JP2017503792A - OspAの突然変異体断片、並びにそれに関する方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ボレリア感染症の予防および治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、細胞表層タンパク質A(OspA)のハイブリッドC末端断片を含むポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該ポリペプチドおよび/または該核酸および/または該抗体を含む医薬組成物(特に、ボレリア感染症を治療または予防するための医薬としてまたは方法にて使用するため)、ボレリア感染症を治療または予防するための方法並びに対象を免疫化する方法に関する。
ライムボレリア症またはライム病は、欧州および北アメリカにおいて最も一般的に報告されるダニ媒介性疾患である。該疾患は、節足動物媒介性グラム陰性様スピロヘータ、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト(Borrelia burgdorferi sensu lato;B.burgdorferi s.l.)の感染により引き起こされ、多器官または多組織が含まれ得、皮膚、心臓、筋骨格および神経の障害を生じる。大部分の国において、ライムボレリア症は届出疾患でなく、したがって、年間発生率に関する正確なデータは入手できない。米国では、原因菌はボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト(B.burgdorferi sensu stricto;B.burgdorferi s.s.)であり、ライムボレリア症は北東部、中部大西洋および上方中北部の州に局在化している。2010年には、米国については合計約30,000例のライムボレリア症の症例が、疾病管理予防センター(CDC)に報告されていた。他の情報源からの診断データも考慮に入れた、CDCによる2013年の最新報告では、米国における新規症例の実際の年間数は、300,000件に近いと推定されている(http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819−lyme−disease.html(非特許文献1))。欧州においては、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト(B.burgdorferi s.s.)およびボレリア・ババリエンシス(B.bavariensis)と同様に、B.アフゼリ(B.afzelii)およびB.ガリニ(B.garinii)がライムボレリア症の主な原因菌であり、それらは地理的位置に依存して寄与程度はより小さい。ライムボレリア症の流行は、欧州の異なる国々においてかなり変化し、全体の有病率は西から東へと増加する。欧州の多くの国において、ライムボレリア症の報告された症例数は1990年代初期から増加し(たとえば、チェコ共和国、エストニア、リトアニア;欧州におけるライムボレリア症、WHO報告、2006参照)、また症例の地理的分布も拡大した。
したがって、第1の側面において、本発明は、細胞表層タンパク質A(OspA)のハイブリッドC末端断片を含むポリペプチドに関し、当該ハイブリッドC末端OspA断片は、ボレリア株の2つの異なるOspAのC末端ドメイン融合体からなり、且つ少なくとも1つのジスルフィド結合、例えばシスチンを少なくとも導入することによって、対応する野生型断片とは異なる。特に、ハイブリッドC末端OspA断片は、B.ガリニ(B.garinii)株PBrとは異なる株、例えば、B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116またはB.スピエルマニイ(B.spielmanii)のOspAタンパク質に由来するアミノ酸と、少なくとも1つのジスルフィド結合(シスチン)の導入を有するB.ガリニ(B.garinii)株PBrのOspAタンパク質に由来するアミノ酸との融合体からなる。具体的には、ポリペプチドは、ハイブリッドC末端OspA(ボレリアの細胞表層タンパク質A)断片を含み、当該ハイブリッドC末端OspA断片は、N末端からC末端に向かって、(i)配列番号8を有するB.ガリニ(B.garinii)株PBrの対応断片ではない、ボレリア株に由来するOspAのアミノ酸125〜176またはアミノ酸126〜175からなる第1のOspA部分、および(ii)B.ガリニ(B.garinii)株PBrに由来するOspA(配列番号8)のアミノ酸177〜274またはアミノ酸176〜274(しかし最も好ましくはアミノ酸177〜274)からなる第2のOspA部分からなり、第2のOspA部分は、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号8の位置182の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号8の位置269の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに当該第2のOspA断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31の完全長OspA(配列番号5)の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
(i)配列番号8を有するB.ガリニ(B.garinii)株PBrの対応断片ではない、ボレリア株に由来するOspAのアミノ酸125〜176またはアミノ酸126〜175からなる第1のOspA断片(第1のOspA部分ともいう)、および
(ii)B.ガリニ(B.garinii)株PBrに由来するOspA(配列番号8)のアミノ酸177〜274からなる第2のOspA断片(第2のOspA部分ともいう)からなり、第2のOspA断片は、配列番号8の位置182の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号8の位置269の野生型アミノ酸の置換によって、対応する野生型配列とは異なり、また当該第2のOspA断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、システイン置換の番号付けは、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31の完全長OspA(配列番号5)の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116に由来するアミノ酸125〜176およびボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなるハイブリッドC末端OspA断片(配列番号1)、または
B.スピエルマニイ(B.spielmanii)に由来するアミノ酸126〜175およびボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなるハイブリッドC末端OspA断片(配列番号51)
が挙げられる。
式中、R1、R2またはR3の1つはC14−C20アルキルまたはアルケニルであり、他の各々は独立してC14−C20アルキルまたはC14−C20アルケニルであり、Xは式(I)に示されるシステイン残基に結合されたアミノ酸配列である。より好ましくは、LipとポリペプチドのN末端システインを加えたものは、N−パルミトイル−S−(2RS)−2,3−ビス−(パルミトイロキシ)プロピルシステイン(ここでは「Pam3Cys」と称する)であり、システインのカルボニルCを介して本発明の前記アミノ酸配列に結合される。式(I)において、R1、R2またはR3はパルミトイル部分であろうし、またXはシステイン残基に結合されたアミノ酸配列である。
(a)ハイブリッドC末端OspA断片が、B.ガリニ(B.garinii)株PBrとは異なる株、例えば、B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116またはB.スピエルマニイ(B.spielmanii)に由来する第1のOspAタンパク質のアミノ酸(第1のOspA部分という)と、少なくとも1つのジスルフィド結合(シスチン)の導入および任意に1つ以上のさらなる変異を伴うB.ガリニ(B.garinii)株PBrに由来する第2のOspAタンパク質のアミノ酸(第2のOspA部分という)との融合体からなる、および
(b)ハイブリッドC末端OspA断片中の少なくとも2つの導入されたシステインがジスルフィド結合(すなわち、シスチン)を形成し、当該導入されたシステインが本明細書に記載の通りに、またWO2014/006226の教示に従って導入される
という点で、野生型断片とは異なっており、
当該ハイブリッドC末端OspA断片は、自然に折り畳まれた断片となり、これは、例えばこのハイブリッドC末端OspA断片によるワクチン接種からもたらされる抗体の、例えばマウスにおけるボレリア(Borrelia)抗原型3抗原に対する結合効率によって、例えば本実施例にて記載するように、例えば当該抗体(3回の免疫化後に取得したもの)の抗原型3ボレリア(Borrelia)表面への結合をフローサイトメトリーで試験することによって評価される通りである。
ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結され、また幾つかの場合にはジスルフィド結合によって連結されたアミノ酸の単一の直鎖状重合体である。本発明によれば、ポリペプチドは、1以上の翻訳後修飾を含んでいてもよい;即ち、結合された酢酸、リン酸、脂質または糖鎖、好ましくは脂質、またはグリセロールと共にN末端システインに結合された脂質、より好ましくは1〜3つのC14−C20アルキルまたはアルケニル部分、より好ましくは1〜3つのパルミトイル基、最も好ましくは3つのパルミトイル基(Pam3)のような結合された生化学的官能基を含んでよい。
(i)配列番号8を有するB.ガリニ(B.garinii)株PBrの対応断片ではなく、位置125または126から始まり、位置175または176で終わる、ボレリア株に由来するOspAの第1のC末端部分のアミノ酸からなる第1のOspA部分、および
(ii)第1のC末端部分に連続的に続くOspAの第2のC末端部分からなり(例えば、第1のC末端部分が位置175で終わる場合、第2のC末端部が位置176から継続し、または第1のC末端部分が位置176で終わる場合、第2のC末端部分が位置177から継続する等である。ただし、1つもしくは2つ以上または最大10のアミノ酸が2つのC末端部分の融合領域にて欠失している場合があってもよく、例えば、最も好ましくは、第1のC末端部分が位置175で終わる場合、第2のC末端部分が位置177から継続する)、第2のOspA断片は、配列番号8の位置182の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号8の位置269の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって、対応する野生型配列とは異なり、当該第2のOspA断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、これによりシステイン(「シスチン安定化OspA断片」ともいう)が形成される、第2のOspA部分
からなり、
アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31の完全長OspA(配列番号5)の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
(i)脂質付加されているか、もしくは脂質化シグナル、好ましくは大腸菌(E.coli)由来のlpp脂質化シグナル
を含むポリペプチド、および/または
(ii)脂質化のための部位としてのN末端システイン残基によって生じる脂質化部位ペプチド、好ましくはCSSを含むポリペプチド、および/または
(iii)ハイブリッドC末端OspA断片と第2のシステイン安定化OspA断片との間に、特に、例えば
を含むリンカーを含むポリペプチド
を含んでよい。
pc(%)=[(試験された対象の総数−ボレリアに感染した対象の数)/試験された対象の総数]×100
Δpc=(pc[試料]−pc[対照])
たとえば、Δpc=(pc[結合あり]−pc[結合なし])
位置182+/−3とは、位置179、180、181、182、183、184または185(好ましくは182)の略語である。
位置269+/−3とは、位置266、267、268、269、270、271または272(好ましくは269)の略語である。
が含まれる。脂質部分およびグリセロールは全長の野生型OspAタンパク質に存在するN末端システイン残基に結合されるので、脂質化のためのOspA C末端断片はさらに、システイン残基に続く追加のアミノ酸を含むペプチドを含んでいてよい。たとえば、脂質化シグナル配列に対して直ぐC末端にあるCSSまたはCKQN(配列番号62)のような配列は、脂質化シグナルペプチドの切断の際に、脂質化のためのN末端システイン残基を提供する。この脂質付加されたシステイン含有ペプチドが、本発明の最終的な脂質付加されたポリペプチドに存在する。
を含まない。この目的で、hLFA−1様配列、特にアミノ酸配列
は、もう一つのボレリアsp.のOspAタンパク質由来の相同配列、特に
で置換されてよい。
*S=抗原型(1〜6)(表A−2参照);
S3hyb=B.バライシアナ(B.valaisiana)のアミノ酸125〜176とB.ガリニ(B.garinii)株PBrのアミノ酸177〜274との融合体
D1=ジスルフィド結合型1(位置183+/−3および270+/−3に挿入されたシステイン残基);
Lip=脂質化:グリセロールおよび脂肪酸残基のN末端付加
。リンカーは脂質化部位を含んでもよい。
さらなる側面では、本発明は、本明細書および本発明に関して上記で定義したポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸は、ベクターおよび/または細胞に含まれていてよい。
(a)宿主細胞にポリペプチドをコードするベクターを導入する工程、
(b)前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
(c)前記宿主細胞をホモジナイズする工程、および
(d)前記宿主細胞ホモジネートを精製工程に供する工程。
(a)ポリペプチドをコードする核酸をベクターに導入する工程、
(b)前記ベクターを宿主細胞に導入する工程、
(c)前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
(d)前記宿主細胞をホモジナイズする工程、
(e)相分離によって、脂質相におけるポリペプチドを濃縮する工程、および
(f)ゲル濾過カラムでさらに精製する工程。
(a)ポリペプチドをコードする核酸をベクターに導入する工程、
(b)前記ベクターを宿主細胞に導入する工程、
(c)前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
(d)前記宿主細胞をホモジナイズする工程、
(e)相分離によって、脂質相におけるポリペプチドを濃縮する工程、
(g)ゲル濾過カラムでさらに精製する工程、および
(h)任意に、バッファー交換カラムでさらに処理する工程。
さらなる側面において、本発明の基礎をなす問題は、本発明に関して定義したハイブリッドC末端OspA断片に選択的に結合し、単独の第1のOspA部分および第2のOspA部分に(すなわち他の部分と融合していない場合に)は結合しない抗体またはその少なくとも有効な部分によって解決される。
であることに注目されたい。IC50の測定が、比較される結合剤に関して、一貫した方法(たとえば、固定されたcrefを保持する)において行われるならば、分子相互作用の強度または安定性は、IC50によって評価することができ、およびこの測定は、このテキストの全体にわたってKDまたは見かけ上のKDと同等と判断される。
(a)非ヒト動物に上記で定義したポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
(b)前記動物から抗体を含む体液を取り出す工程、および、
(c)前記抗体を含む体液をさらなる精製工程に供することによって抗体を産生する工程。
(a)非ヒト動物に上記で定義したポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
(b)前記動物から脾臓または脾細胞を取り出す工程、
(c)前記脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生する工程、
(d)前記ポリペプチドに特異的なハイブリドーマ細胞を選択してクローン化する工程、
(e)前記クローン化されたハイブリドーマ細胞の培養によって抗体を産生する工程、および、
(f)任意に、さらなる精製工程を行う工程。
本発明のもう一つの側面は、
(i)本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸および/または本発明に係る抗体、並びに
(ii)任意に、薬学的に許容可能な賦形剤
を含む医薬組成物に関する。
−医薬、特にワクチンとして使用するため、または
−ボレリア(Borrelia)感染症、特にB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.ガリニ(B.garinii)、B.アフゼリ(B.afzelii)、B.アンデルソニ(B.andersoni)、B.ババリエンシス(B.bavariensis)、B.ビセッティ(B.bissettii)、B.ヴァライシアナ(B.valaisiana)、B.ルシタニエ(B.lusitaniae)、B.スピエルマニイ(B.spielmanii)、B.ジャポニカ(B.japonica)、B.タヌキイ(B.tanukii)、B.ツルディ(B.turdi)またはB.シニカ(B.sinica)感染症、好ましくはB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.アフゼリ(B.afzelii)またはB.ガリニ(B.garinii)感染症を治療または予防するための方法にて使用するため
のものであってよい。
、神経刺激性化合物、特にヒト成長ホルモン、水酸化アルミニウム、アルミニウムホスフェート、フロイントの完全アジュバントもしくはフロイントの不完全アジュバントまたはこれらの組み合わせからなる群より好ましくは選択される免疫賦活性物質をさらに含む。好ましくは、免疫賦活性物質は、ポリカチオン性重合体および免疫賦活性デオキシヌクレオチドの、または、少なくとも2つのLysLeuLysモチーフを含むペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドのいずれかの組み合わせ、好ましくは、
およびオリゴ(dIdC)13(配列番号63)の組み合わせである。より好ましくは、前記ポリカチオン性ペプチドは、ポリアルギニンである。
図1は、抗原型1〜抗原型6およびB.バライシアナ(B.valaisiana)OspA(S1D1〜S6D1およびBvaD1)のジスルフィド結合安定化断片、並びにB.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116のアミノ酸125〜176およびジスルフィド結合が導入されたB.ガリニ(B.garinii)株PBrのアミノ酸177〜274からなる本発明の変異融合体OspA断片(S3hybD1)についての静電ポテンシャル等値面を示す。
ハイブリッドOspA ST3 C末端断片を構築する目的
本発明者らの先の出願(WO2014/006226)にて記載したライムボレリア症混合ワクチンは、3つの変異体OspAヘテロ二量体からなった。C末端ドメインに由来する、2つの異なるOspA抗原型(ST)の短い安定化断片を短いリンカーと融合させてヘテロ二量体を形成する。3つのヘテロ二量体は、OspA ST1−ST2、ST4−ST3およびST5−ST6からなる。ヘテロ二量体の免疫原性を改善するために、脂質化のためのシグナル配列が、リポタンパク質である成熟した完全長OspAの類似体に付加される。
安定化させた単量体の比較構造調査をインシリコで行い、OspA結晶構造と比較した単量体モデル間の折り畳みの適合性を明らかにし(PDB:1OSP;LiH,Dunn JJ,Luft BJ,Lawson CL(1997)Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab.Proc Natl Acad Sci 94:3584−3589)、その表面特性をST3型単量体と比較した。結晶構造は、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)B31の抗原型1を表し、そのN末端がネズミ抗体Fab184.1に結合したOspAを示す。6つの短い安定化OspA単量体の相同性構造モデルを、ST1 OspA結晶構造および入手可能なホモロジーモデルから始めて構築し(SwissModel; Kiefer F,Arnold K,Kunzli M,Bordoli L,Schwede T(2009)The SWISS−MODEL Repository and associated resources.Nucleic Acids Res 37:D387−392)、次いで、修正を加えて安定化ジスルフィド結合および必要に応じて配列変化を組み込んだ。(The PyMOL Molecular Graphics System,Version Open−Source,Schrodinger LLC)。
静電ポテンシャルシミュレーションの結果を受けて、B.バライシアナ(B.valaisiana)およびB.ガリニ(B.garinii)に由来する断片OspAタンパク質の実験的融合体(S3hybD1、図1)を含む新しいヘテロ二量体をクローニングした(Lip−S4D1−S3hybD1)。LipS4D1−S3D1と比較して、ヘテロ二量体中(S4D1−S3hybD1)の抗原型3 OspA断片の始めの1/3を変更したことに加えて、OspA ST3の位置233にアミノ酸置換(P233T、未成熟の完全長OspA;配列番号8に従ったアミノ酸命名法)を導入した。
脂質付加されたHisタグなし変異体OspA断片ヘテロ二量体のクローニングおよび発現
融合体OspA単量体であるB.バライシアナ(B.valaisiana)/B.ガリニ(B.garinii)(株VS116/PBr)を、Gene Art(Germany)により大腸菌(E.coli)発現のためにコドン最適化した。N末端終点に付加された脂質化シグナル配列は、大腸菌(E.coli)の主要外膜リポタンパク質Lppに由来し、C末端側に、N末端システインを脂質化させるためのCSSペプチドを隣接させた。変異抗原型4 OspA断片およびハイブリッド抗原型3 OspA断片をリンカー配列「LN1」を介して融合させることにより、改善されたヘテロ二量体構築物を作製した。遺伝子断片を、pET28b(+)ベクター(Novagen,USA)中にクローニングし、安定化したヘテロ二量体をBL21(DE3)細胞(Invitrogen,USA)中で発現させた。細胞を4時間後、遠心分離により収集し、およびペレットを、さらなるプロセシングの前に最大12ヶ月間−70℃にて貯蔵した。
細胞を高圧ホモジナイゼーションによって機械的に破壊し、脂質付加された変異体OspA断片ヘテロ二量体(Lip−S4D1−S3D1およびLip−S4D1−S3hybD1)を、界面活性剤としてTritonX−114を使用して相分離によって脂質相中に濃縮した。その後、希釈された界面活性剤相を非結合様式において作動された陰イオン交換クロマトグラフィー(Q−sepharose;GE Healthcare,United Kingdom)に供した。生じる通過画分をヒドロキシアパタイトカラム(Bio−Rad,USA)にロードし、脂質付加されたタンパク質を直線状の塩勾配によってカラムから溶出した。溶出液を、緩衝液交換のために、非結合様式においてDEAE−セファロースカラム(GE Healthcare)に続いてゲル濾過カラム(Superdex200,GE Healthcare)でのさらなる精製に供した。脂質付加された変異体OspAヘテロ二量体ピークを解析サイズ排除カラムおよびSDS−PAGEに基づいてプールした。濾過滅菌後、精製されたヘテロ二量体を製剤化するまで−20℃にて貯蔵した。
本発明の混合ワクチンの製剤化に関する研究を、安定性を最適化するために実施した。本発明者らの先の出願WO2014/006226に記載されている通り、異なるタイプの緩衝液および安定剤を、水酸化アルミニウムと抗原の組み合わせの種々の濃度にて試験した。pH6.7±0.2にて3つのヘテロ二量体(全タンパク質120μg)のそれぞれ40μg/mL、10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、10mM L−メチオニン、5%スクロース、0.05% Tween20(ポリソルベート20)および0.15%(w/v)水酸化アルミニウムの最適の製剤を決定した。
改善されたヘテロ二量体であるLip−S4D1−S3hybD1は、mg/g生物量を基準にして約4倍高い収率を示し、Lip−S4D1−S3D1と比べて著しく改善した。さらに、1工程少ないクロマトグラフィーの工程で、同等の純度の改善されたヘテロ二量体作製物が得られた(表1を参照)。
マウスの免疫化
雌C3H/HeNマウスを全ての研究について使用した。免疫化の前に、10匹のマウス群から顔面静脈を介して採血し、免疫前血清を調製し、プールした。それぞれ100μLの3回のs.c.免疫化を、2週間の間隔にて施した。各投与量には、1μgの対応するヘテロ二量体タンパク質が含まれた。改善されたヘテロ二量体混合ワクチンについて:Lip−S1D1−S2D1(配列番号29)、Lip−S4D1−S3hybD1(配列番号27)およびLip−S5D1−S6D1(配列番号33);先の発明のヘテロ二量体混合ワクチンについて:Lip−S1D1−S2D1(配列番号29)、Lip−S4D1−S3D1(配列番号31)およびLip−S5D1−S6D1(配列番号33)、ならびにキメラ混合ワクチンについて:Lip−キメラOspA ST1/ST2−His(配列番号40)、Lip−キメラOspA ST5/ST3−His(配列番号41)およびLip−キメラOspA ST6/ST4−His(配列番号42)。全ての混合ワクチンは、0.15%の終濃度にて水酸化アルミニウム(Al(OH)3)で製剤化した。第3の免疫化の1週間後、血液を顔面静脈から回収し、免疫血清を調製した。それぞれの実験において、Al(OH)3で調製したPBSを用いて免疫化した1つの群を負の対照として含んだ(プラセボ群)。全ての動物実験は、オーストリアの法律(BGB1 Nr.501/1989)にしたがって行われ、および「Magistratsabteilung 58」によって承認された。
コーティングバッファー(PBS)で希釈したタンパク質50ng(1μg/mL)で、ELISAプレート(Maxisorp,Nunc,Denmark)をウェルごとにコーティングし、4℃で16〜72時間インキュベートした。コーティング抗原は、C末端Hisタグ付き完全長の脂質付加されたOspA ST1〜6であった。コーティングバッファーを捨て、ブロッキングバッファー100μL(1%BSA、0.5%Tween−20、PBS)を加え、周囲温度にて1〜2時間インキュベートした。プレートをPBST(0.1%Tween−20、PBS)300μL(オーバーフロー)で3回洗浄した。5倍希釈の血清をブロッキングバッファーで作製し、50μLを各ウェルに加え、周囲温度にて1時間インキュベートした。プレートをPBST 300μL(オーバーフロー)で3回洗浄した。二次抗体(セイヨウワサビペルオキシダーゼ[HRP]結合ウサギ抗マウスIgG、DAKO,Denmark)をブロッキングバッファーで1:2000に希釈し、50μLを各ウェルに加え、周囲温度にて1時間インキュベートした。プレートをPBST 300μL(オーバーフロー)で3回洗浄した。ABTS(2,2'−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)、Sigma−Aldrich,USA)をHRP基質として使用し、ABTS 50μLを各ウェルに加え、暗所で周囲温度にて15分間インキュベートした。1%SDS 50μLの添加により反応を停止させ、吸光度を405nmで読み取った。ブランクの吸光度が0.1未満だったプレートを有効とした。最小希釈が1.0を越える吸光度を有し、最大希釈が0.1を下回るサンプルを有効とした。これらの基準を満たしたとき、最大半値力価を求めた。最大半値力価は、最大希釈と最小希釈の間の平均吸光度に対応する希釈の逆数である。
スピロヘータ(1×106)を同等の容積の4%パラホルムアルデヒドと混合し、96ウェルプレート(Nunclon 96U,Nunc)中で室温にて2時間インキュベートした。プレートを2,000gにて5分間遠心分離し、および上清を廃棄した。細胞を、2% BSA(HBSS−B)を伴うHBSS 150μLで洗浄し、上のように遠心分離し、および上清を廃棄した。マウス血清を、35分間56℃にてインキュベートすることによって熱不活性化した。熱不活化血清をHBSS−B中で希釈し、Costar spin−X遠心管フィルター(0.22μm、Corning,USA)を使用して、4,000gにて3分間、遠心分離することによって滅菌濾過した。スピロヘータを血清100μLに溶解し、および室温にて45分間インキュベートした。プレートを15分間、2,000gにて遠心分離し、および上清を廃棄した。細胞をHBSS−B 150μLで一度洗浄し、次いで、HBSS−B 100μL中に再懸濁した。二次抗体(PEとコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG、Beckman Coulter,USA)1マイクロリットルを、細胞に添加し、および暗所において45分間、室温にてインキュベートした。スピロヘータをHBSS−B 150μLで一度洗浄し、次いで、2.5μM SYTO−17 DNA色素を含むHBSS 200μL中に再懸濁し、暗所で10分間、室温にてインキュベートした。染色されたスピロヘータを2,000gにて5分間、遠心分離することによって沈渣させ、その後、HBSS 200μL中に再懸濁した。標識されたスピロヘータを、FC500(Beckman Coulter)フローサイトメーターで測定し、SYTO−17陽性イベントについてゲートした。
2つの異なるOspAヘテロ二量体製剤(「hetの組み合わせ」および「改善されたhetの組み合わせ」)並びにOspAキメラ組み合わせ(「キメラの組み合わせ」)のマウスでの免疫原性について試験した。完全長OspA(コーティング抗原)に対する反応性及び異なるOspA抗原型(ST1〜ST6)を発現するボレリア(Borrelia)株への表面結合について、高度免疫血清をELISAにより分析した。
マウスの免疫化
雌C3H/HeN(H−2k)マウスを全ての研究について使用した(Janvier,France)。それぞれの曝露の前に、8週齢のマウス5匹の群を尾静脈を介して血を取り、免疫前血清を調製し、およびプールした。3回の100μLの皮下(s.c.)免疫化を、表2に示す用量で2週間の間隔にて施した。改善されたヘテロ二量体混合ワクチンとキメラ混合ワクチンの両方は、実施例3に記載するように、3つのタンパク質を1:1:1の比で含んだ。全ての製剤は、0.15%の終濃度にて水酸化アルミニウム(Al(OH)3)を含んだ。第3の免疫化の1週間後、血液を収集し、および高度免疫血清を調製した。それぞれの実験において、Al(OH)3単独(製剤バッファーまたはPBS)を注入した1つの群を陰性対照として含み、マウスの1つの群を適切なOspA抗原型に由来する野生型完全長脂質付加OspAタンパク質(B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株B31(OspA抗原型1、配列番号34)、B.アフゼリ(B.afzelii)株K78(OspA抗原型2、配列番号35)、B.ガリニ(B.garinii)株PHei(OspA抗原型5、配列番号38)またはB.ガリニ(B.garinii)株DK29(OspA抗原型6、配列番号39))で免疫化し、陽性対照群とした。全ての動物実験は、オーストリアの法律(BGB1 Nr.501/1989)にしたがって行われ、および「Magistratsabteilung 58」によって承認された。
最後の免疫化の2週後に、マウスを増殖培地(BSKII)100μL中で希釈したスピロヘータにs.c.にて曝露した。曝露には、OspA抗原型1(実験1および2)を発現するB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株ZS7、OspA抗原型5(実験10〜13)を発現するB.ガリニ(B.garinii)株PHei、またはOspA抗原型6(実験14〜17)を発現するB.ガリニ(B.garinii)株Maを用いた。曝露用量は、株依存的であり、ID50の決定のための曝露実験によって評価した個々の株の病原性に依存した。針曝露実験のために使用された用量は、ID50の20〜50倍の範囲であった。各曝露の前に、OspA発現をフローサイトメトリーにより確認した(実施例3を参照)。マウスの曝露は、80%を越える細胞がOspA発現について陽性であった培地でのみ行った。
最後の免疫化の2週後に、OspA抗原型1を発現するB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株Pra4(実験3)、OspA抗原型1を発現するB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株Pra1(実験4および5)またはOspA抗原型2を発現するB.アフゼリ(B.afzelii)(実験6〜9)を宿すダニにマウスを曝露した。免疫化されたマウスのダニ感染を容易にするために、それぞれのマウスの背中の毛を、Veet(登録商標)クリーム(Reckitt Benckiser,United Kingdom)で取り除き、および小さな換気された容器をスーパーグルー(Pattex,Germany)で皮膚に接着した。その後、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株Pra1もしくはPra4またはB.アフゼリ(B.afzelii)株IS1に感染した2〜3匹のI.リシヌス(I.ricinus)の若虫をマウスごとに付け、これらが完全に充血し外れるまで、付着し吸血できるようにした。吸血状態は、それぞれの個々のダニについて毎日モニターした。少なくとも1つの完全にまたはほぼ完全に吸血したダニを収集したマウスのみを最終的な読み出しに含んだ。
針曝露またはダニ曝露の4週後または6週後それぞれで、マウスを頚椎脱臼によって屠殺した。血液を眼窩出血によって収集し、最終血清を調製し、感染状態を決定するためにVlsE ELISAおよび/またはウェスタンブロットを使用した。加えて、それぞれのマウスから膀胱を収集し、DNAを抽出し、およびボレリア(Borrelia)の同定のために定量的PCR(qPCR)に供した。
B.ガリニ(B.garinii)株IP90の配列から由来するビオチン化された25アミノ酸長ペプチド
を、解析に使用した(Liang FT,Alvarez AL,Gu Y,Nowling JM,Ramamoorthy R,Philipp MT.An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi.J Immunol. 1999;163:5566−73)。ストレプトアビジンでプレコートされた96ウェルELISAプレート(Nunc)を、0.1% Tween(PBS/0.1T)で補充されたPBS中のペプチド100μL/ウェル(1μg/mL)で被覆した。プレートを4℃にて一晩インキュベートした。ペプチドでコーティング後、プレートをPBS/0.1Tで一度洗浄した。次いで、PBS/0.1Tで再び洗浄される前に、プレートをPBS+2%BSA100μL/ウェルで室温(RT)にて1時間ブロックした。ペプチドに対する曝露後血清(最終血清)の反応性をPBS+1%のBSA中の1:200および1:400の希釈にて試験した。プレートをPBS/0.1Tで3回洗浄する前にRTにて90分間インキュベートした。次いで、それぞれのウェルに、PBS+1%BSA中のHRP(Dako)にコンジュゲートされた50μLのポリクローナルウサギ抗マウスIgG1.3μg/mLを入れた。次いで、プレートをRTにて1時間インキュベートした。PBS/0.1Tで3回洗浄後、ABTS(50μL/ウェル)を基質(Sigma−Aldrich)として添加し、および30分間発色できるようにした。吸光度を、405nmにて測定した。全ての血清を二つ組で試験した。負の対照は、血清の代わりにPBS、並びにペプチドで被覆されていないプレートを含んだ。ボレリア感染陽性培養であることを示したマウスからの血清を正の対照として使用した。
それぞれのマウスの膀胱を、DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)を以下の変更を加えて製造業者の説明書に従って使用し、DNA抽出および精製に供した。100μLの組換えプロテイナーゼK(PCR等級、14〜22mg/mL、Roche)を用いて、各膀胱を一晩60℃にて消化した。DNAを50μL脱イオン滅菌水中で溶出し、−20℃にて貯蔵した。それぞれのDNA抽出および精製において、陰性対照として、各10番目のサンプルの後に1つの空の精製カラムを続けた。
オリゴヌクレオチドプライマーは、ライムボレリア症を生じさせる全ての関連したボレリア(Borrelia)の種の同定のためのqPCRにおいて使用することができる形で、recA遺伝子に対して設計した
。recA断片をそれぞれの反応における標準として使用するために、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株N40からpET28b(+)へクローニングした。マウスの膀胱から抽出された染色体DNAを、希釈されていないDNAで観察されるマトリックス効果を減少させるために水中に1:4に希釈した。SSoAdvanced(商標)SYBR(登録商標)Green Supermixからなるマスター混合物10μL、それぞれのプライマー(10μM)0.3μLおよび水7.4μLをそれぞれの実験のために調製した。マスター混合物18μLをマイクロタイタープレート中で、膀胱から抽出された希釈DNA 2μLと混合し、CFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio−Rad)を使用してDNAを増幅した。DNAを95℃にて3分間変性させ、続いて95℃にて15秒間および55℃にて30秒間の50サイクルを行った。増幅後、DNAを、95℃にて30秒間、続いて55℃にて2分間の変質によって融解曲線解析のために調製した。融解曲線解析は、55℃にて5秒間、サイクルあたり0.5℃増大、および95℃にて5秒間のインキュベーションによって、行った。それぞれのプレートにおいて、4つのノーテンプレート対照(NTC)を含め、2つ組の標準曲線に10〜10,000の範囲であるテンプレートコピー数を含めだ。
対応するOspA抗原型に属するボレリアの全細胞溶解物に対する最終血清の結合をウェスタンブロットにより分析した。簡潔に述べれば、分析するマウス血清当たり2.5μgのスピロヘータ溶解物を、4〜12%Tris−Glycine ZOOMゲル(Invitrogen)を用いて、還元条件下でSDS−PAGEにより分離した。iBlot(登録商標)ドライブロッティングシステム(Invitrogen)を用いて、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。5%ミルクで1時間ブロッキングした後、最終血清を1:2000の希釈で添加し、+4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をPBS/0.1Tで3回洗浄し、1:10,000に希釈したHRP結合ポリクローナルウサギ抗マウスIgG(Dako)で1時間インキュベーションした。Amersham ECL Plus(商標)ウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)およびKodak BioMaxフィルム(Kodak)を用いて免疫ブロットを可視化した。
最終感染読み出しは、ボレリア(Borrelia)特異性抗体の存在(ウェスタンブロットおよびVlsE ELISA)並びにボレリア(Borrelia)DNAの存在(recAをターゲットするqPCR)を検出する2つの異なる方法に基づいた。曝露にB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株ZS7を用いた実験(実験1および2)では、ウェスタンブロットとqPCRとを実施した。他の全ての実験では、VlsE ELISAおよびqPCRを用いた。2つの方法の間には高い一致性があり(>95%)、したがって、2つの方法のうちの少なくとも1つが陽性であったとき、マウスが感染したとみなした。フィッシャーの正確確率検定(両側)により統計的有意性を求めた。
ボレリア(Borrelia)曝露に対する保護能力について、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンを試験した。これらの実験の結果を表2に要約する。免疫化されたマウスを、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.(OspA抗原型1、株ZS7、針曝露、実験1および2または株Pra1もしくはPra4、ダニ曝露、それぞれ実験3もしくは4および5)、B.アフゼリ(B.afzelii)(OspA抗原型2、株IS1、ダニ曝露、実験6〜9)、B.ガリニ(B.garinii)(OspA抗原型5、株PHei、針曝露、実験10〜13)またはB.ガリニ(B.garinii)(OspA抗原型6、株Ma、針曝露、実験14〜17)に曝露した。いくつかの実験では、キメラ混合ワクチンまたは脂質付加された完全長OspAタンパク質などの他のOspA系抗原を含めた。各実験にて、Al(OH)3を混合したPBSまたは製剤バッファーで免疫化した一群のマウスをプラセボ(アジュバント単独)対照群とした。
マウス群を3回、2週間の間隔にて、示した用量の免疫原またはAl(OH)3アジュバント単独で免疫化した。使用した免疫原は、変異体OspAヘテロ二量体であるLip−S1D1−S2D1、Lip−S4D1−S3hybD1およびLip−S5D1−S6D1の1:1:1の組み合わせ(「改善されたヘテロ二量体混合ワクチン」)、Lip−キメラOspA ST1/ST2−His、Lip−キメラOspA ST5/ST3−HisおよびLip−キメラOspA ST6/ST4−Hisの1:1:1の組み合わせ(「キメラ混合ワクチン」)、並びにLip−OspA1−His(B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株B31由来の脂質付加された完全長OspAタンパク質)、Lip−OspA2−His(B.アフゼリ(B.afzelii)株K78由来の脂質付加された完全長OspAタンパク質)、Lip−OspA5−His(B.ガリニ(B.garinii)株PHei由来の脂質付加された完全長OspAタンパク質)またはLip−OspA6−His(B.ガリニ(B.garinii)株DK29由来の脂質付加された完全長OspAタンパク質)とした。最後の免疫化の2週後、シリンジを用いて(B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株ZS7、B.ガリニ(B.garinii)株PHeiまたはB.ガリニ(B.garinii)株Ma)またはダニを用いて(B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)株Pra1もしくはPra4またはB.アフゼリ(B.afzelii)株IS1)、免疫化マウスを記載のボレリア種にs.c.にて曝露した。
アジュバント単独群と比較した、P値、フィッシャーの正確確率検定(両側)を括弧内に示す。(n.s.)は有意差なし。
配列番号1
S3hybD1:ハイブリッドOspA C末端断片;ジスルフィド結合型1および位置233にTを伴う、ボレリア・バライシアナ(Borrelia valaisiana)株VS116由来のアミノ酸の位置125〜176およびボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBr由来のアミノ酸177〜274
B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31に由来するOspAのN末端半分の2つの別々のループ領域(aa65〜74およびaa42〜53、位置53でのアミノ酸交換:D53S)から構築したLN1ペプチドリンカー
Lip−S4D1−S3hybD1−nt:ジスルフィド結合型1、大腸菌(E.coli)lpp脂質化シグナル、LN1リンカー配列、B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116のアミノ酸125〜176(配列番号2)およびB.ガリニ(B.garinii)株PBr、抗原型3のアミノ酸177〜274(配列番号3)を含む抗原型3 OspA断片を伴う、OspA抗原型4およびOspA抗原型3の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
Lip−S4D1−S3hybD1−aa:ジスルフィド結合型1、脂質付加のためのN末端CSS、LN1リンカー配列、N末端脂質化を伴う、B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116のアミノ酸125〜176(配列番号2)およびB.ガリニ(B.garinii)株PBr、抗原型3のアミノ酸177〜274(配列番号3)を含む、OspA抗原型4およびOspA抗原型3のヘテロ二量体融合タンパク質
Lip−S1D1−S2D1−nt:ジスルフィド結合型1、大腸菌(E.coli)lpp脂質化シグナル、LN1リンカー配列、非hLFA−1様配列NFTLEGKVANDによって置換されたOspA抗原型1のaa164−174を伴うOspA抗原型1およびOspA抗原型2の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
Lip−S1D1−S2D1−aa:ジスルフィド結合型1、脂質付加のためのN末端CSS、LN1リンカー配列、非hLFA−1様配列NFTLEGKVANDによって置換されたOspA抗原型1のaa164〜174、N末端脂質化を伴う、OspA抗原型1およびOspA抗原型2のヘテロ二量体融合タンパク質
Lip−S4D1−S3D1−nt:どちらもジスルフィド結合型1、大腸菌(E.coli)lpp脂質化シグナル、脂質の付加のためのN末端CSS、LN1リンカー配列を伴う、OspA抗原型4および3の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
Lip−S4D1−S3D1−aa:どちらもジスルフィド結合型1、脂質の付加のためのN末端CSS、LN1リンカー配列、N末端脂質化を伴う、OspA抗原型4および3のヘテロ二量体融合タンパク質
Lip−S5D1−S6D1−nt:どちらもジスルフィド結合型1、大腸菌(E.coli)lpp脂質化シグナル、脂質付加のためのN末端CSS、LN1リンカー配列を伴う、OspA抗原型6の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)(株B31、OspA抗原型1)aa18〜273、lpp脂質化シグナル配列
除去、C末端Hisタグ(LEHHHHHH)、脂質付加のためのN末端CSSF
B.ババリエンシス(B.bavariensis)(株PBi、OspA抗原型4)aa18〜273、lpp脂質化シグナル配列
除去、C末端Hisタグ(LEHHHHHH)、脂質付加のためのN末端CSSF
S3hybD1(Bsp):ハイブリッドOspA C末端断片、ボレリア・スピエルマニイ由来のアミノ酸126〜175およびジスルフィド結合1型および位置233にTを伴うボレリア・ガリニ株PBr由来のアミノ酸177〜274
脂質化のためのN末端ペプチド
CKQN
Claims (49)
- ハイブリッドC末端OspA(ボレリアの細胞表層タンパク質A)断片を含むポリペプチドであって、前記ハイブリッドC末端OspA断片が、N末端からC末端に向かう方向で、
(i)配列番号8を有するB.ガリニ(B.garinii)株PBrの対応断片ではない、ボレリア株に由来するOspAのアミノ酸125〜176またはアミノ酸126〜175からなる第1のOspA部分、および
(ii)B.ガリニ(B.garinii)株PBrに由来するOspA(配列番号8)のアミノ酸176〜274または最も好ましくはアミノ酸177〜274からなる第2のOspA部分
からなり、前記第2のOspA断片が、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号8の位置182の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号8の位置269の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに前記第2のOspA断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、
前記アミノ酸および前記システイン置換の番号付けは、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31の完全長OspA(配列番号5)の対応するアミノ酸の番号付けに従う、ポリペプチド。 - 前記ハイブリッドC末端OspA断片が、B.バライシアナ(B.valaisiana)株VS116に由来するアミノ酸125〜176およびボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなる(配列番号1)、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ハイブリッドC末端OspA断片が、B.スピエルマニイ(B.spielmanii)に由来するアミノ酸126〜175およびボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなる(配列番号51)、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第2のOspA部分が、ボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274と同一であるが、ボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)株PBrの野生型OspAのアミノ酸233のスレオニン残基がプロリン残基で置換されている点でそれとは異なっている、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 配列番号31に記載のLip−S4D1−S3D1ヘテロ二量体タンパク質に対して産生された抗体によって誘発された蛍光強度と比較して、前記ポリペプチドを用いたマウスでの3回の免疫化後に産生された抗体によって抗原型3ボレリア(Borrelia)表面への結合により誘発されかつフローサイトメトリーで測定した蛍光強度において、少なくとも1.5倍増加、好ましくは少なくとも2倍増加、より好ましくは少なくとも3倍増加、さらにより好ましくは少なくとも4倍増加、さらにより好ましくは少なくとも5倍増加、最も好ましくは少なくとも10倍増加をもたらし、特に、前記増加は、実施例3に記載するように決定することができる、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む構築物が、配列番号31に記載のLip−S4D1−S3D1ヘテロ二量体タンパク質と比較して、生物量1グラム当たりのミリグラムで測定した作製収率において、少なくとも1.5倍増加、好ましくは少なくとも2倍増加、より好ましくは少なくとも3倍増加、さらにより好ましくは少なくとも4倍増加、さらにより好ましくは少なくとも5倍増加、最も好ましくは少なくとも10倍増加を示し、特に、前記増加は、実施例2に記載するように決定することができる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 第2のC末端OspA断片をさらに含み、前記OspA断片が、ボレリア(Borrelia)のOspAタンパク質のC末端ドメインからなり、前記OspA断片が、対応する野生型OspA配列とは少なくとも野生型配列の位置182のアミノ酸のシステインでの置換および野生型配列の位置269のアミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに前記OspA断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、さらに、前記OspA断片が、位置123、124または125から始まり、位置273または274で終わり、さらに、前記アミノ酸および前記システイン置換の番号付けは、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.株B31の完全長OspA(配列番号5)の対応するアミノ酸の番号付けに従う、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記第2のC末端OspA断片が、請求項1〜8のいずれか1項に記載のOspAのハイブリッドC末端断片である、請求項9または10に記載のポリペプチド。
- ヘテロ二量体であるLip−S4D1−S3hybD1(配列番号27)からなる、請求項9〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号27のアミノ酸配列(ヘテロ二量体であるLip−S4D1−S3hybD1)を含むか、または配列番号27のアミノ酸配列(ヘテロ二量体であるLip−S4D1−S3hybD1)からなる、ポリペプチド。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸であって、特に、配列番号26の核酸配列を含むか、または配列番号26の核酸配列からなる、前記核酸。
- 請求項14に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14に記載の核酸または請求項15に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは大腸菌(E.coli)である、前記宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現する細胞を産生するための方法であって、請求項15に記載のベクターで適切な宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトする工程を含む、方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、請求項14に記載の核酸分子を発現させる工程を含む、前記方法。
- 以下の工程によって特徴づけられる、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生するための方法:
(a)前記ポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入する工程、
(b)前記ポリペプチドを発現させることができる条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程、
(c)前記宿主細胞をホモジナイズする工程、および
(d)前記宿主細胞ホモジネートを精製工程に供する工程。 - 請求項1に記載のハイブリッドC末端OspA断片に選択的に結合するが、単独の前記第1のOspA部分および前記第2のOspA部分には結合しない、抗体または少なくともその有効な部分。
- モノクローナル抗体である、請求項20に記載の抗体。
- 前記有効な部分が、Fab断片、F(ab)断片、F(ab)N断片、F(ab)2断片またはFv断片を含む、請求項20または21に記載の抗体。
- キメラ抗体である、請求項20〜22のいずれか1項に記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項20〜23のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
- 以下の工程によって特徴づけられる、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体を産生するための方法:
(a)非ヒト動物に請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
(b)前記動物から抗体を含む体液を取り出す工程、および、
(c)前記抗体を含む体液をさらなる精製工程に供することによって抗体を産生する工程。 - 以下の工程によって特徴づけられる、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体を産生するための方法:
(a)非ヒト動物に請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
(b)前記動物から脾臓または脾細胞を取り出す工程、
(c)前記脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生する工程、
(d)前記ポリペプチドについて特異的なハイブリドーマ細胞を選択してクローン化する工程、
(e)前記クローン化されたハイブリドーマ細胞の培養によって抗体を産生する工程、および、
(f)任意に、さらなる精製工程を行う工程。 - (i)請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸および/または請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体、並びに
(ii)任意に、薬学的に許容可能な賦形剤
を含む、医薬組成物。 - Lip−S1D1−S2D1(配列番号29)およびLip−S5D1−S6D1(配列番号33)をさらに含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- Lip−S1D1−S2D1(配列番号29)をさらに含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- Lip−S5D1−S6D1(配列番号33)をさらに含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- Lip−S1D1−S2D1(配列番号29)、Lip−S4D1−S3hybD1(配列番号27)およびLip−S5D1−S6D1(配列番号33)を含む、医薬組成物。
- 前記薬学的に許容される賦形剤はL−メチオニンを含む、請求項28〜32のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ボレリア(Borrelia)またはボレリア(Borrelia)以外の病原体由来の少なくとも1つのさらなる抗原をさらに含む、請求項28〜33のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記さらなる抗原は、ダニ媒介の病原体に由来する、請求項34に記載の医薬組成物。
- 前記ダニ媒介の病原体は、ボレリア・ヘルムシイ(Borrelia hermsii)、ボレリア・パルケリ(Borrelia parkeri)、ボレリア・ヅットニ(Borrelia duttoni)、ボレリア・ミヤモトイ(Borrelia miyamotoi)、ボレリア・ツリカタエ(Borrelia turicatae)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)、リケッチア・アウストラリス(Rickettsia australis)、リケッチア・コノリ(Rickettsia conorii)、リケッチア・ヘルベチカ(Rickettsia helvetica)、リケッチア・パルケリ(Rickettsia parkeri)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum)、エーリキア・センネツ(Ehrlichia sennetsu)、エーリキア・シャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)、ネオエーリキア・ミクレンシス(Neoehrlichia mikurensis)、コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetii)およびボレリア・ロネスタリ(Borrelia lonestari)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、コロラドダニ熱ウイルス(CTFV)、クリミアコンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ポワッサンウイルス、ハートランドウイルス、オムスク出血熱ウイルス(OHFV)およびバベシア(Babesia)属種を含む群から選択される、請求項35に記載の医薬組成物。
- 請求項34〜36のいずれか1項に記載の医薬組成物を含み、前記少なくとも1つのさらなる抗原が第2の組成物中に含まれる、キット。
- 前記第2の組成物がワクチン、好ましくはダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチンまたはロッキー山紅斑熱ワクチンである、請求項37に記載のキット。
- 前記ポリカチオン性ペプチドは、ポリアルギニンである、請求項40に記載の医薬組成物。
- ワクチンである、請求項28〜36または39〜41のいずれか1項の医薬組成物。
- 医薬としての、特にワクチンとしての使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ボレリア(Borrelia)感染症、特にB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.ガリニ(B.garinii)、B.アフゼリ(B.afzelii)、B.アンデルソニ(B.andersoni)、B.ババリエンシス(B.bavariensis)、B.ビセッティ(B.bissettii)、B.ヴァライシアナ(B.valaisiana)、B.ルシタニエ(B.lusitaniae)、B.スピエルマニイ(B.spielmanii)、B.ジャポニカ(B.japonica)、B.タヌキイ(B.tanukii)、B.ツルディ(B.turdi)またはB.シニカ(B.sinica)感染症、好ましくはB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.アフゼリ(B.afzelii)またはB.ガリニ(B.garinii)感染症を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは請求項39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは請求項39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象におけるボレリア感染症を治療または予防するための方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは請求項39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象を免疫化する方法。
- ボレリア(Borrelia)生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化するための方法であって、前記動物またはヒトに、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは請求項39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、前記有効な量が、前記動物またはヒトにおける免疫応答を誘発するために適切である、方法。
- ボレリア(Borrelia)生物に対する動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するための方法であって、前記動物またはヒトに請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項14に記載の核酸、請求項20〜24のいずれか1項に記載の抗体または請求項28〜36もしくは請求項39〜41のいずれか1項に記載の医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、前記有効な量が、前記動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するために適切である、方法。
- ボレリア(Borrelia)生物は、B.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)、特にB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.ガリニ(B.garinii)、B.アフゼリ(B.afzelii)、B.アンデルソニ(B.andersoni)、B.ババリエンシス(B.bavariensis)、B.ビセッティ(B.bissettii)、B.ヴァライシアナ(B.valaisiana)、B.ルシタニエ(B.lusitaniae)、B.スピエルマニイ(B.spielmanii)、B.ジャポニカ(B.japonica)、B.タヌキイ(B.tanukii)、B.ツルディ(B.turdi)またはB.シニカ(B.sinica)を、好ましくはB.ブルグドルフェリ(B.burgdorferi)s.s.、B.アフゼリ(B.afzelii)またはB.ガリニ(B.garinii)を含む群から選択される、請求項47または48に記載の方法。
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