有效保护的药剂。本发明的含血清型3OspA异二聚体Lip-S4D1-S3hybD1在便于生产和刺激特异性抗体这两方面改进了我们先前公开的异二聚体Lip-S4D1-S3D1(参见WO2014/006226)，如通过与血清型3疏螺旋体属螺旋体结合的抗体表面所测量的。另外，与先前公开的异二聚体相比，对新异二聚体的免疫反应的更具特异性的特性表明所述效力也更优秀。
发明概述
本发明涉及一种包含疏螺旋体外表面蛋白A(OspA)的杂合片段的多肽、一种编码所述多肽的核酸、一种包含此类核酸分子的载体以及一种包含此类载体的宿主细胞。此外，本发明提供一种用于产生此类多肽的方法和一种用于产生表达此类多肽的细胞的方法。另外，本发明提供特异性结合此类多肽的抗体；产生此类抗体的杂交瘤细胞；用于产生此类抗体的方法；包含此类多肽、核酸分子、载体或抗体的药物组合物；此类多肽、核酸分子、载体或抗体用于制备药剂或药物组合物(具体地用作疫苗或用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法)的用途；用于诊断感染的方法和用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法以及免疫受试者的方法。具体地说，本发明涉及一种用于抗血清型3疏螺旋体免疫的改进的多肽，当与在我们先前申请WO2014/006226中所公开的含血清型3OspA构建体相比时，所述多肽更有利于纯化并且诱导对疏螺旋体更具特异性的免疫反应，如通过与疏螺旋体结合的表面所评估的。
开发用于预防莱姆疏螺旋体病的亚单位疫苗的努力大部分集中于使用疏螺旋体外表面蛋白A(OspA)作为抗原。OspA蛋白仅在处于蜱载体肠内时由疏螺旋体表达。因此，通过疫苗接种产生的OspA抗体在体内不会对抗感染，而是在蜱摄食血液时进入其肠内。在肠内，抗体中和螺旋体并且阻断细菌从蜱的中肠迁移到唾液腺，即阻断疏螺旋体进入脊椎动物宿主所通过的路线。因此，OspA-特异性抗体防止疏螺旋体从蜱载体传递到人宿主中。
来自狭义伯氏疏螺旋体菌株ZS7的脂化形式的OspA与氢氧化铝一起被SmithKlineBeecham(现在为GlaxoSmithKline(GSK))商业开发为针对疏螺旋体的疫苗(LYMErixTM)用于美国市场。在一年时间段内需要三个剂量的LYMErixTM以用于最佳保护。在前两个剂量之后，针对莱姆疏螺旋体病的疫苗效力为49％，并且在第三个剂量之后为76％。然而，在LYMErixTM商业可用之后不久，它就在2002年退出了市场。引用的原因为疫苗实际应用的问题，例如需要每年或每隔一年加强注射，以及这种预防方法与早期感染的抗生素治疗相比成本相对较高。此外，一个问题在于LYMErixTM可由于与人蛋白的序列同源性而在群体亚组中引发自体免疫反应，尽管这并未得到证明。此外，这种疫苗并未提供针对临床上重要的疏螺旋体物种的交叉保护。
因此，在一个实施方案中，本发明的目标在于提供一种例如用于预防莱姆疏螺旋体病的改进的疫苗。优选地，所述疫苗为容易生产的同时为保护性的、安全的且比现有疗法更有效的和/或提供针对多于一种疏螺旋体物种的保护。另外，本领域已知的是不同患者对于不同疫苗组合物的响应不同。因此，在任何情况下，使得替代疫苗可用作针对疏螺旋体的疫苗接种的额外选项将具有显著的优势。
本发明的根本问题通过包含杂合C-末端OspA片段的多肽得以解决，其中所述杂合片段由疏螺旋体OspA蛋白的C-末端结构域组成，所述杂合片段包括源于不同于伽氏疏螺旋体菌株PBr的疏螺旋体菌株OspA蛋白的片段和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA的第二片段，并且与对应的野生型序列的不同之处至少在于至少一个二硫键的引入。
意外的是，所述杂合C-末端OspA片段包含来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116、与来自血清型3OspA(伽氏疏螺旋体菌株PBr)的序列融合、具有引入的二硫键的序列，引入所述片段产生一种比我们先前发明的异二聚体Lip-S4D1-S3D1(WO2014/006226)更容易纯化并且刺激对血清型3OspA更具特异性的免疫反应的异二聚体蛋白(Lip-S4D1-S3hybD1)。如实施例所示出的，本发明的血清型3杂合OspA C-末端片段具有预测的静电势等量线，其更类似于来自血清型的其他OspA片段其他而不是血清型3OspA片段。此外，含血清型3杂合OspA C-末端片段的异二聚体(Lip-S4D1-S3hybD1)比先前发明的Lip-S4D1-S3D1异二聚体更容易纯化，需要更少的步骤来获得高很多的产率。另外，虽然观察到的抗体效价是类似的，但与先前发明的异二聚体组合疫苗相比，由改进的异二聚体组合疫苗刺激的抗体更加特异性结合疏螺旋体表达的血清型3OspA。最后，改进的异二聚体组合疫苗针对测试的四种疏螺旋体血清型的体内保护能力较高。
发明详述
因此，在第一方面，本发明涉及一种包含外表面蛋白A(OspA)的杂合C-末端片段的多肽，其中所述杂合C-末端OspA片段由疏螺旋体菌株的两个不同OspA的C-末端结构域融合物组成并且与对应的野生型片段不同之处至少在于至少一个二硫键(例如，胱氨酸)的引入。具体地说，杂合C-末端OspA片段由来自不同于伽氏疏螺旋体菌株PBr的菌株(例如，法雷斯疏螺旋体菌株VS116或斯柏曼疏螺旋体)的OspA蛋白的氨基酸；与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA蛋白(其中引入至少一个二硫键(胱氨酸))的氨基酸的融合物组成。确切地说，所述多肽包含杂合C-末端OspA(疏螺旋体的外表面蛋白A)片段，其中所述杂合C-末端OspA片段从N-末端至C-末端方向由以下各项组成：i)第一OspA部分，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125-176或氨基酸126-175组成，它不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段，以及ii)第二OspA部分，其由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ IDNO：8)的氨基酸177-274或氨基酸176-274(但最优选氨基酸177-274)组成，其中所述第二OspA部分是突变的并且是胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中在所述第二OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且其中氨基酸和半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。
可选地，所述多肽包含杂合C-末端OspA片段，其中所述杂合C-末端OspA片段从N-末端至C-末端方向由以下各项组成
i)第一OspA片段(也称为第一OspA部分)，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125-176或氨基酸126-175(不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段)组成，以及
ii)第二OspA片段(也称为第二OspA部分)，其由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ ID NO：8)的氨基酸177-274组成，其中所述第二OspA片段与对应的野生型序列的不同之处在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及取代在SEQID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中在所述第二OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且
其中半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ IDNO：5)的对应氨基酸的编号。
已发现，可容易并有效地产生根据本发明的多肽(参见实施例2)。与已知产品相比，所述多肽的产生导致产率增加(参见实施例2)。用根据本发明的多肽进行免疫产生更高水平特异于OspA蛋白的处于其天然形式的抗体，并且因此是一种改进的疫苗(参见实施例3)。另外，所述多肽提供针对体内疏螺旋体攻击的保护(参见实施例4)。
疏螺旋体是螺旋菌门的细菌属。它导致疏螺旋体病，这是一种主要通过蜱传播并且一些通过虱子传播(取决于物种)的动物性媒介传染病。目前有36种已知的疏螺旋体物种。在36种已知疏螺旋体物种中，已知这些物种至的13种会引起莱姆病或疏螺旋体病并且通过蜱传播。引起莱姆病的主要疏螺旋体物种是伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体。术语广义伯氏疏螺旋体涵盖至少13种疏螺旋体物种(表A-1)。这些物种出现于不同的地理区域，并且以涉及蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)复合物(也称为全沟硬蜱(Ixodespersulcatus)复合物)的蜱的地方性动物病周期生活在自然界中并且生活在广泛范围的动物宿主中。四种疏螺旋体物种为大部分人体感染的原因：狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体。三种其他物种卢西塔尼亚疏螺旋体(B.lusitaniae)、比塞蒂疏螺旋体(B.bissettii)和斯柏曼疏螺旋体(B.spielmanii)偶尔在人体中检测到，但是它们在莱姆疏螺旋体病中的作用目前还不确定。仍在鉴别新的疏螺旋体物种。
表A-1.
如以上详述的，疏螺旋体外表面蛋白A(OspA)由于其作为疫苗候选物的可能性而成为特别引人关注的丰富的疏螺旋体免疫原性脂蛋白。广义伯氏疏螺旋体的OspA为具有约30kDa的分子量的并且在线性质粒上编码的碱性脂蛋白。OspA蛋白的一个重要方面为其N-末端脂化；即，具有C14与C19之间的链长度的具有或没有双键的脂肪酸连接至N-末端半胱氨酸残基(增强OspA蛋白的免疫原性的特征)。已显示免疫原性差的合成肽在脂化时诱导较强的抗体反应；例如，在共价连接至Pam3Cys(Bessler和Jung，Research Immunology(1992)143：548-552)时，在通过信号序列指定的脂质连接合成的许多细菌脂蛋白的氨基端处发现脂肪酸取代。另外，显示Pam3Cys部分在小鼠中部分凭借其与TLR-2/1的相互作用而增强对OspA的免疫反应(Yoder等(2003)Infection and Immunity 71：3894-3900)。因此，将预期OspA C-末端片段的脂化增强所述片段的免疫原性和保护能力。
对在美国北部和欧洲获得的广义伯氏疏螺旋体的分离株的分析已揭示，OspA具有抗原性变异并且可基于血清学定义若干种不同的组。已报道了结合特异性N-末端和C-末端抗原决定簇的抗-OspA mAb。X-射线结晶学和NMR分析已用于鉴别OspA中的免疫学上重要的超变结构域并且已绘出C-末端氨基酸203-257的LA-2表位(Ding等，Mol.Biol.302：1153-64，2000)。先前的研究已显示在用OspA接种之后针对C-末端表位LA-2的抗体的产生与保护性免疫力相关联(Van Hoecke等Vaccine(1996)14(17-18)：1620-6和Steere等，N Engl JMed(1998)339：209-215)。针对LA-2的抗体显示阻断疏螺旋体从蜱传递到宿主(Golde等，Infect Immun(1997)65(3)：882-889)。这些研究表明OspA蛋白的C-末端部分可足以用于诱导保护性免疫力。应注意，OspA的C-末端部分的序列在疏螺旋体血清型之间的高保守性低于N-末端部分的高保守性(参见图1)。
基于来自以上所列出的研究连同其他研究的信息，在先前的发明(WO2014/006226)中使用包含C-末端部分的截短形式的OspA(在本文中也称为“OspA片段”或“单体”)。已证明所述截短形式的OspA具有比全长OspA蛋白更低的保护性。然而，意外的是，在先前的发明过程中发现在截短形式中引入二硫键(在本文中也称为“突变OspA片段”、“胱氨酸稳定的OspA片段”或“突变片段”或“胱氨酸稳定的片段”)克服了这个缺点。虽然不限于特定机制，但是认为提高的保护性是由于增加的OspA片段稳定性，如在测量热稳定性的测定中所示的。
根据先前的发明，突变OspA片段(在本发明中也称为第二OspA片段)可源于任何疏螺旋体物种；然而，由于它们在医学领域(特别是对于人)的流行性，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体以及伽氏疏螺旋体。根据本发明，第一OspA部分是来自除伽氏疏螺旋体菌株PBr之外的任何疏螺旋体菌株，而第二部分是来自伽氏疏螺旋体菌株PBr。因此，杂合OspA片段源于来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA的氨基酸与来自除伽氏疏螺旋体菌株PBr之外的任何疏螺旋体物种，具体是来自狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和巴伐利亚疏螺旋体，特别是法雷斯疏螺旋体菌株VS116的OspA的氨基酸(并且因此，为不同于来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA的氨基酸的氨基酸序列)的融合物。第一OspA部分由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125-176或氨基酸126-175(不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段)组成，并且第二OspA部分由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ ID NO：8)的氨基酸176-274或最优选氨基酸177-274组成，其中所述第二OspA部分是突变的并且是胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ IDNO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中在所述第二OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且其中氨基酸和半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。然而，相对于野生型部分的进一步突变可存在于根据本发明的第一部分和第二部分(也参见下文)。在一个优选实施方案中，用半胱氨酸在位置182处和位置269处进行以上取代是相对于野生型的仅有突变。可选地，来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274与其不同之处在于伽氏疏螺旋体菌株PBr野生型OspA的氨基酸233的苏氨酸残基仅用脯氨酸残基取代。
多肽的优选实例包括
-杂合C-末端OspA片段，其由来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：1)，或者
-杂合C-末端OspA片段，其由来自斯柏曼疏螺旋体的氨基酸126-175和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：51)。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或者由其组成。可选地，所述多肽包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列或者由其组成。
在本发明的一个实施方案中，第二OspA部分与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274相同，但与其不同之处在于伽氏疏螺旋体菌株PBr的野生型OspA的氨基酸233的苏氨酸残基用脯氨酸残基取代(SEQ ID NO：7)。
这四种疏螺旋体物种狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体以及伽氏疏螺旋体可根据其OspA血清型进一步分类，它们的OspA血清型已通过使用对相应OspA蛋白特异的单克隆抗体进行分析得以确定。导致大部分人疏螺旋体感染的血清型1-7连同其患病率示出在以下表A-2中。
表A-2.狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体以及伽氏疏螺旋体的血清型指示和患病率。从人脑脊液或皮肤中或从蜱载体中分离的疏螺旋体通过用小鼠单克隆抗体探测全细胞裂解物来按血清型分类，所述单克隆抗体各自对OspA的特定表位特异(如由Wilske等，J.of Clin Microbiol(1993)31(2)：340-350所述的并且由BaxterBioscience在“Climate change effect on ticks and tick-borne diseases”，Brussels，2009年2月06中提供的)。
通过Li等(Proc Natl Acad Sci(1997)94：3584-3589)确定来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspA蛋白的结构。它由N-末端(α-链1至4)和中心β-折叠(α-链5至14n[N-末端部分])、圆筒折叠1(α-链14c[C-末端部分]至16)、圆筒折叠2(α-链17至21)以及C-末端α-螺旋组成。如贯穿本说明书使用的关于OspA的术语“C-末端OspA片段”或“OspA C-末端结构域”或“C-末端结构域”或“野生型片段”或“C-末端部分”应意指OspA的C-末端氨基酸序列，即OspA缺乏至少N-末端β-折叠(包括α-链1至4)。在来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspA中，N-末端折叠由氨基酸17至70组成(在16个氨基酸长的脂化信号肽翻译后裂解之后)。
本发明的C-末端OspA片段还可包括N-末端的脂化信号序列，例如来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspA(SEQ ID NO：13)或OspB(SEQ ID NO：14)的氨基酸1至16的脂化信号序列、来自大肠杆菌的脂化信号序列(在本文中称为“lpp脂化信号”(SEQ ID NO：15))或例如如以下所定义的任何其他信号序列。
具有N-末端脂化信号序列(例如在初生OspA多肽上存在的那些)的蛋白质的脂化在大肠杆菌表达载体中分别通过酶二酰甘油转移酶、信号肽酶II和转酰酶的逐步作用来发生。第一步为将二酰甘油转移至未修饰的前脂蛋白的半胱氨酸巯基、然后通过信号肽酶II裂解信号肽并且最后使前脂蛋白的N-末端半胱氨酸的-氨基酰化。结果为一个脂质和具有连接的两个另外的脂质的甘油基在多肽N-末端半胱氨酸残基上的布置。在脂化期间裂解的脂化信号序列不存在于最终的多肽序列中。
多肽是通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的链的生物分子。当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成共价化学键。本发明的多肽是连续和无支链的氨基酸链。本发明的多肽包含胱氨酸键。根据本发明，突变OspA片段可为脂化的蛋白质，也称脂蛋白，其中脂质部分连同甘油基也称为“Lip”。根据本发明，Lip包含连接至本发明的多肽的甘油和N末端半胱氨酸的氨基的一个至三个脂质，诸如C14-20烷基和/或C14-20烯基，或者优选地其中Lip为以下式(I)的一部分，
其中R1、R2或R3中的一个为C14-C20烷基或烯基，并且其他每一个独立地为C14-C20烷基或C14-C20烯基，并且X为连接至式(I)所示的半胱氨酸残基的氨基酸序列。更优选地，Lip加上多肽的N-末端半胱氨酸为N-棕榈酰基-S-(2RS)-2，3-双-(棕榈酰氧基)丙基半胱氨酸(在本文中称为“Pam3Cys”)并且通过半胱氨酸的羧基C连接至本发明的所述氨基酸序列。在以上式(I)中，R1、R2和R3可为棕榈酰基部分并且X为连接至半胱氨酸残基的氨基酸序列。
根据本发明，OspA的C-末端结构域可缺乏至少与来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspA的氨基酸17至70同源的N-末端结构域。另外，根据本发明的OspA C-末端结构域还可缺乏如Li及其同事(Li等，同上)所定义的另外的中央折叠部分，具体为另外的链，如来自任何疏螺旋体(具体为狭义伯氏疏螺旋体菌株B31)的氨基酸17至82、93、105、118或119，优选17至129，更优选1至124、1至125、1至129或1至130的氨基酸部分，或者来自除狭义伯氏疏螺旋体菌株B31之外的疏螺旋体某种的OspA蛋白的同源部分。
在本发明的背景下，OspA C-末端结构域也被称为“OspA片段”或“OspA的片段”。
在本发明的多肽背景下并且如贯穿本说明书所使用的，“突变C-末端OspA片段”或“突变片段”或“突变OspA片段”应意指如以上和本文所定义的OspA C-末端片段，它与野生型片段的不同之处至少在于可形成二硫键(即胱氨酸)的至少两个引入的半胱氨酸。在不受该理论约束的情况下，假定二硫键稳定在有利于抗体结合诱导的构造中的片段。OspA的野生型C-末端片段的折叠显示与全长蛋白相比有所减小的温度稳定性(Koide等，Structure-based Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA，J.Mol.Biol.(2005)350：290-299)。对于本发明，狭义伯氏疏螺旋体菌株B31OspA的C-末端结构域的序列已在计算机上进行分析，以确定用于可增强此C-末端结构域折叠的稳定性的引入的双硫桥的位置。分析的结果已抽调给其他疏螺旋体物种的同源OspA片段，假定折叠在各物种之间为保守的。
在本发明的多肽背景下并且如贯穿本说明书所使用的，“杂合C-末端OspA片段”或“杂合片段”或“杂合OspA片段”应意指如以上和本文所定义的OspA C-末端片段，它与野生型片段的不同之处在于以下
a)杂合C-末端OspA片段由来自不同于伽氏疏螺旋体菌株PBr的菌株(例如，法雷斯疏螺旋体菌株VS116或斯柏曼疏螺旋体)的第一OspA蛋白的氨基酸(称为第一OspA部分)；与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的第二OspA蛋白的氨基酸的融合物组成，在后者中引入至少一个二硫键(胱氨酸)(称为第二OspA部分)并存在任选的一个或多个进一步突变；以及
b)杂合C-末端OspA片段中的至少两个引入的半胱氨酸形成二硫键(即胱氨酸)，并且其中所述引入的半胱氨酸如本文所述且根据WO2014/006226的教义被引入；并且
其中杂合C-末端OspA片段产生天然折叠片段，如例如通过在例如小鼠中疫苗接种这种杂合C-末端OspA片段所得到的抗体与疏螺旋体血清型3抗原的结合效率所测量的，例如，通过经由流式细胞术(例如，如实施例中所述)来测试所述抗体(在三次免疫接种后获得)与血清型3疏螺旋体表面的结合。
通常，二硫键可通过引入一个或多个(优选两个)半胱氨酸残基来引入，其中二硫键(S-S桥)在形成氨基酸胱氨酸的两个半胱氨酸残基的硫醇基之间形成。如果二硫键是与存在于野生型OspA片段中的半胱氨酸形成的，则仅需要引入一个半胱氨酸残基。通过氨基酸取代引入所述两个半胱氨酸。取代为a)通过半胱氨酸在相关野生型OspA氨基酸序列的氨基酸位置182处的取代和b)通过半胱氨酸在相关野生型OspA氨基酸序列的氨基酸位置269处的取代，并且其中在所述OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键，从而因此形成胱氨酸。半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。
突变或杂合OspA片段还可包含相对于野生型的另外的突变。如以上详述的，OspA的结构和表面结构域为本领域已知的。因此，突变片段可包含另外的突变，具体为处于不在蛋白质表面上的位点和/或不涉及在免疫反应中并且因此不影响抗原能力的突变。这些突变可包括一个或多个氨基酸缺失(具体为小的(例如，多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸)缺失)、一个或多个氨基酸添加(具体为在C-末端或N-末端处)、一个或多个氨基酸取代(具体为一个或多个保守性氨基酸取代)。优选地，第一部分和第二部分中相对于相应野生型的另外的突变的数目为至多10、9、8、7、6、5、4，更优选3或2，特别是1个。更优选地，另外的突变仅在第二OspA部分中。优选的突变是取代，特别是保守性取代。保守性氨基酸取代的实例包括但不限于以下所列出的那些：
优选的突变包括在选择的片段部分中的改变，例如，其中与存在于狭义伯氏疏螺旋体中的人白细胞功能相关抗原(hLFA-1)具有序列相似性的序列被修饰例如被来自另一种疏螺旋体物种的OspA蛋白的同源性序列置换。此修饰的基本原理为减小诱导与人蛋白的免疫交叉反应的危险。另一种优选的突变是脯氨酸取代来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA多肽序列(SEQ ID NO：8)的位置233处的苏氨酸。也可能在最终片段或中间片段中添加用于脂化的信号序列，或添加标志蛋白(例如，用于鉴别或纯化)。
在一些实施方案中，突变或杂合OspA片段的氨基酸序列与野生型片段具有60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述序列由于序列添加、缺失或取代而为至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、5％、4％、3％、2％、最优选至多1％不同。
如本领域已知的并且如本文所用的，同一性为两个或更多个多肽序列之间的关系，如通过比较所述序列所确定的。在本领域中，同一性还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过此类序列串之间的匹配所确定的。可容易计算同一性。虽然存在测量两个多核苷酸或两个多肽序列之间的多种方法，所述术语为技术人员所熟知的(例如，Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987)。设计确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。在计算机程序中编码确定同一性的方法。确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul，S.等，1990)。
与突变或杂合OspA片段相比，在本发明的背景下，“野生型片段”或“野生型OspA片段”涉及一种天然存在的疏螺旋体OspA的片段。野生型片段通过N-末端缺失来获得，但是它不包含内部缺失(除如本文详述的信号序列之外)或突变。相对于杂合和突变OspA片段，野生型片段由OspA的相同部分(OspA的相同长度和相同链等)组成并且仅仅是上述改变不同。
本发明的多肽
多肽为通过肽键，在一些情况下也通过二硫键连接的氨基酸的单一线性聚合物。根据本发明，所述多肽也可包含一个或多个翻译后修饰；即连接的生物化学官能团，如连接的乙酸酯、磷酸酯、脂质或碳水化合物，优选为连接至连同甘油的N末端半胱氨酸的一种或多种脂质，更优选为1至3个C14-C20烷基或烯基部分，甚至更优选为1至3个棕榈酰基，最优选为三个棕榈酰基(Pam3)。
本发明的多肽是如上所定义的并且包含杂合C-末端OspA片段或者由其组成，其中所述杂合C-末端OspA片段从N-末端至C-末端方向由以下各项组成
i)第一OspA部分，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的第一C-末端部分的氨基酸(不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段)组成，并且在125或126左右的位置开始且在位置175或176处终止；以及
ii)第二OspA部分，其由连续跟随着第一C-末端部分的OspA的第二C-末端部分组成(例如，如果第一C-末端部分在位置175处终止，则第二C-末端部分在位置176处继续；或如果第一C-末端部分在位置176处终止，则第二C-末端部分在位置177处继续等等，然而也可能在2C-末端部分的融合区域中缺失一个或两个或更多个多至10个氨基酸，例如并且最优选地，如果第一C-末端部分在位置175处终止，则第二C-末端部分在位置177处继续)，其中所述第二OspA片段与对应的野生型序列的不同之处在于通过半胱氨酸取代在SEQ IDNO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中在所述第二OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键从而形成半胱氨酸(也称为“胱氨酸稳定的OspA片段”)；并且
其中氨基酸和半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。
在本发明的另一个实施方案中，多肽包含杂合C-末端OspA片段或者由其组成，所述杂合C-末端OspA片段由来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：1)。
在本发明的另一个实施方案中，多肽包含杂合C-末端OspA片段或者由其组成，所述杂合C-末端OspA片段由来自斯柏曼疏螺旋体的氨基酸126-175和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：51)。
在本发明的另一个实施方案中，多肽是如本文所定义的，并且其中第二OspA部分与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274相同，但与其不同之处仅在于伽氏疏螺旋体菌株PBr野生型OspA的氨基酸233处的苏氨酸残基用脯氨酸残基取代。
如以上所定义并且另外如本文所定义的本发明的多肽提供免疫动物的抗体效价，其中当与相关的现有技术多肽(例如，如在WO2014/006226中所定义的)相比时，所述抗体显示改进的与相应抗原的原位结合。优选地，与对包含疏螺旋体OspA蛋白(更优选如通过SEQID NO：31定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白)的C-末端结构域(与对应的野生型OspA序列的不同之处在于至少添加至少一个半胱氨酸键)的多肽产生的抗体引起的荧光强度相比，包含本发明的杂合C-末端OspA片段的多肽实现荧光强度的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述荧光强度通过流式细胞术测量并且通过在小鼠中用所述多肽免疫三次后产生的抗体经由与血清型3疏螺旋体的表面结合来引起，具体地其中所述增加可如实施例3中所述地测定。
此外，在本发明的另一个实施方案中，当与相关的现有技术多肽(例如，如在WO2014/006226中所定义的)相比时，如以上和本文所定义的本发明的多肽可以标准过程产生更高产率并且需要更少的纯化步骤。优选地，与包含疏螺旋体OspA蛋白(更优选如通过SEQ ID NO：31定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白)的C-末端结构域(与对应的野生型OspA序列的不同之处在于至少添加至少一个半胱氨酸键)的多肽相比，包含本发明的杂合C-末端OspA片段的多肽显示产率的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述产率以毫克/克生物量测量，具体地其中所述增加可如实施例2所述地测定。
优选地，与包含疏螺旋体OspA蛋白(更优选如通过SEQ ID NO：31定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白)的C-末端结构域(与对应的野生型OspA序列的不同之处在于至少添加至少一个半胱氨酸键)的多肽相比，包含本发明的杂合C-末端OspA片段的多肽需要更少纯化步骤；更确切地说，少需要至少一个色谱步骤。
在本发明的另一个实施方案中，多肽包含a)如以上和本文所定义的杂合C-末端OspA片段和b)突变OspA片段。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的多肽包含a)如本文所定义的杂合C-末端OspA片段和b)第二OspA片段，其中所述OspA片段是C-末端OspA片段，其中它由疏螺旋体的OspA蛋白的C-末端结构域组成并且是突变的和胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型OspA序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代野生型序列位置182处的氨基酸以及通过半胱氨酸取代野生型序列位置269处的氨基酸，并且其中在所述OspA片段的位于位置182处的半胱氨酸与位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且此外其中所述突变OspA片段在位置123、124或125处开始且在位置273或274处终止；并且此外其中氨基酸和半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。在本发明的一个实施方案中，第二OspA片段可为如以上所定义的OspA的任何突变C-末端片段，例如在先前发明(WO2014/006226)的背景下。
根据本发明，本发明的所述突变OspA片段和杂合片段不包含(i)如以上所定义的N-末端折叠和(ii)任选的如以上所定义的一个或多个另外的中央折叠链。然而，所述多肽可包含一个或多个功能序列，如信号序列，例如脂化信号序列或翻译后修饰如脂化。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的多肽由以下各项组成：(i)任选地通过例如如以下所定义的接头连接的一个或多个突变OspA片段(其中至少一个是根据本发明的杂合C-末端OspA片段)或一个或多个突变OspA片段和血清型3杂合OspA C-末端片段；和(ii)任选的与OspA异源的一个或多个氨基酸，具体为信号序列；以及(iii)任选的翻译后修饰如脂化。
因此，在本发明的另一个实施方案中，如以上和本文所定义的本发明的多肽可另外地包含：
i)脂化的多肽或其中多肽包含脂化信号(优选大肠杆菌来源的lpp脂化信号MKATKLVLGAVILGSTLLAG(SEQ ID NO：15))的多肽；和/或
ii)包含脂化位点肽的多肽，所述含脂化位点肽前面是作为脂化位点的N-末端半胱氨酸残基，优选CSS；和/或
iii)在杂合C-末端OspA片段与第二半胱氨酸稳定的OspA片段之间包含接头的多肽，具体地其中所述接头包含例如GTSDKNNGS GSKEKNKDGKYS(SEQ ID NO：16)。
在本发明的一个实施方案中，第二C-末端OspA片段是根据本发明的杂合C-末端OspA片段。
在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体(SEQID NO：27)或者由其组成。因此，在另一方面，本发明涉及一种包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列(Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体)或者由其组成的多肽。
本发明的多肽具有保护能力。如以上详述的，相对于包含无二硫键和OspA片段的杂合性质的相应片段的多肽，二硫键到杂合和杂合/突变OspA片段中的引入和本发明的OspA片段的杂合性质增加了所述多肽的保护能力。在一些实施方案中，相对于包含没有二硫键和OspA片段的杂合性质的相应片段的多肽，保护能力增加了至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％。
术语保护能力描述保护受试者抵抗疏螺旋体感染的能力。关于本发明的多肽，保护能力涉及所述多肽诱导保护受试者抵抗疏螺旋体感染的免疫反应的能力。保护能力可通过以诱导针对所述多肽的免疫反应的方式向受试者施用所述多肽来测试。此后，用疏螺旋体攻击受试者。监测受试者对感染的反应。具体地，可确定在受试者中疏螺旋体的存在。例如，如果在受试者中不能检测到疏螺旋体，则所述多肽为保护性的。疏螺旋体的存在可通过检测疏螺旋体特异性核酸(例如，通过PCR)或疏螺旋体特异性抗体(例如，通过ELISA或蛋白质印迹)或通过检测疏螺旋体本身(例如，在生长培养基中培养器官或组织并且通过显微镜验证疏螺旋体的存在)来确定。具体地说，对于特定剂量，报道为百分比的保护能力(“pc”)如下定义：
pc(％)＝[(总测试受试者数目-疏螺旋体感染受试者数目)/总测试受试者数目]x100
保护能力的差异(Δpc)可通过例如将具有二硫键的突变OspA片段的保护能力(pc)(pc[有键])与没有二硫键的OspA片段的保护能力(pc[无键])进行比较来确定。根据本发明，待比较的多肽的不同之处仅在于至少一个二硫键的引入。引入二硫键所引起的保护能力的改变(Δpc)如下确定：
Δpc＝(pc[样品]-pc[对照])
例如，Δpc＝(pc[有键]-pc[无键])
如果Δpc大于零(＞0)，假定所有其他参数(例如，剂量和测定)为相同的，那么样品(例如，具有二硫键的突变OspA片段)的保护能力高于对照物(例如，没有二硫键的OspA片段)的保护能力。相反，如果Δpc小于零(＜0)并且假定所有其他参数(例如，剂量和测定)为相同的，那么样品(例如，具有二硫键的突变OspA片段)的保护能力小于比较物(例如，没有二硫键的OspA片段)的保护能力。
优选地，通过体内攻击测定评估本发明的多肽的保护能力，其中用本发明的多肽或安慰剂对照免疫的小鼠通过用皮下注射针(针攻击方法)或通过引入蜱载体(蜱攻击方法)引入到免疫受试者中的疏螺旋体攻击。
针对所希望的疏螺旋体菌株(例如，伯氏疏螺旋体菌株ZS7)通过以20倍与50倍感染剂量(ID)50之间的剂量将疏螺旋体皮下引入到小鼠中并且比较所攻击的小鼠中的感染速率来实施所述针攻击方法，所述小鼠是首先用第一方面的所述第一多肽免疫或者用适当安慰剂(阴性)对照如单独的缓冲液或佐剂免疫的。ID50定义为50％攻击的小鼠受到感染的剂量。在多种细菌中测量疏螺旋体的剂量。攻击剂量可广泛地改变并且为菌株相关的；因此，首先必须通过攻击实验确定ID50来评估菌株的毒力。在针攻击之后四周，收集血液和组织以用于确定感染状态的读出方法。这些读出方法可为，例如如本文所述的用于鉴别疏螺旋体的VlsE ELISA(对于血清)或qPCR(对于收集的组织)，或者其他方法。
通过向用第一方面的所述第一多肽免疫的小鼠应用感染疏螺旋体(例如，阿氏疏螺旋体，菌株IS1)的至少一种蜱若虫(例如，蓖子硬蜱)；以及b)向用第一方面的所述第二多肽免疫的第二小鼠应用至少一种感染的蜱若虫；以及c)通常在攻击之后六周比较两种小鼠的感染速率来实施蜱攻击方法。优选地，每种待测试的多肽用一组小鼠进行测定或测试。在实施例中也描述并说明了适合的测试。可以对于血清使用VlsE ELISA或者对于从收集的组织使分离的DNA用qPCR或者使用其他适合方法进行感染状态的评估。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的产品例如像包含杂合OspA片段和优选突变OspAC-末端片段的本发明的多肽，以30μg、优选10μg、优选5.0μg、优选1.0μg、优选0.3μg或更低的剂量向受试者施用3次，它具有50％或更大、优选60％或更大、更优选70％或更大、更优选80％或更大、更优选90％或更大、甚至更优选95％或更大、最优选99％或更大的保护能力。在一个实施方案中，以体内攻击方法，优选蜱攻击方法，更优选针攻击方法(例如，如实施例中所述的)评估保护能力。
在一个优选的实施方案中，当以30μg、优选10μg、优选5.0μg、优选1.0μg、优选0.3μg或更低的剂量向受试者施用3次时，本发明的包含杂合OspA C末端片段的多肽与安慰剂(阴性)对照之间的保护能力差异(Δpc)为至少50％，特别是至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选至少99％。
根据本发明，杂合OspA的第一部分可来自除伽氏疏螺旋体菌株PBr(具有SEQ IDNO：8)之外的任何疏螺旋体菌株，具体地来自本文所指定的那些，如狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体(非菌株PBr)、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体(B.andersoni)、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体，优选来自狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体或伽氏疏螺旋体，或来自两种或更多种这些物种的OspA蛋白片段的融合物。优选地，OspA来自法雷斯疏螺旋体，具体为菌株VS116(SEQ ID NO：4)，但也可来自阿氏疏螺旋体，具体为菌株K78，OspA血清型2(SEQ ID NO：6)；狭义伯氏疏螺旋体，具体为菌株B31，OspA血清型1(SEQ ID NO：5)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PBr，OspA血清型3(SEQ ID NO：8)；巴伐利亚疏螺旋体，具体为菌株PBi，OspA血清型4(SEQ ID NO：9)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PHei，OspA血清型5(SEQ ID NO：10)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株DK29，OspA血清型6(SEQ ID NO：11)或伽氏疏螺旋体，具体为菌株T25，OspA血清型7(SEQ ID NO：12)。这些OspA蛋白的氨基酸序列(全长)在以下给出。
根据本发明，还可在引入至OspA片段的任何位置以允许或支持适当的片段折叠的半胱氨酸之间形成二硫键。可如以上详述的基于OspA的已知结构选择所述位置。在一个优选实施方案中，本发明的多肽含有通过在以下疏螺旋体的残基182+/-3之一和残基269+/-3之一(二硫键类型1；“D1”)处***半胱氨酸残基而引入的至少一个二硫键：阿氏疏螺旋体，具体为阿氏疏螺旋体K78血清型2OspA，或来自除阿氏疏螺旋体以外的疏螺旋体的OspA的同源氨基酸，如狭义伯氏疏螺旋体，具体为菌株B31，血清型1；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PBr，血清型3；巴伐利亚疏螺旋体，具体为菌株PBi，血清型4；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PHei，血清型5；伽氏疏螺旋体，具体为菌株DK29，血清型6；伽氏疏螺旋体，具体为菌株T25，血清型7；或者法雷斯疏螺旋体菌株VS116的OspA的氨基酸125-176或斯柏曼疏螺旋体的OspA的氨基酸126-175与伽氏疏螺旋体菌株PBr的氨基酸177-274(SEQ ID NO：8)的融合物。
应注意：
位置182+/-3为位置179、180、181、182、183、184或185的缩写，优选为182。
位置269+/-3为位置266、267、268、269、270、271或272的缩写，优选为269。
在一个优选实施方案中，另外的突变片段源于阿氏疏螺旋体菌株K78血清型2(SEQID NO：6)的OspA的野生型序列的位置125、126、130或131至位置273的氨基酸，并且不同之处仅在于至少一个二硫键的引入，具体地说其中所述至少一个二硫键处于位置182与269之间(二硫键类型1)；或者处于来自除阿氏疏螺旋体之外的疏螺旋体某种的OspA的同源片段和位置，所述疏螺旋体某种例如狭义伯氏疏螺旋体，具体为菌株B31，血清型1；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PBr，血清型3；巴伐利亚疏螺旋体，具体为菌株PBi，血清型4；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PHei，血清型5；伽氏疏螺旋体，具体为菌株DK29，血清型6；或伽氏疏螺旋体，具体为菌株T25，血清型7。
在另一个实施方案中，突变片段可为选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48，最优选SEQ ID NO：46，以及与具有SEQ ID NO：19至25的序列中的至少一个具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中半胱氨酸并未被置换。关于突变和序列同一性的其他细节在上文给出。
如以上详述的，本发明的多肽可包含信号序列。已显示，脂化赋予OspA佐剂特性。因此，优选脂化形式的本发明的多肽或者包含脂化信号的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽包含脂化信号，优选疏螺旋体外表面蛋白OspA或OspB(分别为SEQ ID NO：13和14)的脂化信号或者更优选地大肠杆菌lpp脂化信号序列(SEQ ID NO：15)。包含脂化信号的本发明的OspA片段在加工期间被脂化并且脂化信号肽被裂解掉；因此，信号肽不再存在于成熟的脂化蛋白中。
在N-末端用“Lip”标记根据本发明的脂化蛋白，以指示将3个脂肪酸基团和一个甘油添加到所述多肽中。如以上所述的适合的脂化信号包括MKKYLLGIGLILALIA(SEQ ID NO：13)、MRLLIGFALAL ALIG(SEQ ID NO：14)和MKATKLVLGAVILGSTLLAG(SEQ ID NO：15)。因为脂质部分和甘油连接至存在于全长野生型OspA蛋白的N-末端半胱氨酸残基，所以用于脂化的OspA C-末端片段可另外包含含有半胱氨酸残基和随后的另外的氨基酸的肽。例如，紧接着脂化信号序列的C-末端的序列如CSS或CKQN(SEQ ID NO：62)提供用于在脂化信号肽裂解时脂化的N-末端半胱氨酸残基。脂化的含半胱氨酸肽存在于本发明的最终脂化多肽中。
已推测，狭义伯氏疏螺旋体的OspA蛋白包含具有结合T细胞受体的能力并且还具有结合人白细胞功能相关抗原(hLFA-1)的能力的序列(在本文中也称为“hLFA-1-样序列”)。此OspA区域与hLFA-1的相似性可在向人受试者施用狭义伯氏疏螺旋体OspA时导致具有交叉反应性的免疫反应并且可在敏感个体中诱导自身免疫疾病，具体为自身免疫关节炎。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的多肽不包含具有结合T细胞受体的能力并且具有结合人白细胞功能相关抗原(hLFA-1)的能力的序列，并且具体地说不包含氨基酸序列GYVLEGTLTAE(SEQ ID NO：17)。为此，hLFA-1-样序列，具体为氨基酸序列GYVLEGTLTAE(SEQID NO：17)，可用来自另一种疏螺旋体物种的OspA蛋白的同源序列，具体地说用NFTLEGKVAND(SEQ ID NO：18)置换。
在一个优选的实施方案中，本发明的包含至少一个二硫键的多肽相对于源于至少一种疏螺旋体菌株的野生型全长OspA蛋白中的至少一种基本上建立与所述多肽相同的抵抗疏螺旋体感染的保护能力，所述至少一种疏螺旋体具体为阿氏疏螺旋体K78，OspA血清型2(SEQ ID NO：6)；狭义伯氏疏螺旋体，具体为菌株B31，血清型1(SEQ ID NO：5)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PBr，血清型3(SEQ ID NO：7和8)；巴伐利亚疏螺旋体，具体为菌株PBi，血清型4(SEQ ID NO：9)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株PHei，血清型5(SEQ ID NO：10)；伽氏疏螺旋体，具体为菌株DK29，血清型6(SEQ ID NO：11)；或伽氏疏螺旋体，具体为菌株T25，血清型7(SEQ ID NO：12)。
请注意，关于突变和序列同一性的其他细节在上文给出。
表A-3.本发明中所描述的脂化的突变OspA片段异二聚体的命名和SEQ ID NO。
*S＝血清型(1-6)(参见表A-2)；
S3hyb＝法雷斯疏螺旋体的氨基酸125-176与伽氏疏螺旋体菌株PBr的氨基酸177-274的融合物
D1＝二硫键类型1(在位置183+/-3和270+/-3处***的半胱氨酸残基)；
Lip＝脂化∶甘油和脂肪酸残基的N-末端添加。
在另一个优选的实施方案中，根据第一方面的多肽包含通过一个或多个接头连接的至少两个或三个突变片段。接头为用于连接两个片段的相当短的氨基酸序列。它应被设计为避免对片段、它们在待治疗或接种疫苗的受试者中的相互作用或者它们的保护能力产生任何负面影响。优选为至多21个氨基酸，具体为至多15个氨基酸，特别是至多12个或8个氨基酸的短接头。更优选地，一个或多个接头由小的氨基酸组成，以便减小或最小化与片段的相互作用，所述小的氨基酸如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。优选的接头为“LN1”肽接头，它是由来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspA的N末端半部分的两个分开的环区域组成的融合物(aa 65-74和aa 42-53，具有在位置53处的氨基酸交换：D53S)，具有以下序列：GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS(SEQ ID NO：16)。所述接头可包含脂化位点。
在另一个优选的实施方案中，根据第一方面的多肽包括：具有至多500个氨基酸的总大小、包含如第一方面的优选实施方案所定义的两个或三个不同突变片段的多肽；或者基本上由两个或三个突变片段、一个或两个接头和任选的N-末端半胱氨酸组成的多肽；和/或基本上由两个或三个不同突变片段、由至多24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11个氨基酸、优选至多10、9、8、7或6个氨基酸、还更优选至多5、4、3、2或1个氨基酸组成的片段的N-末端延伸和任选的N-末端半胱氨酸所组成的多肽，其中所述N-末端延伸直接位于相应疏螺旋体OspA的片段的N-末端。所述N-末端半胱氨酸可任选地接着长1至10个氨基酸的短肽接头并且优选采用N-末端CSS肽的形式。
本发明的核酸和相关方面
在另一方面，本发明涉及一种在本发明的背景下编码如本文和以上所定义的多肽的核酸。所述核酸可包含在载体和/或细胞中。
本发明进一步提供一种编码本发明的多肽的核酸。出于本发明的目的，术语“核酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可为包括单链和双链区域/形式的未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。
如本文所用的术语“编码多肽的核酸”涵盖包含编码本发明的肽或多肽的序列的多核苷酸。所述术语还涵盖包含编码肽或多肽的单个连续区域或不连续区域(例如，被整合的噬菌体、整合的***序列、整合的载体序列、整合的转座子序列中断或者由于RNA编辑或基因组DNA重组而中断的多核苷酸)连同另外的区域(也可包含编码和/或非编码序列)的多核苷酸。
本领域普通技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，存在很多编码本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然(即，天然存在的)基因的核苷酸序列具有极小的相似性。尽管如此，本发明特别涵盖了由于密码子使用的差异而改变的多核苷酸，例如优化用于人和/或灵长类动物和/或大肠杆菌密码子选择的多核苷酸。
可使用本领域熟知的化学方法完整或部分地合成编码所需多肽的序列(参见Caruthers，M.H.等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.第215-223页(1980)；Horn等，Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.第225-232页(1980))。可选地，可使用化学方法合成多肽或其部分的氨基酸序列以便产生蛋白质本身。例如，可使用各种固相技术(Roberge等，Science 269：202-204(1995))进行肽合成并且可例如使用ASI 431A肽合成器(Perkin Elmer，Palo Alto，CA)实现自动合成。
此外，可使用本领域通常已知的方法改造本发明的多核苷酸序列，以便出于多种原因改变多肽编码序列，包括但不限于改变基因产品的克隆、加工和/或表达的改变。例如，可使用通过基因片段和合成寡核苷酸的随机片段化和PCR重组进行的DNA改组来改造核苷酸序列。此外，可使用定点诱变来***新限制位点，改变糖基化模式，改变密码子偏向，产生剪接变体或引入突变等。
在本发明的另一方面，本发明涉及包含例如连接至诱导型启动子以使得在诱导启动子时表达由核酸编码的多肽的本发明的核酸的载体。在一个优选的实施方案中，所述载体为pET28b(+)(http：//www.a ddgene.org/vector-database/2566/)。
本发明的另一方面包括所述载体，其中诱导型启动子通过将足量的IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)优选添加到生长培养基中来活化诱导型启动子。任选地，IPTG的浓度为0.1与10mM、0.1与5mM、0.1与2.5mM、0.2与10mM、0.2与5mM、0.2与2.5mM、0.4与10mM、1与10mM、1与5mM、2.5与10mM、2.5与5mM、5与10mM之间。可选地，所述启动子可通过改变温度或pH来诱导。
如本文所用的核酸分子通常是指任何核糖核酸分子或脱氧核糖核酸分子，它们可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。因此，例如，如本文所用的核酸分子是指至少单链和双链DNA、包含可为单链或更典型地双链的DNA和RNA的杂合分子或者单链和双链区域的混合物。如本文所用的，术语核酸分子包括如以上所述的含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA或RNA分子为“核酸分子”，如该术语在本文中所预期的。此外，包含不常见碱基如肌苷或修饰的碱基如三苯甲基化碱基(仅是举两个例子)的DNA或RNA种类也是如本文所定义的核酸分子。将了解的是，已对DNA和RNA分子做出各种各样的修饰，所述DNA和RNA分子用于本领域技术人员已知的很多有用目的。如本文所用的术语核酸分子包括核酸分子的此类化学、酶促或代谢修饰的形式以及病毒和细胞(除其他之外包括简单和复杂的细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。术语核酸分子还涵盖通常称为寡核苷酸的短核酸分子。术语“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”可在本文中互换使用。
根据本发明的核酸可为化学合成的。可选地，核酸可从疏螺旋体中分离并且通过本领域技术人员已知的方法进行修饰。这同样适用于根据本发明的多肽。
此外，可使用标准技术如克隆将本发明的核酸功能性连接至任何所需序列，无论是疏螺旋体调控序列或异源调控序列、异源前导序列、异源标志序列或异源编码序列，以便产生融合基因。
本发明的核酸分子可为通过克隆获得的或通过化学合成技术产生或通过其组合产生的RNA形式，如mRNA或cRNA，或者DNA形式，包括例如cDNA和基因组DNA。所述DNA可为三链、双链或单链的。单链DNA可为编码链，也称为有义链，或者它可为非编码链，也称为反义链。
本发明的核酸可包含在载体或宿主细胞中。因此，本发明还涉及一种包含根据本发明的核酸分子的载体或一种宿主细胞，优选大肠杆菌。所述载体可以载体为可复制的方式包含以上提及的核酸并且可在宿主细胞内表达由核苷酸序列编码的蛋白质。
对于本发明的多肽的重组产生，宿主细胞可基因改造为并入本发明的核酸的表达***或其部分。将核酸引入到宿主细胞中可通过许多标准实验室手册例如Davis等，BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)以及Sambrook等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)中所述的方法来实现，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、接合、转导、刮擦装载(scrape loading)、弹道引入以及感染。
适合宿主的代表性实例包括革兰氏阴性菌细胞，如大肠杆菌、不动杆菌、放线杆菌、博德特氏菌(Bordetella)、布鲁氏菌、弯曲杆菌、蓝藻细菌、肠杆菌、欧文氏菌、弗朗西斯氏菌(Francisella)、螺杆菌、嗜血杆菌、克雷伯氏菌、军团菌、莫拉氏菌(Moraxella)、奈瑟氏菌(Neisseria)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、变形菌、假单胞菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、密螺旋体、弧菌、耶尔森氏菌(Yersinia)的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细胞。在优选实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞或大肠杆菌BL21StarTM(DE3)细胞。
可选地，也可使用革兰氏阳性菌细胞。各种各样的表达***可用于产生本发明的多肽。在一个实施方案中，所述载体源于细菌质粒。通常，适用于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何***或载体在这点上可用于表达。适当的DNA序列可通过任何各种各样的熟知且常规的技术***到表达***中，所述技术例如像Sambrook等，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，(同上)中所列出的那些。
在本发明的一个实施方案中，细胞在选择压力下生长，例如在抗生素，优选卡那霉素存在下生长。在另一个实施方案中，细胞在抗生素缺乏下生长。
各种各样的表达载体可用于表达根据本发明的多肽。通常，适用于在宿主中维持、增殖或表达核酸以表达多肽的任何载体在这点上可用于表达。根据本发明的此方面，所述载体可为例如质粒载体、单链或双链噬菌体载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。本文所公开的起始质粒可商购获得，公开获得，或者可通过常规应用熟知的公布的程序由可用的质粒构建。在某些方面，在载体中优选的为用于表达核酸分子和根据本发明的多肽的那些。宿主细胞内的核酸构建体可以常规方式使用以产生通过重组序列编码的基因产物。可选地，根据本发明的多肽可通过常规肽合成器合成地产生。
此外，本发明涉及一种包含此载体的宿主细胞。适当宿主细胞的代表性实例包括细菌，如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草杆菌；真菌，如酵母和曲霉属真菌；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；哺乳动物细胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293或Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞。无细胞翻译***也可用于使用源于本发明的DNA构建体的RNA来产生此类蛋白质。
为了通过将根据本发明的载体引入到宿主细胞中来实际地表达所需的氨基酸序列，除根据本发明的核酸序列之外，所述载体还可包含用于控制表达的其他序列(例如，启动子序列、终止子序列和增强子序列)和用于选择微生物、昆虫细胞、动物培养细胞等的基因标志(例如，新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因)。此外，所述载体可包含重复形式的(例如，串联的)根据本发明的核酸序列。所述载体可基于常规用于基因改造领域的程序来构建。
宿主细胞可在适当培养基中培养，并且根据本发明的蛋白质可从培养产物中获得。根据本发明的蛋白质可从培养基中回收并且以常规方式进行纯化。
因此，本发明还涉及一种用于产生表达根据本发明的多肽的细胞的方法，所述方法包括用根据本发明的载体转化或转染适合的宿主细胞；或涉及一种用于产生根据本发明的多肽的方法，所述方法包括表达根据本发明的核酸分子。
可选地，用于产生如以上所定义的多肽的方法的特征可在于以下步骤：
a)将编码所述多肽的载体引入到宿主细胞中；
b)使所述宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长；
c)使所述宿主细胞均质化；以及
d)使所述宿主细胞均浆经受纯化步骤。
本发明进一步涉及一种用于产生如以上所定义的多肽的方法，其特征在于以下步骤：
a)将编码多肽的核酸引入到载体中；
b)将所述载体引入到宿主细胞中；
c)使所述宿主细胞在允许多肽表达的条件下生长；
d)使所述宿主细胞均质化；
e)通过相分离在液相中富集多肽；以及
f)在凝胶过滤柱上进行进一步纯化。
本发明进一步涉及一种用于产生如以上所定义的多肽的方法，其特征在于以下步骤：
a)将编码多肽的核酸引入到载体中；
b)将所述载体引入到宿主细胞中；
c)使所述宿主细胞在允许多肽表达的条件下生长；
d)使所述宿主细胞均质化；
e)通过相分离在液相中富集多肽；
g)在凝胶过滤柱上进行纯化；以及
h)任选地，在缓冲液交换柱上进一步处理。
本发明的抗体和相关方面
在另一方面，本发明的根本问题通过选择性结合如本发明的背景下所定义的杂合C-末端OspA片段来而不单独结合第一OspA部分和第二OspA部分(即如果不融合至其他部分)的抗体或至少其有效部分来解决。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在另一个优选的实施方案中，所述有效部分包括Fab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段或单个结构域抗体。
在本发明的再一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。
在又一个实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
在一个优选的方面，本发明的抗体特异性结合本发明的杂合OspA片段多肽，而不单独结合第一OspA部分和第二OspA部分且不结合对应的野生型OspA片段多肽。在一个更优选的方面，所述抗体特异性结合本发明的突变OspA片段的二硫键。
术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(如本发明的纳米抗体或多肽)可结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合蛋白的特异性可基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(KD)表示的亲和力是用于抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇与抗原结合蛋白之间的结合强度越强(可选地，亲和力还可表示为亲和力常数(KA)，所述KA为1/KD)。
如技术人员将清楚的(例如，基于本文的另外的公开内容)，亲和力可依据相关特定抗原以本身已知的方式确定。亲合力为抗原结合分子(如本发明的抗体或其有效部分)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇与抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目两者。通常，抗原结合蛋白(如本发明的抗体或其有效部分)将以10-5至10-12M或更小以及优选10-7至10-12M或更小以及更优选10-8至10-12M的解离常数(KD)(即，以105至1012M-1或更大以及优选107至1012升/摩尔或更大以及更优选108至1012M-1的缔合常数(KA))结合其抗原。大于104M的任何KD值(或小于104M-1的任何KA值)通常被认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM如小于500pM的亲和力结合所需抗原。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以本身已知的任何适合的方式确定，所述方法包括例如，斯卡查德分析和/或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)以及夹心竞争测定，以及本领域本身已知的它们的不同变型，以及本文所提及的其他技术。
如技术人员将清楚的，解离常数可为实际解离常数或表观解离常数。用于确定解离常数的方法为技术人员所清楚的，并且例如包括本文所提及的技术。在此方面，还将清楚的是，也许不可能测量大于10-4M或10-3M(例如，10-2M)的解离常数。任选地，技术人员还将清楚的是，可基于(实际或表观)缔合常数(KA)通过关系式[KD＝1/KA]计算(实际或表观)解离常数。
亲和力指示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常给出为KD或解离常数，单位为摩尔/升(或M)。亲和力也可表示为缔合常数KA，其等于1/KD并且具有(升/摩尔)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽与其预期靶标)之间的相互作用的稳定性将主要表示为其相互作用的KD值，技术人员将清楚的是，鉴于关系式KA＝l/KD，通过其KD值指明分子相互作用的强度也可用于计算对应的KA值。所述KD值也以热力学含义表征分子相互作用的强度，因为它通过熟知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等同于DG＝-RT.ln(KA))而与结合自由能(DG)有关，其中R等于气体常数，T等于绝对稳定，并且ln指示自然对数。
认为有意义的(例如，特异性的)的生物相互作用的KD的范围通常为10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)。相互作用越强，其KD越低。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体的KD为10-12M与10-5M之间，优选小于10-6，优选小于10-7，优选小于10-8M，优选小于10-9M，更优选小于10-10M，甚至更优选小于10-11M，最优选小于10-12M。
所述KD还可表示为复合物解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)之比(使得KD＝koff/kon并且KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s为秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可在102M-1s-1至约107M-1s-1之间改变，接近双分子相互作用的扩散限制的缔合速率常数。解离速率通过关系式t1/2＝ln(2)/koff而与给定分子相互作用的半衰期有关。解离速率可在10-6s-1(具有多天的t1/2的几乎不可逆复合物)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间改变。
两个分子之间的分子相互作用亲和力可通过本身已知的不同技术进行测量，如熟知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(参见，例如，Ober等，Intern.Immunology，13，1551-1559，2001)，其中一个分子固定在生物传感器芯片上并且另一个分子在流动条件下经过固定的分子，从而产生kon、koff测量值并因此获得KD(或KA)值。这可以例如使用熟知的BIACORE仪器进行。
技术人员还将清楚的是，如果测量过程在一定程度上例如因一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为现象而影响隐含的分子的内在结合亲和力，则测量的KD可与表观KD相对应。而且，如果一个分子包含多于一个用于另一个分子的识别位点，则可测量表观KD。在这种情况下，测量的亲和力可受两个分子的相互作用的亲合力影响。
可用于评估亲和力的另一种方式为Friguet等(J.Immunol.Methods，77，305-19，1985)的2-步ELISA(酶联免疫吸附测定)程序。此方法建立溶液相结合平衡测量并且避免与在支撑体如塑料上分子之一的吸附有关的可能的人为现象。
然而，KD的绝对测量可为相当耗费劳力的；因此，通常确定表观KD值以便评估两个分子的结合强度。应注意，只要以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行所有的测量，表观KD测量值可用作真实KD的近似值，并且因此在本文件中，KD和表观KD应以同等重要性或相关性对待。
最后，应注意，在很多情况下，有经验的科学家可判断它是否便于相对于一些参考分子确定结合亲和力。例如，为了评估分子A与B之间的结合强度，可例如使用已知结合B并且用荧光团或发色团或其他化学部分(例如在ELISA或流式细胞术中容易检测的生物素或其他形式(用于荧光检测的荧光团、用于光吸收检测的发色团、用于链霉亲和素介导的ELISA检测的生物素))适当地标记的参考分子C。通常，将参考分子C保持在固定浓度下并且针对给定浓度或量的B改变A的浓度。因此，获得抑制浓度(IC)50值，此值对应于在A缺乏下对于C测量的信号减半时的A的浓度。假设，KD ref(参考分子的KD)以及参考分子的总浓度cref为已知的，由以下式可获得相互作用A-B的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意如果cref＜＜KDref，则KD≈IC50。假设以一致的方式(例如，保持cref固定)对于所比较的结合剂进行IC50测量，则可通过IC50评估分子相互作用的强度或稳定性，并且此测量值在整个此文本中被判定为等于KD或等于表观KD。
本发明的另一方面涉及一种产生如以上所定义的抗体的杂交瘤细胞系。
此外，本发明的根本问题通过一种用于产生如以上所定义的抗体的方法得以进一步解决，所述方法的特征在于以下步骤：
a)通过向非人动物施用如以上所定义的多肽来起始所述动物中的免疫反应；
b)从所述动物中取出含有抗体的体液；以及
c)通过使所述含有抗体的体液经受另外的纯化步骤来产生所述抗体。
本发明进一步涉及一种用于产生如以上所定义的抗体的方法，其特征在于以下步骤：
a)通过向非人动物施用如以上所定义的多肽来起始所述动物中的免疫反应；
b)从所述动物中取出脾或脾细胞；
c)产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞；
d)选择并克隆对所述多肽特异的杂交瘤细胞；
e)通过培养所述克隆的杂交瘤细胞来产生所述抗体；以及
f)任选地进行另外的纯化步骤。
药物组合物和相关医学方面
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含：
(i)根据本发明的多肽、根据本发明的核酸和/或根据本发明的抗体；以及
(ii)任选的药学上可接受的赋形剂。
因此，根据本发明的多肽、根据本发明的核酸、根据本发明的抗体或根据本发明的药物组合物可
-用作药剂，具体地用作疫苗，或者
-用于一种治疗或预防疏螺旋体感染的方法中，所述疏螺旋体感染具体为狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体感染，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体感染。
优选地，所述组合物另外地包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)，所述组合物另外地包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)，所述组合物另外地包含Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)，或所述组合物包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)、Lip-S4D1-S3hybD1(SEQ ID NO：27)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。
再一方面涉及一种如以上所定义的用于治疗或预防疏螺旋体物种(更优选为如本文所公开的致病性疏螺旋体物种，更优选地包括狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体)感染的药物组合物。
在另一方面，本发明的根本问题通过使用用于制备用于治疗或预防疏螺旋体物种(更优选为如本文所公开的致病性疏螺旋体物种，更优选地包括狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体)感染的药物组合物的根据本发明的多肽、根据本发明的核酸和/或根据本发明的抗体得以解决。
所述药物组合物可任选地包含任何药学上可接受的载体或赋形剂，如缓冲物质、稳定剂或另外的活性成分，特别是有关药物组合物和/或疫苗生产已知的成分。优选地，所述药学上可接受的赋形剂包含L-甲硫氨酸。优选地，所述药物组合物用作药剂，具体地用作疫苗或者用于预防或治疗由疏螺旋体物种，更优选为如本文所公开的致病性疏螺旋体物种，更优选地包括狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体，和/或疫苗中所包含的抗原所针对的其他病原体引起的感染。优选地，所述药物组合物用于在一种治疗或预防以下疏螺旋体感染的方法中使用，具体为狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体感染。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂。与使用本发明的方法制备的细菌毒素或缀合物混合的适合佐剂的选择为本领域技术人员所知。适合的佐剂包括铝盐如氢氧化铝或磷酸铝，但是也可为其他金属盐，如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖类或聚磷腈的不溶性悬浮液。在一个优选的实施方案中，药物组合物用氢氧化铝作为佐剂。
在另一个实施方案中，药物组合物还包含免疫刺激物质，优选选自由以下各项组成的组：聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽；免疫刺激寡脱氧核苷酸(ODN)，特别是寡(dIdC)13(SEQ ID NO：63)；含有至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是肽KLKLLLLLKLK(SEQID NO：61)；神经活性化合物，特别是人生长激素；氢氧化铝、磷酸铝、弗氏完全或不完全佐剂或其组合。优选地，免疫刺激物质为聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸的组合或者为含有至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合，优选为KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：61)和寡(dIdC)13(SEQ ID NO：63)的组合。更优选地，所述聚阳离子肽为聚精氨酸。
在另一个实施方案中，药物组合物包含磷酸钠、氯化钠、L-甲硫氨酸、蔗糖以及聚山梨醇酯-20(Tween-20)，pH为6.7+/-0.2。优选地，药物组合物还包含氢氧化铝，优选浓度为0.15％。
在一个实施方案中，制剂包含5mM与50mM之间的磷酸钠、100与200mM之间的氯化钠、5mM与25mM之间的L-甲硫氨酸、2.5％与10％之间的蔗糖、0.01％与0.1％之间的Tween20以及0.1％与0.2％(w/v)之间的氢氧化铝。更优选地，制剂包含10mM磷酸钠、150mM氯化钠、10mM L-甲硫氨酸、5％蔗糖、0.05％Tween 20以及0.15％(w/v)氢氧化铝，pH为6.7±0.2。甚至更优选地，制剂包含至少一种、至少两种、至少三种根据本发明的突变OspA异二聚体。
在一个实施方案中，药物组合物包含3种异二聚体，优选为Lip-S1D1-S2D1(SEQ IDNO：29)、Lip-S4D1-S3hybD1(SEQ ID NO：27)以及Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。优选地，三种异二聚体以1∶2∶1、1∶3∶1、1∶1∶2、1∶1∶3、1∶2∶2、1∶2∶3、1∶3∶2、1∶3∶3、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶1∶3、2∶2∶3、2∶2∶1、2∶3∶1、2∶3∶2、2∶3∶3、3∶1∶1、3∶1∶2、3∶1∶3、3∶2∶1、3∶2∶2、3∶2∶3、3∶3∶1、3∶3∶2，最优选1∶1∶1的摩尔比混合。
在一个实施方案中，药物组合物包含两种异二聚体，优选为摩尔比为1∶2、1∶3、2∶1、3∶1、2∶3、3∶2(优选1∶1)的Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)、Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)和Lip-S4D1-S3hybD1(SEQ ID NO：27)或者Lip-S4D1-S3hybD1(SEQ ID NO：27)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗还包含至少一种来自疏螺旋体或除疏螺旋体之外的病原体的额外抗原(在本文中一般称为“组合药物组合物或疫苗”)。在一个优选的实施方案中，所述至少一种另外的抗原源于引起莱姆疏螺旋体病的疏螺旋体物种。在各个方面，所述至少一种另外的抗原源于另一种病原体，优选蜱传病原体。在另一方面，病原体引起落基山斑疹热、人粒细胞埃立克体病(HGE)、森里特苏热(Sennetsu Fever)、人单核细胞埃立克体病(HME)、边虫病、康氏立克次体斑疹热(Boutonneuse fever)、帕氏立克次体的立克次体病(Rickettsia parkeri Rickettsiosis)、南部蜱虫相关皮疹病(Southern Tick-Associated Rash Illness)(STARI)、海维提卡斑疹热(HelveticaSpotted fever)、364D立克次氏体病、非洲斑疹热、回归热(Relapsing fever)、兔热病、科罗拉多蜱热(Colorado tick fever)、蜱传脑炎(TBE，也称为FSME)、克里米亚-刚果出血热、Q型热病、鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)、科萨努尔森林病(Kyasanur forestdisease)、玻瓦桑脑炎(Powassan encephalitis)、哈特兰病毒病(Heartland virusdisease)或巴贝西虫病(Babesiosis)。在另一方面，所述疾病为日本脑炎。
在另一个实施方案中，所述至少一种另外的抗原源于载体传播的，优选蜱传病原体，所述病原体选自包含以下各项的组：赫姆斯疏螺旋体(Borrelia hermsii)、扁虱疏螺旋体(Borrelia parkeri)、达氏疏螺旋体(Borrelia duttoni)、宫本疏螺旋体(Borreliamiyamotoi)、特里蜱疏螺旋体(Borrelia turicatae)、立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)、澳洲立克次体(Rickettsia australis)、康诺尔立克次体(Rickettsiaconori)、瑞士立克次体(Rickettsia helvetica)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、腺热埃立希体(Ehrlichia sennetsu)、查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、米库尔新埃立克体(Neoehrlichia mikurensis)伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)以及孤星疏螺旋体(Borrelia lonestari)、蜱传脑炎病毒(TBEV aka FSME病毒)、科罗拉多蜱传热病毒(CTFV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、鄂木斯克出血热病毒(OHFV)、日本脑炎病毒(JEV)以及巴贝西虫物种。
在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的药物组合物和如以上所定义的另外的抗原的试剂盒，其中至少一种另外的抗原包括在第二组合物中，具体地其中所述第二组合物是疫苗，优选为蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗或落基山斑疹热疫苗。第一组合物也可以是疫苗。本发明的组合药物组合物或疫苗包含本文所讨论的任何组合物与至少一种第二(疫苗)组合物的组合。在一些方面，所述第二疫苗组合物防御载体传播疾病，优选蜱传疾病。在各个方面，所述第二疫苗组合物具有与针对疏螺旋体感染或莱姆疏螺旋体病的免疫相容的季节性免疫程序(seasonal immunization schedule)。在其他方面，组合疫苗适用于预防多种疾病，用于这些疾病流行的地理位置。
在一方面，所述第二组合物为选自由以下各项组成的组的疫苗：蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗以及落基山斑疹热疫苗。在一个优选的方面，疫苗组合物为(Baxter)、(Novartis Vaccines)、(Microgen NPO)或者TBE Moscow(Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides ofRussian Academy of Medical Sciences)。在另一个优选的方面，疫苗组合物为(Valneva SE)、(Biological E，Ltd.)或(Sanofi Pasteur)。
还提供一种用作疫苗的药物组合物，此疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个优选的实施方案中，赋形剂为L-甲硫氨酸。
本发明还包括免疫原性组合物。在一些方面，本发明的免疫原性组合物包含本文所讨论的组合物中的任何组合物和药学上可接受的载体。在各个方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生特异地结合外膜蛋白A(OspA)蛋白的抗体的特性。在某些方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生特异地结合疏螺旋体的抗体的特性。在特定方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生中和疏螺旋体的抗体的特性。在一些方面，抗体是由动物产生。在其他方面，动物为哺乳动物。在甚至其他方面，哺乳动物为人类。
包含本发明的药物组合物的疫苗制剂可用于通过经由全身或粘膜途径施用所述疫苗来保护对疏螺旋体感染敏感的哺乳动物或者治疗患有疏螺旋体感染的哺乳动物。这些施用可包括经由肌肉内、腹膜内、皮肤内或皮下途径进行注射；或者经由粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。尽管本发明的疫苗可作为单个剂量施用，但是其组分也可在相同时间或不同时间一起共同施用。
在本发明的一方面，提供一种疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒包括包含本发明的药物组合物(任选冻干形式)的小瓶并且还包括包含如本文所述的佐剂的小瓶。在本发明的此方面，设想所述佐剂将用于重新组成冻干的免疫原性组合物。在另一方面，本发明的药物组合物可在小瓶，优选在注射器中预先混合。
本发明的另一方面是一种治疗或预防有需要的受试者的疏螺旋体感染的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的抗体或本发明的药物组合物。
本发明的另一方面是一种使有需要的受试者免疫的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的抗体或本发明的药物组合物。
在又另一方面涉及一种用于使动物或人对疏螺旋体生物体引起的感染免疫的方法，其包括以下步骤：向所述动物或人施用有效量的本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的抗体或本发明的药物组合物，其中所述有效量适合于在所述动物或人中引发免疫反应。
在又另一方面涉及一种用于在动物或人中刺激针对疏螺旋体生物体的免疫反应的方法，其包括以下步骤：向所述动物或人施用有效量的本发明的多肽、本发明的核酸、本发明的抗体或本发明的药物组合物，其中所述有效量适合于在所述动物或人中刺激免疫反应。
优选地，所述疏螺旋体生物体选自包括以下各项的组：伯氏疏螺旋体(具体地狭义伯氏疏螺旋体)、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体。
在一个实施方案中，提供一种预防或治疗疏螺旋体感染的初次发作和/或复发性发作的方法，所述方法包括向宿主施用免疫保护剂量的本发明的药物组合物或疫苗或试剂盒。
本发明的另一方面为用于治疗或预防疏螺旋体疾病的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，提供一种用于治疗或预防疏螺旋体感染的药物组合物。
本发明的另一方面为本发明的药物组合物或疫苗或试剂盒在制造用于治疗或预防疏螺旋体感染的药剂中的用途。在一个实施方案中，提供一种用于制造用于治疗或预防疏螺旋体感染的药剂的本发明的药物组合物。
本发明还包括用于诱导受试者中的免疫反应的方法。在各个方面，此类方法包括向受试者施用有效诱导免疫反应的量的本文所讨论的免疫原性组合物或疫苗组合物中的任一种的步骤。在某些方面，免疫反应包括产生抗OspA抗体。
本发明包括用于预防或治疗受试者中的疏螺旋体感染或莱姆疏螺旋体病的方法。在各个方面，此类方法包括向受试者施用有效预防或治疗疏螺旋体感染或莱姆疏螺旋体病的量的本文所讨论的疫苗组合物中的任一种或本文所讨论的组合疫苗中的任一种的步骤。
本发明包括本发明的多肽、核酸、抗体、药物组合物或疫苗用于制备药剂的用途。在本发明中还提供其他相关方面。
本发明人预期本文的术语“包含的(comprising)”、“包含了(comprise)”和“包含(comprises)”在每种情况下可任选地分别与“由...组成的(consisting of)”、“由...组成了(consist of)”和“由...组成(consists of)”替换。术语“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。因此，除非上下文另外要求，否则词语“包含”以及变型“包含了”和“包含的”将理解为暗指包含说明的化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗体)或步骤或者化合物或步骤的组，但是不排除任何其他化合物、组合物、步骤或其组。缩写“e.g.”源于拉丁语例如(exempli gratia)并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
在本文中涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也可用于涉及本发明的“药物组合物”的实施方案，并且反之亦然。
除非另外说明，否则本文所使用的所有技术和科技术语均具有如本公开内容所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文另外清楚地指示，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或”意图包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。应进一步理解地是，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且提供用于描述。另外，关于物质如抗原的浓度或水平给出的数值限制可为近似值。
用于根据本发明的在其不同实施方案中的多肽或者根据本发明的核酸分子的优选载体或赋形剂为用于进一步刺激对根据本发明的多肽或其编码核酸分子的免疫反应的免疫刺激化合物如佐剂。
佐剂或免疫刺激化合物可用于本发明的组合物。优选地，根据本发明的药物组合物中的免疫刺激化合物选自下组：聚阳离子物质(特别是聚阳离子肽)、免疫刺激核酸分子(优选免疫刺激脱氧核苷酸)、水包油或油包水乳液、MF59、铝盐、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、神经活性化合物(特别是人生长激素)或其组合。
氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的使用为特别优选的，并且抗原通常被吸附至这些盐。优选地，氢氧化铝以0.15％的最终浓度存在。一种有用的磷酸铝佐剂为无定形羟基磷酸铝，其中PO4/Al摩尔比为0.84与0.92之间。适用于本发明的另一种佐剂是能够提供水性组合物的铝盐，所述水性组合物基于水性组合物的重量具有小于350ppb重金属。另一种有用的铝基佐剂为AS04，其为氢氧化铝与单磷酰基脂质A(MPL)的组合。
而且，根据本发明的药物组合物为包含以下化合物中的至少任一种或其组合的药物组合物：根据本发明的核酸分子、根据本发明的在其不同实施方案中的多肽、根据本发明的载体、根据本发明的细胞以及根据本发明的抗体。与此相关，任何这些化合物可与用于细胞、组织或生物体的一种或多种未经过灭菌或经过灭菌的载体，例如适用于施用给受试者的药物载体组合使用。此类载体可包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及其组合。所述制剂应该符合施用方式的要求。
在一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。术语“稳定剂”是指保护疫苗的免疫原性组合物不受不利条件(如在加热或冷冻期间产生的那些条件)的影响和/或延长免疫原性组合物在稳定和免疫原性的条件或状态下的稳定性或保质期的物质或疫苗赋形剂。稳定剂的实例包括但不限于糖类，如蔗糖、乳糖以及甘露糖；糖醇，如甘露醇(manitol)；氨基酸，如甘氨酸或谷氨酸；以及蛋白质，如人血清清蛋白或明胶。
本发明的药物组合物可以任何有效的便利的方式施用，包括，例如通过局部、口腔、***、***、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻内、气管内或皮内途径以及其他方式施用。在一个优选的实施方案中，皮下或肌肉内地，最优选肌肉内地施用药物组合物。
在治疗中或者作为预防药，本发明的药物组合物的活性剂可作为可注射组合物，例如作为无菌水性分散体(优选等渗的)施用给个体。
可选地，所述组合物，优选药物组合物可配制用于例如呈软膏、乳膏、洗剂、眼膏、滴眼剂、滴耳剂、洗口药、浸渍敷料和缝合线以及气溶胶的形式局部应用，并且可包含适当的常规添加剂，包括例如防腐剂、促进药物渗透的溶剂以及软膏和乳膏中的软化剂。此类局部制剂也可包含相容性常规载体，例如乳膏或软膏基质以及用于洗剂的乙醇或油醇。此类载体可构成制剂的约1重量％至约98重量％；通常它们将构成制剂的约80重量％。
除以上所述的疗法之外，本发明的组合物通常可用作创伤处理剂以防止细菌粘附至暴露于创伤组织的基质蛋白并且在牙科治疗中作为抗生素预防的替代选择或与抗生素预防的组合用于预防性用途。
在一个优选的实施方案中，药物组合物为疫苗组合物。优选地，此类疫苗组合物便利地呈可注射形式。常规佐剂可用于增强免疫反应。用于用蛋白抗原接种疫苗的适合单位剂量对于成人为每千克体重0.02μg与3μg抗原之间，并且对于儿童为每千克体重0.2μg与10μg抗原之间，并且此剂量优选以2周至24周的间隔施用1至3次。
在指定的剂量范围内，预期利用本发明的化合物不产生不良毒性作用，而不良毒性作用会妨碍将所述化合物施用给适合的个体。
作为另一方面，本发明包括包含用于向受试者施用的一种或多种药物制剂的试剂盒，所述制剂以促进它们用于向受试者施用的方式进行包装。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含最终体积为2mL，更优选最终体积为1mL的制剂。
在一个特定实施方案中，本发明包括用于产生单一剂量施用单元的试剂盒。在各个方面，试剂盒各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。本发明的范围内还包括含有单室和多室预装填注射器(例如，液体注射器和药粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
在另一个实施方案中，这种试剂盒包括本文所述的药物制剂(例如，包含治疗性蛋白或肽的组合物)，所述药物制剂被包装在容器如密封瓶或器皿中，其中描述化合物或组合物在实践所述方法中的用法的标签贴在容器上或包括在包装中。在一个实施方案中，药物制剂包装在容器中，以使得容器的顶部空间的量(例如，在液体制剂与容器顶部之间的空气的量)十分之小。优选地，顶部空间的量是可忽视的(即，几乎不存在)。
在一方面，试剂盒包含具有治疗性蛋白或肽组合物的第一容器和具有用于该组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一方面，药物制剂以单位剂量形式进行包装。试剂盒任选地还包括适用于根据特定施用途径来施用药物制剂的设备。在一些方面，试剂盒包含描述药物制剂的用法的标签。
药物组合物可包含一系列不同抗原。抗原的实例为完全灭活的或减毒的生物体、这些生物体的亚组分、蛋白质或其最简单的形式的肽。抗原也可通过免疫***以糖基化蛋白或肽的形式被识别并且也可为或包含多糖或脂质。因为细胞毒性T细胞(CTL)识别与主要组织相容性复合物(MHC)结合的短肽(通常8至11个氨基酸长度)形式的抗原，所以可使用短肽。B细胞可识别短至4至5个氨基酸的线性表位以及三维结构(构象表位)。
在一个优选的实施方案中，另一方面的药物组合物另外包含针对疏螺旋体蛋白的超免疫血清反应性抗原或其活性片段或变体，例如像WO 2008/031133中所述的抗原、片段和变体。
根据本发明，根据另一方面的药物组合物可用作药剂，具体地用作疫苗，具体地结合由疏螺旋体引起的、与疏螺旋体有关或相关的疾病或患病病状使用。
本发明的药物组合物可用作药剂，具体地用作疫苗，具体地结合由疏螺旋体(更优选地任何致病性疏螺旋体物种)引起的、与疏螺旋体有关或相关的疾病或患病病状使用，并且更优选地用于一种用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法，所述感染具体地为狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体感染，优选地狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体感染。
与此相关，应注意，不同疏螺旋体物种(包括广义伯氏疏螺旋体)包括若干种物种和菌株，包括本文所公开的那些。待根据本发明预防和/或治疗的与所述细菌感染相关、由其引起或与其有关的疾病包括莱姆疏螺旋体病(莱姆病)。如也在本文公开的莱姆疏螺旋体病的另外的方面、症状、阶段和亚组以及罹患此类疾病的特定患者群组(包括在引言部分中)以引用的方式并入本文。更确切地说，莱姆疏螺旋体病通常分阶段地发生，其中在各个阶段存在出现缓解和恶化的不同临床表现。早期感染阶段1由皮肤的局部感染组成；数天或数周后为阶段2，播散性感染；数月至数年后为阶段3，持续性感染。然而，感染为可变的；一些患者仅患有局部皮肤感染，而其他患者仅显示疾病后期表现，如关节炎。
在第四方面，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者中的疏螺旋体感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第三方面的药物组合物。
贯穿本说明书使用术语“受试者”来描述根据本发明的治疗或方法所提供给的动物，优选哺乳动物，更优选人。对于对特定动物如人患者特异的那些感染、病状或疾病状态的治疗，术语患者是指该特定动物。优选地，受试者为人；然而，组合物的医学用途也可包括动物如家禽(包括鸡、火鸡、鸭或鹅)、家畜(如马、牛或羊)或伴侣动物(如狗或猫)。
贯穿本说明书中使用术语“有效量”来描述在用于本发明的方法时可用于诱导预期结果的本发明药物组合物的量。在本发明的多个方面，术语有效量与治疗或预防结合使用。在其他方面，术语有效量仅仅是指，包括在其中寻求疏螺旋体感染的治疗或预防的根据本发明的方法中，产生认为有利或有用的结果的药剂的量。
贯穿本说明书使用有关目前描述的化合物和组合物的术语有效量来描述向罹患疏螺旋体相关疾病的哺乳动物患者(特别包括人患者)施用以减少或抑制疏螺旋体感染的根据本发明的化合物的量。
在一个优选的实施方案中，根据以上方面的免疫受试者的方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的第三方面的药物组合物的步骤。
所述方法包括通过基因疗法或其他方式通过体内施用根据本发明的多肽或核酸来在个体中诱导免疫反应，以便刺激免疫反应从而产生抗体或细胞介导的T细胞反应(产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)，以保护所述个体免受疾病影响，无论该疾病是否已经在个体内存在。
本发明的产物(具体为多肽和核酸)优选以分离形式提供并且可纯化至均质。如本文所用的术语“分离的”意指“通过人工”从其自然状态分离，即如果它存在于自然界中，其已从其原始环境改变或去除，或二者。例如，以天然状态天然地存在于活的生物体中的天然存在的核酸分子或多肽为未“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分离的相同核酸分子或多肽为“分离的”，如所述术语在本文所用的。作为分离的一部分或者在分离之后，此类核酸分子可接合至其他核酸分子如DNA分子用于诱变以便形成融合基因，并且用于在例如宿主中进行增殖或表达。单独的或接合至其他核酸分子如载体的分离的核酸分子可引入到培养物或全生物体的宿主细胞中。引入到培养物或全生物体的宿主细胞中，此类DNA分子仍可为分离的，如所述术语在本文所用的，因为它们不是处于其天然存在的形式或环境中。类似地，核酸分子和多肽可存在于组合物中，如用于将核酸分子或多肽引入到例如细胞中的介质制剂、溶液，用于例如化学或酶促反应的组合物或溶液，它们不是天然存在的组合物并且其中保留有在如本文所用的该术语的含义内的分离的核酸分子或多肽。
本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以改变。此外，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围。除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数指代物。类似地，词语“包含”、“含有”和“涵盖”应理解为包含的而非排他的。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语以及任何缩写均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相类似或等同的任何方法和材料均可用于实践本发明，但是本文描述了优选的方法和材料。
本发明通过以下附图、表格、实施例和序列表进行进一步说明，从中可获得另外的特征、实施方案和优点。同样地，所讨论的特定修改不应理解为对本发明的范围的限制。本领域技术人员将清楚的是，可在不背离本发明的范围的情况下做出各种等效方案、改变和修改，并且因此应理解此类等效实施方案包括在本文中。
结合本发明
图1示出血清型1-血清型6和法雷斯疏螺旋体OspA(S1D1-S6D1和BvaD1)的二硫键稳定的片段，以及本发明的突变融合OspA片段的静电势等量线，所述突变融合片段由法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176和伽氏疏螺旋体菌株PBr的氨基酸177-274组成，其中引入二硫键(S3hybD1)。
图2示出本发明的Lip-S4D1-S3hybD1(含突变血清型3OspA融合片段的异二聚体蛋白)与异二聚体蛋白Lip-S4D1-S3D1的氨基酸比对。
图3示意性示出根据本发明的突变OspA片段异二聚体的产生。
图4示意性表示包含三种不同突变OspA异二聚体(包括Lip-S4D1-S3hybD1)的本发明的一种药物组合物、一种“改进的组合疫苗”的多肽组分。
图5示出Pam3Cys的化学结构，Pam3Cys是脂肪酸取代的半胱氨酸的实例，其例如将出现在本发明的脂化多肽的N-末端。
图6示出对于在响应于用本发明的改进的异二聚体组合疫苗进行免疫的小鼠中产生的血清型1-6疏螺旋体OspA蛋白的IgG抗体效价。
图7示出来自用本发明的改进的异二聚体组合疫苗进行免疫的小鼠的抗体与具有OspA血清型1-6的疏螺旋体属螺旋体的细胞表面的结合。
表1比较Lip-S4D1-S3hybD1异二聚体与Lip-S4D1-S3D1异二聚体的纯化产率。
表2示出本发明的改进的异二聚体组合疫苗针对通过OspA血清型1、2、5以及6疏螺旋体进行的体内攻击的保护能力。
在本说明书中可能参照的附图和表格在以下进行更详细地描述。
图1来自血清型1-6(S1D1-S6D1)和法雷斯疏螺旋体(BvaD1)的二硫键稳定的OspA片段以及二硫键稳定的融合OspA片段(S3hybD1)的静电势模拟。将等量线(+/-1kT/e)的负电荷涂亮色并将正电荷涂暗色，以作为固体表面。溶剂可及表面作为线框呈现。白色箭头指示给出静电极性的两个扩展簇在血清型3片段的同一平面上的位置。可看出，杂合OspA C-末端片段的表面不具有如S3D1单体的扩展静电极性簇。
图2示出共有序列的Lip-S4D1-S3hybD1和Lip-S4D1-S3D1异二聚体多肽的氨基酸序列比对。Lip-S4D1-S3hybD1异二聚体与Lip-S4D1-S3D1异二聚体总计仅31个氨基酸不同。
图3包含两个突变OspA C-末端片段(选自疏螺旋体某种的不同OspA血清型)或杂合突变OspA C-末端片段的本发明的突变OspA异二聚体的产生，(A)示意性表示编码脂化突变OspA异二聚体的核酸。组件从5’至3’包括脂化信号序列(Lip信号)的编码序列、用于N-末端脂化的CSS肽、具有两个非天然半胱氨酸的OspA的突变C-末端片段、短接头肽(LN1)、之后的具有两个非天然半胱氨酸的第二突变OspA C-末端片段。(B)中间突变OspA异二聚体多肽包含直接在核酸构建体翻译之后的新生产物。从N-末端至C-末端，此多肽由脂化信号序列(Lip信号)、用于脂化的CSS肽、具有非天然二硫键的突变OspA片段、短接头肽(LN1)、之后的具有非天然二硫键的第二突变OspA片段组成。(C)在翻译后修饰之后的最终脂化的突变OspA异二聚体多肽。从N-末端至C-末端，异二聚体由具有脂化的N-末端半胱氨酸的CSS肽、通过二硫键稳定的突变OspA片段、接头肽(LN1)以及通过二硫键稳定的第二突变OspA片段组成。如所示的，在多肽的翻译后修饰期间脂化信号序列被裂解掉。
图4根据本发明的优选药物组合物的实例。各自包含选自不同疏螺旋体OspA血清型的两种突变OspA片段或杂合突变OspA C-末端片段(S3hybD1)的三种突变OspA异二聚体存在于组合物中，从而一起提供来自六种不同疏螺旋体OspA血清型的OspA抗原。这种药物组合物使得针对六种疏螺旋体血清型的同时免疫成为可能。
图5 Pam3Cys的化学结构示意图，Pam3Cys为全长野生型OspA蛋白的N-末端半胱氨酸的脂肪酸取代以及本发明的脂化的突变OspA片段异二聚体的实例。在本发明的全长OspA蛋白或多肽的翻译后修饰期间，N-末端脂化信号序列被裂解掉并且脂肪酸(最常见为三个棕榈酰部分(“Pam3”))酶促地共价连接至N-末端半胱氨酸残基(硫原子“S”由箭头指示)多肽链的其余残基。多肽链的其余残基，位于Pam3Cys残基的C-末端，由“Xn”表示。(改编自Bouchon等(1997)Analytical Biochemistry 246：52-61。)
图6产生全长OspA蛋白的全部六种血清型的抗体效价。以两周的间隔用各3μg以下所指出的组合疫苗免疫小鼠三次：Lip-S1D1-S2D1、Lip-S4D1-S3D1和Lip-S5D1-S6D1以1∶1∶1比率一起(“Het组合”)；Lip-S1D1-S2D1、Lip-S4D1-S3hybD1和Lip-S5D1-S6D1以1∶1∶1比率一起(“改进的het组合”)或Lip嵌合OspA ST1/ST2-His、Lip嵌合OspA ST5/ST3-His和Lip嵌合OspA ST6/ST4-His以1∶1∶1比率一起(“嵌合体组合”)并且在最后一次剂量之后一周收集血清。通过ELISA测定IgG抗体对全长OspA蛋白的六种不同血清型的效价。
图7来自免疫的小鼠的抗体与疏螺旋体属螺旋体的细胞表面的结合。如以上免疫小鼠并且在最后一次剂量之后一周收集血清并合并。通过细胞染色和流式细胞术测试血清系列稀释液以获知与疏螺旋体属螺旋体细胞表面的结合。减去在对从用单独的Al(OH)3佐剂免疫的对照小鼠收集的血清进行染色时观察到的荧光强度值，以解释非特异性结合。(用于结合测定的疏螺旋体为：伯氏疏螺旋体，OspA血清型1，菌株N40；阿氏疏螺旋体，OspA血清型2，菌株PKo；伽氏疏螺旋体，OspA血清型3，菌株Fr；巴伐利亚疏螺旋体，OspA血清型4，菌株Fin；伽氏疏螺旋体，OspA血清型5，菌株PHei；伽氏疏螺旋体，OspA血清型6，菌株KL11。)
实施例
实施例1.杂合血清型3OspA C-末端片段的分子建模
构造杂合OspA ST3C-末端片段的动机
如在我们先前申请书(WO2014/006226)中所述的莱姆疏螺旋体病组合疫苗由三种突变OspA异二聚体组成。源于C-末端结构域的来自两种不同OspA血清型(ST)的短稳定片段与短接头融合以形成异二聚体。三种异二聚体由OspA ST1-ST2、ST4-ST3和ST5-ST6组成。为了改进异二聚体的免疫原性，添加用于脂化的信号序列，其类似于为作为脂蛋白的成熟全长OspA。
已证明由OspA ST4-ST3(Lip-S4D1-S3D1；SEQ ID NO：31)组成的脂化异二聚体比两种其他异二聚体更加难溶，这导致纯化期间的低回收率。此问题可主要归因于短稳定的OspA ST3蛋白，由于这种蛋白作为脂化单体不能表达和纯化。
分子建模
已在计算机上进行稳定的单体的比较结构调查，以阐明与OspA晶体结构(PDB：1OSP；Li H、Dunn JJ、Luft BJ、Lawson CL(1997)Crystal structure of Lyme diseaseantigen outer surface protein A complexed with an Fab.Proc Natl Acad Sci 94：3584-3589)相比单体模型之间的折叠的相容性并且将它们的表面特性与ST3类型单体进行比较。晶体结构表示伯氏疏螺旋体B31的血清型1，并且示出OspA的N-末端与小鼠抗体Fab184.1结合。由ST1OspA晶体结构和可用的同源模型开始构建六种短稳定的OspA单体的同源结构模型(SwissModel；Kiefer F、Arnold K、Kunzli M、Bordoli L、Schwede T(2009)TheSWISS-MODEL Repository and associated resources.Nucleic Acids Res 37：D387-392)，然后修饰所述同源模型以在适用的情况下并入稳定的二硫键和序列改变(The PyMOLMolecular Graphics System，Version Open-Source，LLC)。
用适应的Poisson-Boltzmann解算机模拟全部六种短稳定的OspA单体的静电势等量线(APBS；Baker NA、Sept D、Joseph S、Holst MJ、McCammon JA(2001)Electrostaticsof nanosystems：application to microtubules and the ribosome.Proc Natl AcadSci 98：10037-10041，pdb2pqr；Dolinsky TJ、Czodrowski P、Li H、Nielsen JE、Jensen JH等(2007)PDB2PQR：expanding and upgrading automated preparation of biomolecularstructures for molecular simulations.Nucleic Acids Res 35：W522-525)，以确定短稳定的OspA ST3蛋白是否具有偏离其他OspA ST的表面静电模式，这可解释短稳定的OspAST3(“S3D1”，图1)的溶解性问题。在S3D1的一侧上观察到电荷分布的显著极性(参见箭头)，所述显著极性在任何其他短稳定的OspA ST中未观察到。
还用来自法雷斯疏螺旋体的短稳定的OspA(“BvaD1”，图1)进行静电势模拟。BvaD1OspA片段在表面上表现出静电势等量线的变化极性，这使得所述BvaD1OspA片段成为用于部分节段交换的潜在候选构建块，所述部分节段交换的目的在于修饰整体表面从而不显示如S3D1所见的扩展静电极性的任何显著扩展簇。选择杂合单体中血清型3部分与来自法雷斯疏螺旋体的交换部分之间的优选连接，以置换单体的N-末端β折叠并且使血清型3部分的两个β折叠和C-末端螺旋在保留整体折叠下完好。后一种情况很大程度上取决于分子核心中密集的疏水性残基的相容性。用分子力学模拟来验证杂合稳定的单体S3hybD1模型的折叠相容性(Gromacs；Pronk S、Pall S、Schulz R、Larsson P、Bjelkmar P等(2013)GROMACS 4.5：a high-throughput and highly parallel open source molecularsimulation toolkit.Bioinformatics 29：845-854)。
以含有杂合OspA片段的异二聚体形式的应用
作为静电势模拟的结果，克隆含有来自法雷斯疏螺旋体和伽氏疏螺旋体的片段OspA蛋白的实验融合物(S3hybD1，图1)的新异二聚体：Lip-S4D1-S3hybD1。与Lip S4D1-S3D1相比，除了在异二聚体S4D1-S3hybD1中改变血清型3OspA片段的前三分之一之外，在OspA ST3的位置233(P233T，根据不成熟全长OspA的氨基酸命名法；SEQ ID NO：8)处引入氨基酸取代。
如以下更详细说明的，这种新异二聚体显示大幅改进的溶解性以及当纯化且用于免疫小鼠时针对表达血清型3OspA的疏螺旋体的免疫原性。
实施例2.脂化的突变OspA片段异二聚体的纯化和配制
脂化的非His-标记的突变OspA片段异二聚体的克隆和表达
通过GeneArt(Germany)对融合OspA单体法雷斯疏螺旋体/伽氏疏螺旋体菌株VS116/PBr进行密码子优化，以用于大肠杆菌表达。添加到N-末端的脂化信号序列源于大肠杆菌主要外膜脂蛋白Lpp，并且在C-末端后面直接跟着CSS肽，以提供用于脂化的N-末端半胱氨酸。通过接头序列“LN1”将突变血清型4OspA片段与杂合血清型3OspA片段融合，以生成改进的异二聚体构建体。将基因片段克隆到pET28b(+)载体(Novagen，USA)内，并且在BL21(DE3)细胞(Invitrogen，USA)中表达稳定的异二聚体。在4h之后通过离心收集细胞并且在进一步处理之前将沉淀在-70℃下保存12个月。
脂化的突变OspA片段异二聚体的纯化
通过高压均质化来机械破坏细胞，并且通过相分离使用Triton X-114作为洗涤剂在液相中富集脂化的突变OspA片段异二聚体Lip-S4D1-S3D1和Lip-S4D1-S3hybD1。然后，使稀释的洗涤剂相经受以非结合模式运行的阴离子交换色谱法(Q-sepharose；GEHealthcare，United Kingdom)。将所得的液流装载到羟磷灰石柱(Bio-Rad，USA)上并且通过线性盐梯度从柱中洗脱脂化的蛋白质。使洗脱液在非结合模式的DEAE-琼脂糖柱(GEHealthcare)上，随后在用于缓冲液交换的凝胶过滤柱(Superdex 200，GE Healthcare)上进行进一步纯化。基于分析尺寸排阻柱和SDS-PAGE合并脂化的突变OspA异二聚体峰。在无菌过滤之后，将纯化的异二聚体保存在-20℃下，直到配制制剂为止。
组合疫苗的配制
为了优化稳定性，进行关于本发明的组合疫苗的制剂的研究。如在我们先前申请书(WO2014/006226)中所述的，结合氢氧化铝和抗原，在不同浓度下测试不同类型的缓冲液和稳定剂。确定了在pH 6.7±0.2下具有各自40μg/mL的三种异二聚体(总计120μg蛋白质)、10mM磷酸钠、150mM氯化钠、10mM L-甲硫氨酸、5％蔗糖、0.05％Tween20(聚山梨醇酯20)以及0.15％(w/v)氢氧化铝的最佳制剂。
结果
就mg/g生物量而言，改进的异二聚体Lip-S4D1-S3hybD1显示超过Lip-S4D1-S3D1约4倍高的产率。另外，改进的异二聚体制备物的可比较纯度用少一个色谱法步骤可获得。(参见表1.)
表1.与Lip-S4D1-S3D1相比，异二聚体Lip S4D1-S3hybD1的提高的产率。
实施例3.不同血清型的脂化的突变OspA片段异二聚体的免疫原性
小鼠的免疫
对于所有研究，使用雌性C3H/HeN小鼠。在免疫接种之前，通过面静脉对十只小鼠的组进行取血，并且制备并合并免疫前的血清。以两周的间隔每次施用100μL s.c.免疫，施用三次。各剂量含有1μg相应的异二聚体蛋白。对于改进的异二聚体组合疫苗：Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)、Lip-S4D1-S3hybD1(SEQ ID NO：27)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)；对于先前发明的异二聚体组合疫苗：Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)、Lip-S4D1-S3D1(SEQ ID NO：31)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)；以及对于嵌合体组合疫苗：Lip-嵌合OspA ST1/ST2-His(Seq ID No：40)、Lip-嵌合OspA ST5/ST3-His(Seq ID No：41)和Lip-嵌合OspA ST6/ST4-His(SEQ ID NO：42)。所有组合疫苗均用最终浓度为0.15％的氢氧化铝(Al(OH)3)配制。在第三次免疫之后一周，从面静脉收集血液并且制备免疫血清。在每个实验中，包括用与Al(OH)3配制的PBS免疫的一组作为阴性对照(安慰剂组)。所有动物实验均根据奥地利法规(BGB1Nr.501/1989)进行并且由“Magistratsabteilung 58”批准。
OspA ELISA
用每孔50ng(1μg/mL)稀释于包被缓冲液(PBS)中的蛋白来涂布ELISA板(Maxisorp，Nunc，丹麦)并且在4℃下孵育16至72小时。包被抗原是C-末端His-标记的全长脂化的OspA ST1-6。丢弃包被缓冲液并且添加100μL封闭缓冲液(1％BSA、0.5％Tween-20、PBS)且在环境温度下孵育1-2小时。用300μL(溢流)PBST(0.1％Tween-20，PBS)将板洗涤三次。在封闭缓冲液中进行血清的五倍稀释并且将50μL添加到各孔且在环境温度下孵育1小时。用300μL(溢流)PBST将板洗涤三次。将二抗(辣根过氧化物酶[HR]缀合的兔抗小鼠IgG，DAKO，丹麦)以封闭缓冲液进行1∶2000稀释并且将50μL添加到各孔且在环境温度下孵育1小时。用300μL(溢流)PBST将板洗涤三次。将ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Sigma-Aldrich，USA)用作HRP的底物，将50μL ABTS添加到各孔且在环境温度下在黑暗中孵育15分钟。通过添加50μL 1％SDS来停止反应且在405nm下读取吸光度。当空白吸光度低于0.1时，板被认为是有效的。当最低稀释具有高于1.0的吸光度并且最高稀释低于0.1时，样品是有效的。当满足这些标准时，测定半最大效价。半最大效价是对应于最高稀释与最低稀释之间的平均吸光度的稀释的倒数。
流式细胞术
将螺旋体(1x106)与等体积的4％多聚甲醛混合并且在室温下在96-孔板(Nunclon96U，Nunc)中孵育2小时。将所述板以2,000g离心5分钟并且丢弃上清液。用具有2％BSA的150μL HBSS(HBSS-B)洗涤细胞，如上所述地进行离心，并且丢弃上清液。通过在56℃下将小鼠血清孵育35分钟来加热灭活它们。将热灭活的血清稀释于HBSS-B中并且通过使用Costarspin-X离心管过滤器(0.22μm，Corning，美国)以4,000g离心3分钟来进行无菌过滤。将螺旋体溶解于100μL血清中并且在室温下孵育45分钟。将所述板2,000g离心15分钟并且丢弃上清液。将细胞用150μL HBSS-B洗涤一次并且然后重新悬浮于100μL HBSS-B中。将一微升二抗(PE缀合的山羊抗小鼠IgG，Beckman Coulter，美国)添加到细胞中并且在室温下在黑暗中孵育45分钟。将螺旋体用150μL HBSS-B洗涤一次并且然后重新悬浮于含有2.5μM SYTO-17DNA染料的200μL HBSS中，并且在室温下在黑暗中孵育10分钟。将染色的螺旋体通过以2,000g离心5分钟来沉淀并且然后重新悬浮于200μL HBSS中。用FC500(Beckman Coulter)流式细胞仪测量标记的螺旋体，分选SYTO-17阳性事件。
结果
测试两种不同OspA异二聚体制剂(“het组合”和“改进的het组合”)以及OspA嵌合体组合(“嵌合体组合”)在小鼠中的免疫原性。通过ELISA分析超免疫血清针对全长OspA(包被抗原)的反应性并且分析与表达不同OspA血清型(ST1至ST6)的疏螺旋体菌株的表面结合。
ELISA结果表明全部疫苗组合刺激的抗体响应于全部六种OspA血清型(参见图6)。关于本发明特别值得注意的是，与先前发明的OspA异二聚体组合疫苗相比，改进的OspA异二聚体组合疫苗产生更高水平的对血清型3OspA特异的抗体，而对其他OspA血清型的抗体水平相当于由两种疫苗刺激。
在疏螺旋体表达所有六种OspA血清型的情况下，观察到来自超免疫小鼠血清的抗体直接与疏螺旋体属螺旋体结合(参见图7)，这表明响应于所有抗原而产生的抗体是具有功能活性的并且可原位结合天然OspA。荧光强度在大的血清稀释液范围内呈线性。观察到的响应于改进的异二聚体组合疫苗针对螺旋体的荧光强度与观察到的响应于异二聚体组合疫苗和嵌合体组合疫苗的那些荧光强度是相当的。值得注意的是，关于与血清型3OspA疏螺旋体的结合，通过用改进的疫苗免疫产生的抗体优于响应于两种其他组合疫苗产生的抗体。
实施例4.改进的异二聚体组合疫苗针对体内疏螺旋体攻击的保护能力
小鼠的免疫
对于所有研究，使用雌性C3H/HeN(H-2k)小鼠(Janvier，法国)。在每次攻击之前，通过尾静脉对五只8周大的小鼠组进行取血，并且制备并合并免疫前的血清。以两周的间隔以表2所指示的剂量施用三次100μL皮下(s.c.)免疫。改进的异二聚体组合疫苗和嵌合体组合疫苗两者均以如实施例3所述的1∶1∶1比率包括三种蛋白。所有制剂均包含最终浓度为0.15％的氢氧化铝(Al(OH)3)。在第三次免疫之后一周，收集血液并且制备超免疫血清。在每个实验中，仅用Al(OH)3(在制剂缓冲液或PBS中)注射的一组作为阴性对照，并且用来自适当OspA血清型的野生型全长脂化OspA蛋白免疫的一个小鼠组作为阳性对照(伯氏疏螺旋体菌株B31(OspA血清型1，SEQ ID NO：34)、阿氏螺旋体菌株K78(OspA血清型2，SEQ ID NO：35)、伽氏螺旋体菌株PHei(OspA血清型5，SEQ ID NO：38)或伽氏疏螺旋体菌株DK29(OspA血清型6，SEQ ID NO：39))。所有动物实验均根据奥地利法规(BGB1Nr.501/1989)进行并且由“Magistratsabteilung 58”批准。
使用体外生长的疏螺旋体对免疫小鼠进行的针攻击
在最后一次免疫之后两周，用以100μL生长培养基(BSKII)稀释的螺旋体s.c.攻击小鼠。使用表达OspA血清型1的伯氏疏螺旋体菌株ZS7(实验1和2)、表达OspA血清型5的伽氏疏螺旋体菌株PHei(实验10至13)或表达OspA血清型6的伽氏疏螺旋体菌株Ma(实验14至17)进行攻击。攻击剂量为菌株相关的并且取决于单种菌株的毒力，所述毒力通过用于确定ID50的攻击实验进行评估。用于针攻击实验的剂量范围为ID50的20倍至50倍。在每次攻击之前，通过流式细胞术证实OspA表达(参见实施例3)。仅使用其中＞80％细胞对OspA表达呈阳性的培养物进行小鼠的攻击。
使用伯氏疏螺旋体或阿氏疏螺旋体感染的蜱对免疫的小鼠进行的攻击(“蜱攻击”)
在最后一次免疫之后两周，使用含有以下菌株的蜱攻击小鼠：表达OspA血清型1的伯氏疏螺旋体菌株Pra4(实验3)、表达OspA血清型1的伯氏疏螺旋体菌株Pral(实验4和5)或表达OspA血清型2的阿氏疏螺旋体(实验6至9)。为了促进免疫的小鼠的蜱感染，用膏(Reckitt Benckiser，英国)去除每只小鼠背部的毛发并且用强力胶(Pattex，德国)将小型通风容器粘到皮肤上。之后，将感染伯氏疏螺旋体菌株Pra1或Pra4或阿氏疏螺旋体菌株IS1的两只或三只蓖子硬蜱若虫应用于每只小鼠并且允许其附着并进食，直到它们完全饱胀并掉落。每天监测每只单独的蜱的进食状态。在最终读出中仅包括从中收集到至少一只完全-或几乎完全进食的蜱的那些小鼠。
小鼠的处死和材料的收集
分别在针攻击或蜱攻击之后四周或六周，通过颈脱位法分别处死小鼠。通过眼窝出血法收集血液并且制备最终的血清，并且将所述血清用于VlsE ELISA和/或蛋白质印迹以确定感染的状态。此外，从每只小鼠收集膀胱，并且提取DNA并使其经受用于鉴别疏螺旋体的定量PCR(qPCR)。
使用VlsE的恒定区6(IR6)的ELISA
将源于伽氏疏螺旋体菌株IP90的序列的生物素化25-聚体肽(MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK，SEQ ID NO：59)用于分析(Liang FT、Alvarez AL、Gu Y、Nowling JM、Ramamoorthy R、Philipp MT.An immunodominant conserved region within thevariable domain of VlsE，the variable surface antigen of Borreliaburgdorferi.J Immunol.1999；163：5566-73)。用100μL/孔(1μg/mL)在补充有0.1％Tween的PBS(PBS/0.1T)中的肽涂覆链霉亲和素预涂覆的96-孔ELISA板(Nunc)。在4℃下将所述板孵育过夜。在用所述肽涂覆之后，将所述板用PBS/0.1T洗涤一次。然后在室温(RT)下用100μL/孔的PBS+2％BSA封闭所述板一小时，之后再次用PBS/0.1T洗涤。在PBS+1％BSA中的1∶200和1∶400稀释液下测试攻击后血清(最终血清)与所述肽的反应性。在RT下将板孵育90分钟，之后用PBS/0.1T洗涤三次。然后，每个孔接收50μL与PBS+1％BSA中的HRP(Dako)缀合的1.3μg/mL多克隆兔抗小鼠IgG。然后在RT下将板孵育1小时。在用PBS/0.1T洗涤三次之后，添加ABTS(50μL/孔)作为底物(Sigma-Aldrich)，并且允许颜色显影30分钟。在405nm处测量吸光度。所有血清均测试两次。阴性对照包括PBS而非血清，并且所述板不用所述肽涂覆。将来自小鼠的对于疏螺旋体感染显示为培养阳性的血清用作阳性对照。
DNA提取与纯化
根据制造商的说明使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)对来自每只小鼠的膀胱进行DNA提取和纯化，其中具有以下修改。使用100μL重组蛋白酶K(PCR级别；14-22mg/mL，Roche)将每个膀胱在60℃下消化过夜。以50μL无菌去离子水洗脱DNA，并将其保存在-20℃下。在每次DNA提取和纯化中，作为阴性对照，每十个样品后跟随一个空白纯化柱。
靶向recA的qPCR
针对recA基因设计寡核苷酸引物，其方式为所述寡核苷酸引物可用于qPCR中用于鉴别引起莱姆疏螺旋体病的所有相关疏螺旋体物种(正向引物：CATGCTCTTGATCCTGTTTA，SEQ ID NO：57；反向引物：CCCATTTCTCCATCTATCTC，SEQ ID NO：58)。将recA片段从狭义伯氏疏螺旋体菌株N40克隆到pET28b(+)中，以在每次反应中用作标准。将从小鼠膀胱提取的染色体DNA 1∶4稀释于水中，以便减小用未稀释DNA观察到的基体效应。针对每次实验制备由10μL SSoAdvancedTM Green Supermix、0.3μL每种引物(10μM)和7.4μL水组成的主体混合物。在微量滴定板中将18μL主体混合物与2μL稀释的从膀胱中提取的DNA混合，并且使用CFX96实时PCR检测***(Bio-Rad)扩增所述DNA。使DNA在95℃下持续3分钟，随后进行95℃持续15秒和55℃持续30秒的50次循环进行变性。在扩增之后，制备DNA以用于解链曲线分析，所述解链曲线分析是通过在95℃下持续30秒随后在55℃持续2分钟进行变性来实现的。通过在55℃下孵育5秒(其中每次循环增加0.5℃)并且在95℃下孵育5秒来进行解链曲线分析。在每个板上，包括四组无模板对照(NTC)以及其中模板拷贝数目范围为10至10,000的两份标准曲线。
蛋白质印迹
通过蛋白质印迹分析最终血清与来自属于相应OspA血清型的疏螺旋体的全细胞裂解物的结合。简言之，通过SDS-PAGE在还原条件下使用4％-12％Tris-Glycine ZOOM凝胶(Invitrogen)来分离2.5μg待分析的每种小鼠血清的螺旋体溶解产物。使用Dry印迹***(Invitrogen)将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在5％牛奶中封闭1小时之后，以1∶2000的稀释物添加最终血清并在+4℃下孵育过夜。然后用PBS/0.1T将膜洗涤三次，随后在以1∶10,000稀释的与HRP(Dako)缀合的多克隆兔抗小鼠IgG中孵育1小时。使用AmershamECL PlusTM蛋白质印迹检测试剂(GE Healthcare)和Kodak BioMax胶片(Kodak)使免疫印迹可视化。
感染读出
最终感染读出基于两种单独的方法：检测疏螺旋体特异性抗体的存在(蛋白质印迹和VlsE ELISA)以及检测疏螺旋体DNA的存在(靶向rec4的qPCR)。在其中伯氏疏螺旋体菌株ZS7用于攻击的实验(实验1和2)中，蛋白质印迹与qPCR一起应用。在所有其他实验中，使用VlsE ELISA和qPCR。在两种方法之间存在高度一致性(＞95％)；因此当这两种方法中的至少一种呈阳性时小鼠被认为受到感染。通过费希尔精确检验(双尾)来确定统计显著性。
结果
测试改进的异二聚体组合疫苗抵抗疏螺旋体攻击的保护能力。这些实验的结果总结于表2中。使用以下疏螺旋体攻击免疫的小鼠：狭义伯氏疏螺旋体(OspA血清型1，菌株ZS7，针攻击，实验1和2或者菌株Pra1或Pra 4，蜱攻击，分别为实验3或4和5)、阿氏疏螺旋体(OspA血清型2，菌株IS1，蜱攻击，实验6-9)、伽氏疏螺旋体(OspA血清型5，菌株PHei，针攻击，实验10-13)或伽氏疏螺旋体(OspA血清型6，菌株Ma，针攻击，实验14-17)。在一些实验中，包括其他OspA基抗原，诸如嵌合体组合疫苗或脂化的全长OspA蛋白。使用PBS或与Al(OH)3组合的制剂缓冲液免疫的一个小鼠组用作每个实验中的安慰剂(仅佐剂)对照组。
在表2中总结了来自17次实验的保护数据。在所有实验中，在所有安慰剂组中可见高水平的感染。另外，在接受相应全长OspA蛋白的组中观察到低感染率，但全长OspA血清型6除外，在所述全长OspA血清型6中仅观察到部分感染(实验14至17)。这些结果验证了实验装置和读出方法。
当使用体外生长的狭义伯氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体(OspA血清型5或6)或含有伯氏疏螺旋体或阿氏疏螺旋体的蜱攻击小鼠时，改进的异二聚体组合疫苗以3μg剂量赋予显著的保护(p值＜0.05)。此外，当评估不同免疫剂量的疫苗效力时，施用0.03μg改进的异二聚体组合疫苗并且使用阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体(OspA血清型5或6)攻击小鼠(实验8、9、12、13和16)时，可显示高度显著的保护(p值＜0.01)。总之，改进的异二聚体组合疫苗诱导抵抗三种疏螺旋体物种(伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体)的保护性免疫，所述疏螺旋体物种包括四种临床相关的OspA血清型(1、2、5和6)，如在使用体外生长的螺旋体或感染的蜱用于攻击的小鼠模型中所示。
在使用嵌合体组合疫苗免疫的小鼠中也观察到与由改进的异二聚体组合疫苗赋予的保护相当的抵抗血清型5和6的保护(数据未示出)。
表2.本发明的改进的突变OspA异二聚体组合疫苗抵抗OspA血清型1、血清型2、血清型5和血清型6疏螺旋体攻击的保护能力。以两周的间隔用指定剂量的免疫原或单独的Al(OH)3佐剂免疫小鼠组三次。使用的免疫原是突变OspA异二聚体Lip-S1D1-S2D1、Lip-S4D1-S3hybD1和Lip-S5D1-S6D1的1∶1∶1组合(“改进的异二聚体组合疫苗”)、Lip-嵌合OspA ST1/ST2-His、Lip-嵌合OspA ST5/ST3-His和Lip-嵌合OspA ST6/ST4-His的1∶1∶1组合(“嵌合体组合疫苗”)以及Lip-OspA1-His(来自伯氏疏螺旋体菌株B31的脂化的全长OspA蛋白)或Lip-OspA2-His(来自阿氏疏螺旋体菌株K78的脂化的全长OspA蛋白)、Lip-OspA5-His(来自伽氏疏螺旋体菌株PHei的脂化的全长OspA蛋白)或Lip-OspA6-His(来自伽氏疏螺旋体菌株DK29的脂化的全长OspA蛋白)。最后一次免疫之后两周，使用注射器(伯氏疏螺旋体菌株ZS7、伽氏疏螺旋体菌株PHei或伽氏疏螺旋体菌株Ma)或使用蜱(伯氏疏螺旋体菌株Pra1或Pra4或阿氏疏螺旋体菌株IS1)用指示的疏螺旋体物种s.c.攻击免疫的小鼠。
A通过嵌合体组合疫苗和改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型1OspA疏螺旋体进行的针攻击的保护(一个剂量：3μg)
B通过嵌合体组合疫苗和改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型1OspA疏螺旋体进行的蜱攻击的保护(一个剂量：3μg)
C通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型1OspA疏螺旋体进行的蜱攻击的保护(减少的剂量：3μg和0.3μg)
D通过嵌合体组合疫苗和改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型2OspA疏螺旋体进行的蜱攻击的保护(一个剂量：3μg)
E通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型2OspA疏螺旋体进行的蜱攻击的保护(减少的剂量：0.03μg和0.003μg)
F通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型5OspA疏螺旋体进行的针攻击的保护(一个剂量：3μg)
G通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型5OspA疏螺旋体进行的针攻击的保护(减少的剂量：3μg、0.3μg和0.03μg)
H通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型6OspA疏螺旋体进行的针攻击的保护(一个剂量：3μg)
I通过改进的异二聚体组合疫苗针对使用血清型6OspA疏螺旋体进行的针攻击的保护(减少的剂量：3μg、0.3μg和0.03μg)
P值；费希尔精确检验，双尾，与单独的佐剂组相比，在括号中指示。不显著(n.s.)。
序列
SEQ ID NO：1
S3hybD1：杂合OspA C-末端片段；来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116的位置125-176的氨基酸和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的氨基酸177-274，具有二硫键类型1和在位置233的T
FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：2
法雷斯疏螺旋体(菌株VS116)，OspA aa 125-176
FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGK
SEQ ID NO：3
伽氏疏螺旋体(菌株PBr，血清型3)，OspA aa 177-274，在位置233处具有T，来自全长OspA(SEQ ID NO：8)
TKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：4
法雷斯疏螺旋体(菌株VS116)，OspA
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLVATVDKVELKGTSDKNNGSGTLEGVKDDKSKVKLTISDDLGETKLETFKEDGTLVSRKVNFKDKSFTEEKFNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITEGTVTLSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNPAGNKLEGTAVEIKTLQELKNALK
SEQ ID NO：5
狭义伯氏疏螺旋体(菌株B31，OspA血清型1)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO：6
阿氏疏螺旋体(菌株K78；OspA血清型2)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO：7
伽氏疏螺旋体(菌株PBr，OspA血清型3)，在位置233处具有P(embl登记号X80256.1)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO：8
伽氏疏螺旋体(菌株PBr，OspA血清型3)，在位置233处具有T(embl登记号ACL34827.1)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO：9
巴伐利亚疏螺旋体(菌株PBi，OspA血清型4)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLeLKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO：10
伽氏疏螺旋体(菌株PHei，OspA血清型5)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO：11
伽氏疏螺旋体(菌株DK29，OspA血清型6)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO：12
伽氏疏螺旋体(菌株T25，OspA血清型7)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK
SEQ ID NO：13
疏螺旋体OspA脂化信号
MKKYLLGIGLILALIA
SEQ ID NO：14
疏螺旋体OspB脂化信号
MRLLIGFALALALIG
SEQ ID NO：15
大肠杆菌lpp脂化信号
MKATKLVLGAVILGSTLLAG
SEQ ID NO：16
由来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的OspAN-末端半部分的两个分开的环区域构建的LN1肽接头(aa 65-74和aa 42-53，在位置53处的氨基酸交换：D53S)
GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS
SEQ ID NO：17
来自狭义伯氏疏螺旋体菌株B31(OspA血清型1)的hLFA-1-样序列
GYVLEGTLTAE
SEQ ID NO：18
来自阿氏疏螺旋体菌株K78(OspA血清型2)的非-hLFA-1-样序列
NFTLEGKVAND
SEQ ID NO：19
狭义伯氏疏螺旋体(菌株B31，血清型1)，OspA aa 126-273，具有来自血清型1OspA的置换的hLFA-样序列
FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO：20
阿氏疏螺旋体(菌株K78，血清型2)，OspA aa 126-273
FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO：21
伽氏疏螺旋体(菌株PBr，血清型3)，OspA aa 126-274
FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO：22
巴伐利亚疏螺旋体(菌株PBi，血清型4)，OspA aa 126-273
FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO：23
伽氏疏螺旋体(菌株PHei，血清型5)，OspA aa 126-273
FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO：24
伽氏疏螺旋体(菌株DK29，血清型6)，OspA aa 126-274
FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO：25
伽氏疏螺旋体(菌株T25，血清型7)OspA aa 126-274
FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK
SEQ ID NO：26
具有二硫键类型1的OspA血清型4和OspA血清型3的中间和最终异二聚体融合蛋白的Lip-S4D1-S3hybD1-nt编码序列，大肠杆菌lpp脂化信号，LN1接头序列，包含法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176(SEQ ID NO：2)和伽氏疏螺旋体菌株PBr血清型3的氨基酸177-274(SEQ ID NO：3)的血清型3OspA片段
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAAGTGAGCGAAAAAATTCTGACCCGTAGCAATGGCACCACCCTGGAATATAGCCAGATGACCGATGCAGAAAATGCAACCAAAGCAGTTGAAACCCTGAAAAACGGTATTAAACTGCCTGGTAATCTGGTTGGTGGTAAAACCAAACTGACCGTTACCTGTGGCACCGTTACCCTGAGCAAAAACATTAGCAAAAGCGGTGAAATTACCGTGGCACTGAATGATACCGAAACCACACCGGCAGACAAAAAAACCGGTGAATGGAAAAGCGATACCAGCACCCTGACCATTAGTAAAAATAGCCAGAAAACAAAACAGCTGGTGTTTACCAAAGAAAACACCATTACCGTGCAGAATTATAACCGTGCAGGTAATGCACTGGAAGGTAGTCCGGCAGAAATTAAAGATCTGGCAGAACTGTGTGCAGCCCTGAAATAA
SEQ ID NO：27
Lip-S4D1-S3hybD1-aa：OspA血清型4和OspA血清型3的异二聚体融合蛋白，包含法雷斯疏螺旋体菌株VS116(SEQ ID NO：2)的氨基酸125-176和伽氏疏螺旋体菌株PBr血清型3的氨基酸177-274(SEQ ID NO：3)，具有二硫键类型1，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列，N-末端脂化
LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：28
Lip-S1D1-S2D1-nt：具有二硫键类型1的OspA血清型1和OspA血清型2的中间和最终异二聚体融合蛋白的编码序列，大肠杆菌lpp脂化信号，LN1接头序列，由非-hLFA-1-样序列NFTLEGKVAND置换的OspA血清型1的aa 164-174
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAA
SEQ ID NO：29
Lip-S1D1-S2D1-aa：具有二硫键类型1的OspA血清型1和OspA血清型2的异二聚体融合蛋白，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列，由非-hLFA-1-样序列NFTLEGKVAND置换的OspA血清型1的aa 164-174，N-末端脂化
LIPCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO：30
Lip-S4D1-S3D1-nt：两者均具有二硫键类型1的OspA血清型4和OspA血清型3的中间和最终异二聚体融合蛋白的编码序列，大肠杆菌lpp脂化信号，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAA
SEQ ID NO：31
Lip-S4D1-S3D1-aa：两者均具有二硫键类型1的OspA血清型4和OspA血清型3的异二聚体融合蛋白，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列，N-末端脂化
LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：32
Lip-S5D1-S6D1-nt：两者均具有二硫键类型1的OspA血清型6的中间和最终异二聚体融合蛋白的编码序列，大肠杆菌lpp脂化信号，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO：33
Lip-S5D1-S6D1-aa：两者均具有二硫键类型1的OspA血清型6的异二聚体融合蛋白，用于添加脂质的N-末端CSS，LN1接头序列，N-末端脂化
LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO：34
伯氏疏螺旋体(菌株B31，OspA血清型1)aa 18-273，去除的lpp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：35
阿氏疏螺旋体(菌株K78；OspA血清型2)aa 18-273，去除的lpp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：36
伽氏疏螺旋体(菌株PBr；OspA血清型3)aa 18-274，去除的lpp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：37
巴伐利亚疏螺旋体(菌株PBi；OspA血清型4)aa 18-273，去除的lpp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：38
伽氏疏螺旋体(菌株PHei；OspA血清型5)aa 18-273，去除的1pp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：39
伽氏疏螺旋体(菌株DK29；OspA血清型6)aa 18-274，去除的lpp脂化信号序列(MKATKLVLGAVILGSTLLAG，SEQ ID NO：15)，C-末端His标签(LEHHHHHH)，用于添加脂质的N-末端CSSF
CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：40
嵌合OspA血清型1/血清型2，N-末端脂质，His标记，包括OspB脂化信号序列：MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO：14)，其在加工期间裂解
MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKTNKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITMADGTRLEYTGIKSDGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSMNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：41
嵌合OspA血清型5/血清型3，N-末端脂质，His标记，包括OspB脂化信号序列：MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO：14)，其在加工期间裂解
MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKNGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVMANGTRLEYTDIKSDKTGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSMNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：42
嵌合OspA血清型6/血清型4，N-末端脂质，His标记，包括OspB脂化信号序列：MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO：14)，其在加工期间裂解
MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKNGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGETSEKTIVMANGTRLEYTDIKSDGSGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSMNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH
SEQ ID NO：43
S1D1
FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK
SEQ ID NO：44
S2D1
FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO：45
S3D1
FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：46
S4D1
FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO：47
S5D1
FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO：48
S6D1
FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO：49
S3hybD1(BVA)
FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：50
BVAD1
FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITCGTVTLSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNPAGNKLEGTAVEIKTLQELCNALK
SEQ ID NO：51
S3hybD1(Bsp)：杂合OspA C-末端片段；来自斯柏曼疏螺旋体的氨基酸126-175和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的氨基酸177-274，具有二硫键类型1和在位置233的T
FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO：52
MSPD1
FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKATLTVKCGTVTLSKNIDKSGEVTVALNDTDSTAATKKTGAWDSKTSTLTITVNSKKTKDLVFTKQDTITVQKYDSAGTTLEGSAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO：53
用于16S-23S基因间隔区的正向引物
GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG
SEQ ID NO：54
用于16S-23S基因间隔区的反向引物
GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG
SEQ ID NO：55
用于16S-23S基因间隔区的正向嵌套引物
AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG
SEQ ID NO：56
用于16S-23S基因间隔区的反向嵌套引物
GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA
SEQ ID NO：57
用于疏螺旋体的RecA基因的正向引物
CATGCTCTTGATCCTGTTTA
SEQ ID NO：58
用于疏螺旋体的RecA基因的反向引物
CCCATTTCTCCATCTATCTC
SEQ ID NO：59
来自VlsE的恒定区6(IR6)的25-聚体肽
MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK
SEQ ID NO：60
小鼠抗微生物肽前体
RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE
SEQ ID NO：61
KLK肽
KLKLLLLLKLK
SEQ ID NO：62
用于脂化的N-末端肽
CKQN
SEQ ID NO：63
5’-(dIdC)13-3’
dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC
贯穿本申请中所引用的所有文献(包括参考文献、发布的专利、公布的专利申请以及共同-未决的专利申请)的全部内容特此以引用的方式明确并入。

Claims (49)

1.一种多肽，其包含杂合C-末端OspA(疏螺旋体的外表面蛋白A)片段，其中所述杂合C-末端OspA片段从N-末端至C-末端方向由以下各项组成
i)第一OspA部分，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125-176或氨基酸126-175组成，它不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段，以及
ii)第二OspA部分，其由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ ID NO：8)的氨基酸176-274或最优选氨基酸177-274组成，其中所述第二OspA片段是突变的并且是胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中所述第二OspA片段的所述位于位置182处的半胱氨酸与所述位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且
其中所述氨基酸和所述半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述杂合C-末端OspA片段由来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：1)。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述杂合C-末端OspA片段由来自斯柏曼疏螺旋体的氨基酸126-175和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQID NO：51)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述第二OspA部分与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274相同，但与其不同之处在于用脯氨酸残基取代伽氏疏螺旋体菌株PBr野生型OspA的氨基酸233处的苏氨酸残基。
5.一种多肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或者由其组成。
6.一种多肽，其包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列或者由其组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与通过针对如SEQ ID NO：31所定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白产生的抗体引起的荧光强度相比，所述多肽实现荧光强度的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述荧光强度通过流式细胞术测量并且通过在小鼠中用所述多肽免疫三次后产生的抗体经由与血清型3疏螺旋体的表面结合来引起，具体地其中所述增加可如实施例3中所述测定。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中与如SEQ ID NO：31所定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白相比，所述多肽或包含所述多肽的构建体显示产率的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述产率以毫克/克生物量测量，具体地其中所述增加可如实施例2中所述测定。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其还包含第二C-末端OspA片段；其中所述OspA片段由疏螺旋体OspA蛋白的C-末端结构域组成并且是突变的和胱氨酸稳定的，其中它与所述对应的野生型OspA序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代所述野生型序列位置182处的氨基酸以及通过半胱氨酸取代所述野生型序列位置269处的氨基酸，并且其中在所述OspA片段的所述位于位置182处的半胱氨酸与所述位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且此外其中所述OspA片段在位置123、124或125处开始并且在位置273或274处终止；并且此外其中所述氨基酸和所述半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽
i)其中所述多肽是脂化的或其中所述多肽包含脂化信号，优选大肠杆菌来源的lpp脂化信号MKATKLVLGAVILGSTLLAG(SEQ ID NO：15)；和/或
ii)其中所述多肽包含脂化位点肽，所述脂化位点肽前面是作为脂化位点的N-末端半胱氨酸残基，优选CSS；和/或
iii)其中所述多肽包含在所述杂合C-末端OspA片段与所述第二C-末端OspA片段之间的接头，具体地其中所述接头包含GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS(SEQ ID NO：16)。
11.根据权利要求9或10中任一项所述的多肽，其中所述第二C-末端OspA片段是如权利要求1至8中所述的杂合C-末端OspA片段。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽由Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体(SEQ ID NO：27)组成。
13.一种多肽，其包含SEQ ID NO：27(Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体)的氨基酸序列或者由其组成。
14.一种核酸，其用于编码如权利要求1至13中任一项所述的多肽，其具体地为一种包含SEQ ID NO：26的核酸序列或者由其组成的核酸。
15.一种载体，其包含根据权利要求14所述的核酸分子。
16.一种宿主细胞，其包含如权利要求14所述的核酸或如权利要求15所述的载体，其中所述宿主细胞优选为大肠杆菌。
17.一种用于产生表达如权利要求1至13中任一项所述的多肽的细胞的方法，其包括用如权利要求15所述的载体转化或转染适合的宿主细胞。
18.一种用于产生根据权利要求1至13中任一项所述的多肽的方法，其包括表达根据权利要求14所述的核酸。
19.一种用于产生根据权利要求1至13中任一项所述的多肽的方法，其特征在于以下步骤：
a)将编码所述多肽的载体引入到宿主细胞中；
b)使所述宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长；
c)使所述宿主细胞均质化；以及
d)使所述宿主细胞均浆经受纯化步骤。
20.一种抗体或至少其有效部分，其选择性地结合如权利要求1所述的杂合C-末端OspA片段，但并不单独结合所述第一OspA部分和所述第二OspA部分。
21.根据权利要求20所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
22.根据权利要求20或21所述的抗体，其中所述有效部分包括Fab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。
25.一种杂交瘤细胞系，其产生如权利要求20至24中任一项所述的抗体。
26.一种用于产生如权利要求20至24中任一项所述的抗体的方法，其特征在于以下步骤：
a)通过向非人动物施用如权利要求1至13中任一项所述的多肽来起始所述动物中的免疫反应；
b)从所述动物中取出含有抗体的体液；以及
c)通过使所述含有抗体的体液经受另外的纯化步骤来产生所述抗体。
27.一种用于产生如权利要求20至24中任一项所述的抗体的方法，其特征在于以下步骤：
a)通过向非人动物施用如权利要求1至13中任一项所述的多肽来起始所述动物中的免疫反应；
b)从所述动物中取出脾或脾细胞；
c)产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞；
d)选择并克隆对所述多肽特异的杂交瘤细胞；
e)通过培养所述克隆的杂交瘤细胞来产生所述抗体；以及
f)任选地进行另外的纯化步骤。
28.一种药物组合物，其包含
(i)根据权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸和/或如权利要求20至24中任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的药学上可接受的赋形剂。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物另外地包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)和Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物另外地包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)。
31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述组合物另外地包含Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。
32.一种药物组合物，其包含Lip-S1D1-S2D1(SEQ ID NO：29)、Lip-S4D1-S3hybD1(SEQID NO：27)以及Lip-S5D1-S6D1(SEQ ID NO：33)。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括L-甲硫氨酸。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的药物组合物，其还包含来自疏螺旋体或除疏螺旋体之外的病原体的至少一种另外的抗原。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述另外的抗原来自蜱传病原体。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述蜱传病原体选自包括以下各项的组：赫姆斯疏螺旋体、扁虱疏螺旋体、达氏疏螺旋体、宫本疏螺旋体、特里蜱疏螺旋体、立氏立克次体、澳洲立克次体、康诺尔立克次体、瑞士立克次体、帕氏立克次体、土拉弗朗西斯菌、嗜吞噬细胞无形体、腺热埃立希体、查菲埃立克体、米库尔新埃立克体、伯纳特氏立克次氏体以及孤星疏螺旋体、蜱传脑炎病毒(TBEV)、科罗拉多蜱传热病毒(CTFV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、库阿撒鲁尔森林病毒(KFDV)、波瓦森病毒、哈特兰病毒、鄂木斯克出血热病毒(OHFV)以及巴贝西虫某些种。
37.一种试剂盒，其包括如权利要求34至36中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种另外的抗原包含在第二组合物中。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述第二组合物为疫苗，优选为蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗或落基山斑疹热疫苗。
39.根据权利要求28至36中任一项所述的药物组合物，其特征在于其还包含优选地选自由以下各项组成的组的免疫刺激物质：聚阳离子聚合物，特别地是聚阳离子肽；免疫刺激寡脱氧核苷酸(ODN)，特别地是寡(dIdC)13(SEQ ID NO：63)；含有至少两个LysLeuLys基序的肽，特别地是肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：61)；神经活性化合物，特别地是人生长激素；氢氧化铝或磷酸铝、弗氏完全或不完全佐剂或其组合。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述免疫刺激物质为聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸的组合或者为含有至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合，优选为KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：61)和寡(dIdC)13(SEQ ID NO：63)的组合。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述聚阳离子肽为聚精氨酸。
42.根据权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为疫苗。
43.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、如权利要求20至24中任一项所述的抗体或根据权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物，其用作药剂，具体地用作疫苗。
44.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、根据权利要求20至24中任一项所述的抗体或根据权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物，其用于在治疗或预防疏螺旋体感染的方法中，所述疏螺旋体感染具体为狭义伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体感染，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体感染。
45.一种治疗或预防有需要的受试者中的疏螺旋体感染的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、如权利要求20至24中任一项所述的抗体或根据权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物。
46.一种使有需要的受试者免疫的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、如权利要求20至24中任一项所述的抗体或根据权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物。
47.一种用于使动物或人对疏螺旋体生物体引起的感染免疫的方法，其包括以下步骤：向所述动物或人施用有效量的如权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、如权利要求20至24中任一项所述的抗体或如权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述有效量适合于在所述动物或人中引发免疫反应。
48.一种用于在动物或人中刺激针对疏螺旋体生物体的免疫反应的方法，其包括以下步骤：向所述动物或人施用有效量的如权利要求1至13中任一项所述的多肽、根据权利要求14所述的核酸、如权利要求20至24中任一项所述的抗体或如权利要求28至36或39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述有效量适合于在所述动物或人中刺激所述免疫反应。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述疏螺旋体生物体选自包括以下各项的组：伯氏疏螺旋体，具体地为狭义伯氏疏螺旋体；伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体，优选狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体。
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