附图简述
图1是用于制备脂质化OspA嵌合体构建体的示意性概述。
图2是lipB sOspA 1/2251的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3示出lipB sOspA 1/2251的核苷酸(SEQ ID NO:1)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)。
图4是lipB sOspA 6/4的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5示出lipB sOspA 6/4的核苷酸(SEQ ID NO:3)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)。
图6是lipB sOspA 5/3的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图7示出lipB sOspA 5/3的核苷酸(SEQ ID NO:5)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:6)。
图8描绘了优化密码子的使用用于高水平表达。
图9示出在脂质化构建体与非脂质化构建体之间的序列差异。
图10是T7表达***的描述。
图11是示出来自诱变培养物和非诱变培养物的新型重组OspA蛋白的表达的SDS-PAGE。
图12是质粒pUC18的图谱。
图13是质粒pET30a的图谱。
图14示出用于产生lipB sOspA 5/3Kpn I-Bam HI片段的策略。
图15是凸显lipB sOspA 1/2251中的氨基酸变化(SEQ ID NO:39)的比对和用于引入所述变化的PCR引物序列(SEQ ID NO:21和41)(lipBOspA 1/2mod(SEQ ID NO:38);共有序列(SEQ ID NO:40))。
图16是Blip OspA BPBP/A1与被修饰的分子lipB sOspA 1/2251的OspA序列比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:42)并且下部链是优化序列(SEQ ID NO:43)。注意:未示出序列起始处的三个碱基(CAT);这些碱基形成Nde I位点CATATG的一部分。
图17是Blip OspA KT与被修饰的分子lipB sOspA 6/4的OspA序列的比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:44)并且下部链是优化序列(SEQ ID NO:45)。注意:未示出序列起始处的一个单一的碱基(C);这些碱基形成Nde I位点CATATG的一部分。
图18是Blip OspA 5/3与被修饰的分子lipB sOspA 5/3的OspA序列的比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:46)并且下部链是优化序列(SEQ ID NO:47)。
图19示出在用狭义伯氏疏螺旋体B31菌株攻击之前,在用3ng的OspA 1/2进行免疫的受保护和受感染的动物之中的抗体表面结合和生长抑制测定中的功能性抗OspA反应的分布。曼-惠特尼(Mann-Whitney)p值证明了在受保护与受感染的动物之间的功能性抗体含量的高度显著的差异。
图20示出在用野生蜱虫攻击之前,在用3ng的OspA 1/2进行免疫的受保护和受感染的动物之中的抗体表面结合和生长抑制测定中的功能性抗OspA反应的分布。曼-惠特尼p值证明了在受保护与受感染的动物之间的功能性抗体含量的高度显著的差异。
图21示出在用三个剂量的3-组分嵌合OspA疫苗免疫之后,池集的小鼠血清中的表面结合(平均荧光强度(MFI))和生长抑制(GI-50效价)。检测针对所有六种疏螺旋体属菌株的有效的表面结合和生长抑制,所述六种疏螺旋体属菌株表达与在疫苗中的OspA类型(1至6类型)同源的OspA类型。
图22示出在表面结合测定(SBA)中使用来自用rOspA疫苗的组合进行免疫的单独小鼠的第42天的血清所获得的平均荧光强度(MFI)效价。结果显示多价疫苗中要求所有三种rOspA组分(1/2、6/4以及5/3)以便在C3H小鼠体内诱导针对所有六种菌株的高效价表面结合IgG抗体。2-组分疫苗无法完全覆盖两种缺少的菌株。
图23示出使用来自用rOspA疫苗的组合进行免疫的单独小鼠(10只为一组)的第42天的血清的疏螺旋体属的生长抑制。只有多价疫苗(该疫苗包含所有三种菌株)在大于90%的动物(n=10)中给出大于50%的生长抑制。黑色直条(实心直条)指示与使用的疫苗同源的菌株。
图24示出表达OspA的型内变体的疏螺旋体属的覆盖度。表面结合分类成强式结合(荧光增加大于10倍)或弱式结合(荧光增加2至10倍)。
发明详述
本发明提供可用作抗原的嵌合OspA分子,所述嵌合OspA分子可以作为免疫原性组合物或疫苗组合物进行递送以用于莱姆病或疏螺旋体属感染。在详细解释本发明的任何实施方案之前,应理解的是,本发明的应用不限于在以下描述中阐述或附图和实施例中说明的组分的构建细节和安排细节。本文使用的章节标题仅是出于组织性目的并且不应视为是限制所描述的标的。本申请中引用的所有参考文献都被以引用方式明确并入本文中。
本发明包涵其它实施方案并且以各种方式来实践或进行。而且,应理解的是,本文使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应认为具有限制性。术语“包括”、“包含”或“具有”以及其变型意欲涵盖其后所列的项目和其等效项目以及其它项目。
本发明的实施方案是在编码三种相异的脂质化OspA分子的三种嵌合OspA编码序列的设计和合成中进行例证,所有三种相异的脂质化OspA分子共有一些共同的特点。每个嵌合编码序列代表两个OspA血清型并且所述嵌合编码序列被设计成编码安全且高度免疫原性的稳定的嵌合OspA分子,并且向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护。
在一方面,嵌合OspA分子包含来自一个OspA血清型的近端部分连同来自另一个OspA血清型的远端部分,同时保留了两个亲本多肽的保护性质。嵌合OspA核酸分子被表达在大肠杆菌(E.coli)中以便提供抗原,该抗原可以被配制成联合疫苗以便提供针对与在欧洲的莱姆病或疏螺旋体属感染相关联的所有六种流行的血清型(血清型1至6)和针对与在北美洲的莱姆病或疏螺旋体属感染相关联的单一个OspA血清型的保护。由于包含血清型1至6的疫苗提供针对阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及伯氏疏螺旋体的保护,所以疫苗被设计成全球通用。
本发明还包括通过去除编码产生脂质化OspA分子所需要的前导序列的核酸序列来制备第二组嵌合OspA编码序列,在一方面,该组嵌合OspA编码序列源自于第一组三种基因。需要对这两组构建体(产生脂质化和非脂质化多肽)进行以下操作:评估所述构建体在发酵罐中产生的难易程度(生物量、稳定性、产物产率等)、评定不同类型的抗原可以纯化的容易程度以及比较所述构建体的生物特征(安全状况和保护效力)。
本发明包括包含本发明的嵌合OspA分子的免疫原性组合物。本发明同样包括包含所述OspA分子的疫苗和疫苗试剂盒、用于制作免疫原性组合物和疫苗的方法以及免疫原性组合物和疫苗在人类和兽医医学治疗和预防中的用途。本发明进一步包括使用本文描述的OspA组合物来进行免疫对抗莱姆病或疏螺旋体属感染的方法和OspA组合物在制造用于预防莱姆病或疏螺旋体属感染的药剂中的用途。
定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的通用定义:Singleton等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULARBIOLOGY(1994第二版);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OFSCIENCE ANDTECHNOLOGY(1988Walker编);THE GLOSSARY OFGENETICS,第五版,R.Rieger等(编),Springer Verlag(1991);以及Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY(1991)。
贯穿全文使用以下缩写。
AA 氨基酸
Amp 安比西林
bp 碱基对
B.afzelii 阿弗西尼疏螺旋体
B.burdorferi 伯氏疏螺旋体
B.garinii 伽氏疏螺旋体
DNA 脱氧核糖核酸
dNTPs 脱氧核苷酸三磷酸
E.coli 大肠杆菌
GC content 含有鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的序列的百分比
hLFA-1 人类白细胞功能相关抗原-1
HPLC 高效液相色谱法
IP 知识产权
IPTG 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
Kan 卡那霉素
kDa 千道尔顿
LB 卢里亚肉汤(Luria Broth)
Lip B 来自外膜蛋白B的前导序列
Mab 单克隆抗体
OD 光密度
OspA 外膜蛋白A
OspB 外膜蛋白B
PCR 聚合酶链反应
RNA 核糖核酸
s.l. 广义
s.s. 狭义
SDS 十二烷基硫酸钠
SMK 用于大肠杆菌的生长培养基(酮戊二酸山梨醇培养基)
tRNA 转移核糖核酸
WCB 工作细胞库
此处应注意,如在本说明书和随附权利要求书中所使用,除非上下文另有明确指示,否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”以及“该(the)”包括复数引用。
如在此所使用,除非另外规定,否则以下术语具有赋予给它们的含义。
术语“基因”是指编码包含一个或多个多肽、蛋白或酶中的全部或部分的氨基酸序列的DNA序列,并且可以或可以不包括内含子,和调控DNA序列,如影响例如基因表达的条件的启动子或增强子序列、5'未翻译区或3'未翻译区。在本公开中,OspA基因是细菌基因并且因此不存在内含子。术语“编码序列”是指编码氨基酸序列但不含有内含子或调控序列的DNA序列。同样地,在本公开中,OspA编码序列不含有调控序列。
“核酸”或“核酸序列”或“核酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。该术语涵盖了含有已知核苷酸类似物或被修饰的骨架残基或连接部分的核酸,所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的,它们具有与参考核酸相似的结合性质,并且它们以与参考核苷酸相似的方式进行新陈代谢。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。所述术语涵盖了由DNA和RNA的任何已知碱基类似物形成的分子,所述碱基类似物诸如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、吖丙啶基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧胺基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫基胞嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤。
除非另外指示,否则一个特定核酸序列也隐含地涵盖其经过保守性修饰的变体(例如,简并密码子取代)和互补序列,以及明确指示的序列。明确来说,在一些方面,简并密码子取代是通过产生序列来实现,在所述序列中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及多核苷酸互换使用。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可互换使用以便指代经由肽键连接的氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“蛋白”典型地是指较大多肽。术语“肽”典型地是指短多肽。合成多肽可以例如使用自动化的多肽合成仪来进行合成。
术语“Osp A分子”或“嵌合OspA分子”在一方面是指包含SEQ IDNO:1(lipB sOspA1/2251)、SEQ ID NO:3(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:5(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:7(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:9(sOspA6/4)、SEQ ID NO:11(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(orig sOspA 5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”,或者在另一方面是指包含SEQ ID NO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipBsOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA1/2)、SEQ IDNO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。
术语“lipB sOspA分子”在一方面是指包含SEQ ID NO:1(lipBsOspA 1/2251)、SEQID NO:3(lipB sOspA 6/4)或SEQ ID NO:5(lipBsOspA 5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”,或者在另一方面是指包含SEQID NO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA 6/4)或SEQ IDNO:6(lipB sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。SEQ ID NO:7、9以及11的核酸序列缺少编码lipB前导序列(MRLLIGFALALALIG(SEQID NO:13)的核酸序列。此外,代替SEQ ID NO:2、4以及6中的lipB前导序列的羧基末端处存在的半胱氨酸残基,SEQ ID NO:7、9以及11的核酸序列对在SEQ ID NO:8、10以及12的氨基末端处的甲硫氨酸残基进行编码。
术语“orig sOspA分子”或“原始sOspA分子”在一方面是指包含SEQ ID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(orig sOspA 5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”,或者在另一方面是指包含SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。这些“原始”分子是不具有突变并且不具有密码子优化的嵌合构建体。
本发明包括“脂质化OspA”和“非脂质化OspA”嵌合分子。在各个方面,脂质化将佐剂性质赋予OspA。在本发明的一些方面,脂质化OspA分子包含OspB前导序列。在本发明的一些方面,所述OspB前导序列包含氨基酸MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO:13)。在其它方面,OspB前导序列包含其它氨基酸。
如在本领域中已知的术语“一致的”或“同一性”百分比是指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的如通过比较这些序列来确定的关系。在本领域中,“同一性”也意指核酸分子或多肽之间的序列相关性的程度,所述程度看情形而定,如通过两个或更多个核苷酸序列或者两个或更多个氨基酸序列的链条之间的匹配度来确定。通过特定的数学模型或计算机程序(即,“算法”)来解决,“同一性”测量间隙对准(如果有的话)的两个或更多个较小序列之间的一致匹配的百分比。“大致同一性”是指序列与指定序列具有至少约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。在一些方面,同一性存在于长度至少约为50至100个氨基酸或核苷酸的区域中。在其它方面,同一性存在于长度至少约为100至200个氨基酸或核苷酸的区域中。在其它方面,同一性存在于长度至少约为200至500个氨基酸或核苷酸的区域中。在某些方面,序列同一性百分比是使用选自由以下组成的组的计算机程序来确定:GAP、BLASTP、BLASTN、FASTA、BLASTA、BLASTX、BestFit以及Smith-Waterman算法。
还应明确理解的是,本文引用的任何数值包括从下限值至上限值的所有值,即,在本申请中认为明确陈述了在已列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合。例如,如果浓度范围被陈述为约1%至50%,那么意图在本申请中明确列举一些值如2%至40%、10%至30%或1%至3%等。上文列出的值仅是明确意图的值的实例。
在各个方面,范围在本文中被表达为从“约”或“近似”一个特定值和/或至“约”或“近似”另一个特定值。在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时,应理解的是,一些变化量被包括在所述范围内。
术语“相似性”是相关的概念,但与“同一性”相比是指包括一致匹配和保守性取代匹配的相似性的量度。如果两个多肽序列例如具有10/20的一致的氨基酸并且剩余部分是所有的非保守性取代,那么同一性百分比和相似性百分比将都是50%。在同一实施例中,如果存在其中存在保守性取代的多余的五个位置,那么同一性百分比仍然是50%,但相似性百分比将是75%(15/20)。因此,在存在保守性取代的情况下,两个多肽之间的相似性百分比的程度将大于在那两个多肽之间的同一性百分比。
术语“分离的核酸分子”是指本发明的核酸分子,(1)所述核酸分子已从当从源细胞分离总DNA时,可天然地被一起发现的蛋白、脂类、碳水化合物或其它材料分离成任何程度;(2)所述核酸分子未连接至所述“分离的核酸分子”天然连接的多核苷酸的全部或一部分;(3)所述核酸分子***作地连接至它天然并不连接的多核苷酸;或者(4)所述核酸分子并不是天然存在作为较大多核苷酸序列的一部分。如本文使用的大致地不含指示核酸分子不含在它的自然环境中发现的任何其它污染性核酸分子或其它污染物,所述污染性核酸分子或其它污染物会干扰所述核酸分子在多肽产生中的用途或所述核酸分子的治疗、诊断、预防或研究用途。
术语“分离的多肽”是指本发明的多肽,(1)所述多肽已从当它从源细胞分离时,可天然地被一起发现的多核苷酸、脂类、碳水化合物或其它材料分离成任何程度;(2)所述多肽未连接(通过共价或非共价相互作用)至所述“分离的多肽”天然连接的多肽的全部或一部分;(3)所述多肽***作地连接(通过共价或非共价相互作用)至它天然并不连接的多肽;或者(4)所述多肽天然并不存在。在一方面,分离的多肽大致上不含在它的自然环境中发现的任何其它污染性多肽或其它污染物,所述污染性多肽或其它污染物会干扰所述多肽的治疗、诊断、预防或研究用途。
如本文使用的多肽的“片段”是指多肽的小于全长多肽或蛋白表达产物的任何部分。片段典型地是全长多肽的缺失类似物,其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此,“片段”是下文描述的缺失类似物的子集。
如本文使用的“类似物”是指在结构上大致相似并且具有相同的生物活性的多肽,尽管在某些情况下在不同程度上,是指天然存在的分子。基于一种或多种突变,与衍生类似物的天然存在的多肽相比,类似物在它们的氨基酸序列的组成上是不同的,所述一种或多种突变包括(i)在多肽(包括如上文描述的片段)的一个或多个末端处和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域处缺失一个或多个氨基酸残基;(ii)在多肽的一个或多个末端(典型是“添加”类似物)处和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(典型是“***”类似物)处***或添加一个或多个氨基酸;或者(iii)用一个或多个氨基酸取代天然存在的多肽序列中的其它氨基酸。取代基于被替换的氨基酸和替换它的氨基酸的物理化学相关性或功能性相关性是保守性的或非保守性的。
“保守性修饰的类似物”应用于氨基酸序列与核酸序列。对于特定的核酸序列来说,保守性修饰的核酸是指编码一致的或基本上一致的氨基酸序列或其中核酸未将氨基酸序列编码成基本上一致的序列的那些核酸。大量功能上一致的核酸由于遗传密码的简并性而对任何给出的蛋白进行编码。例如,密码子GCA、GCC、GCG以及GCU都对氨基酸丙氨酸进行编码。因此,在丙氨酸由密码子指定的每个位置处,在不改变被编码的多肽的情况下可以将密码子改变为描述的任何相应的密码子。所述核酸变异是“沉默变异”,是保守性修饰的类似物的一个种类。在本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到在核酸(除了通常为甲硫氨酸仅有的密码子的AUG和通常为色氨酸仅有的密码子的TGG)中的每个密码子都可以被修饰以便产生功能上一致的分子。因此,编码多肽的核酸的每个沉默变异均暗含于每个描述的序列中。
至于氨基酸序列,技术人员将认识到在被编码的序列中改变、添加或缺失单一个氨基酸或小百分比的氨基酸的针对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、***、缺失、添加或截短是“保守性修饰的类似物”,其中改变造成氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是熟知的。除了这类经过保守性修饰的变体之外,不排除本发明的多态变体、种间同源物以及等位基因。
以下八个组各自含有互为彼此的保守性取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见,例如Creighton,Proteins(1984))。
如本文使用的“变体”是指包含至少一个氨基酸取代、缺失、***或修饰的多肽、蛋白或其类似物,前提是所述变体保留了天然多肽的生物活性。
如本文使用的“等位基因变体”是指占据同一基因座的基因的两个或更多个多态形式中的任何一种。等位基因变异通过突变而天然出现,并且在一些方面导致群体中的表型多态。在某些方面,基因突变是沉默的(经过编码的多肽中无变化)或者在其它方面,对具有改变的氨基酸序列的多肽进行编码。“等位基因变体”也是指源自于遗传等位基因变体的mRNA转录本的cDNA以及由cDNA编码的蛋白。
术语“衍生物”是指通过偶联到治疗剂或诊断剂、标记(例如,用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附接如PEG化(用聚乙二醇衍生化)以及通过非天然氨基酸的化学合成而进行的***或取代来进行共价修饰的多肽。在一些方面,衍生物被修饰以便包含正常情况下不是分子的一部分的其它化学部分。在各个方面,所述部分调节分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。在其它各个方面,所述部分可选地降低了分子的毒性并且消除或弱化分子的任何不合意的副作用等。雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1980)中公开了能够介导所述作用的部分。将所述部分连接至分子的程序在本领域中是熟知的。例如,在一些方面,OspA衍生物是具有赋予所述蛋白较长体内半衰期的化学修饰的OspA分子。在一个实施方案中,多肽是通过添加本领域中已知的水溶性聚合物来进行修饰。在一个相关的实施方案中,多肽是通过糖基化、PEG化和/或多唾液酸化来进行修饰。
在参考例如细胞或核酸、蛋白或载体来一起使用时,术语“重组”指示细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白来进行修饰,或者指示细胞源自于经过如此修饰的细胞。因此,例如,重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因或者表达以其它形式异常表达、表达不充分或完全未表达的天然基因。
如本文使用的“可选标记”是指编码赋予细胞或有机体的酶或其它蛋白的基因,在所述细胞或有机体中,所述基因表达为可鉴定的表型变化如对药物、抗生素或其它试剂的抗性,这样使得标记的表达或活性被选择用于(例如但不限于阳性标记如neo基因)或对抗(例如并且不限于阴性标记如白喉基因)。“异源可选标记”是指已被***动物的基因组的可选标记基因,在所述动物中通常无法发现所述可选标记基因。
可选标记的实例包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素(neo)、嘌呤霉素(Puro)、白喉毒素、磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核酸基转移酶、第一型单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶以及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthinephosphoribosyltransferase)。本领域普通技术人员将理解本领域已知的任何可选标记都可用于本文描述的方法中。
在参考核酸部分一起使用时,术语“异源”指示核酸包含彼此在性质上未找出相同关系的两个或更多个子序列。例如,核酸典型地是进行重组来产生,从而使来自不相关基因的两个或更多个序列被安排,以便制作新的功能性核酸,例如,来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地,异源蛋白指示蛋白包含彼此在性质上未找出相同关系的两个或更多个子序列(例如,融合蛋白)。
如本文使用的术语“同源”是指拥有“共同的进化起源”的蛋白之间的关系,所述蛋白包括来自超家族(例如,免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同物种(例如,肌球蛋白轻链等)的同源蛋白(Reeck等,Cell50:667,1987)。所述蛋白(和它们的编码基因)具有如通过它们的序列相似性来反映的序列同源性,所述序列相似性是就在相似性百分比而论,或是就在保守位置处特定残基或基元的存在而论。
进行用于比较的序列的最佳比对,最佳比对是例如但不限于通过Smith等,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法;通过Needleman等,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法;通过Pearson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的相似性搜索方法;通过这些算法的计算机化实施(威斯康星洲麦迪逊(Madison,WI)的575Science Dr.的Genetics Computer Group的Wisconsin遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)或者通过目测检查(通常参见上文的Ausubel等)。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的另一个实例是BLAST算法,该算法被描述在Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。除计算出序列同一性百分比之外,BLAST算法还进行在两个序列之间的相似性的统计分析(参见,例如Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。
术语“载体”用于指用来将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如,核酸、质粒或病毒)。
“克隆载体”是其中可以***外来DNA片段的一小片DNA。将片段***克隆载体是通过用同一限制酶来处理运载物和外来DNA,然后将片段连接在一起来进行。存在许多类型的克隆载体并且所有类型的克隆载体都用于本发明中。遗传工程改造的质粒和细菌噬菌体(如,噬菌体λ)可能最常用于这一目的。其它类型的克隆载体包括细菌人工染色体(BAC)和酵母菌人工染色体(YAC)。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体,所述核酸构建体具有允许特定的核酸在宿主细胞中进行转录的一系列指定的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。在某些方面,表达载体包括待被转录操作地连接至启动子的核酸。
术语“编码序列”在本文中被定义为转录成mRNA的核酸序列,所述mRNA在处于适当的控制序列的控制下时被翻译成多肽。编码序列的边界总体上是由通常为mRNA的5′末端处的开放读码框的起点的ATG起始密码子和恰好位于mRNA的3′末端处的开放读码框的下游的转录终止序列来确定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA序列,cDNA序列,半合成序列、合成序列以及重组的核酸序列。在一方面,启动子DNA序列被定义为位于与其相关的编码序列的上游的DNA序列并且能够控制这一编码序列的表达。
“启动子”被定义为指引核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文使用的启动子包括在转录的起始位点附近的必要的核酸序列,如在聚合酶II类型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选地包括可以位于距离转录的起始位点多达数千碱基对处的远端增强子或阻遏元件。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下呈活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节情况下呈活性的启动子。
术语“操作地连接”是指在核酸表达控制序列(如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能性连接,其中表达控制序列指引对应于第二序列的核酸的转录。
术语“转导”是用于指通常通过噬菌体将核酸从一种细菌转移到另一种细菌。“转导”还指通过逆转录病毒获得并且转移真核细胞序列。
术语“转染”是用于指通过细胞摄取外来或外源DNA,并且细胞在外源DNA已被引入细胞膜内时已经被“转染”。本领域中熟知并且在本文中公开了许多转染技术。参见,例如Graham等,Virology,52:456(1973);Sambrook等,Molecular Cloning,a LaboratoryManual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York,(1989);Davis等,Basic MethodsinMolecular Biology,Elsevier,(1986);以及Chu等,Gene,13:197(1981)。所述技术可以用来将一个或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞。
如在此使用的术语“转化”是指细胞遗传特征的改变,并且细胞在经过修饰而含有新的DNA时已经被转化。例如,在细胞从它的天然状态进行遗传修饰时,所述细胞已被转化。在转染或转导之后,转化DNA可以通过物理地并入细胞的染色体来与细胞的DNA重组。在一些情况下,DNA被短暂地维持为游离元件而不被复制,或者它独立地复制为质粒。在DNA随着细胞***而进行复制时,认为细胞已经被稳定转化。
术语“内源的”是指在宿主有机体内天然地表达或起源于细胞、组织或有机体内的多肽或多核苷酸或其它化合物。“外源的”是指起源于细胞、组织或有机体之外的多肽、多核苷酸或其它化合物。
术语“试剂”或“化合物”描述具有影响本发明中的生物学参数的能力的任何分子,例如,蛋白或药物。
如本文使用的“对照”可以是指活性、阳性、阴性或媒介物对照。如将为本领域技术人员所理解,对照是用来建立实验结果的相关性并且为测试条件提供比较。
在提及莱姆或莱姆病的症状时,术语“降低严重程度”意指症状具有延迟的发作,降低的严重程度或对受试者产生较小损害。通常来说,将症状的严重程度与例如未接受活性预防性或治疗性组合物的对照相比较。在所述情况下,与症状的对照水平相比,如果所述症状被降低了10%、25%、30%、50%、80%或100%(即,实质上消除),那么则说组合物可以降低莱姆症状的严重程度。
术语“抗原”是指能够由选择性结合剂如抗体来结合并且另外能够用于受试者以便产生能够接合到每个抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。在各个方面,抗原具有一个或多个表位。
术语“抗体”是指具有针对OspA多肽的特异性的一个或多个分子。如在此使用的术语“特异的”、“特异性”以及“特异地结合”是指抗体接合到OspA多肽和不结合到非OspA多肽的能力。在某些方面,抗体是“中和抗体”,其中抗体与感染剂发生反应并且破坏或抑制它的感染性或毒力。本发明包括包含“中和”疏螺旋体属的抗体的免疫原性组合物。
如在此使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适于实现或增强作为药用组合物的OspA多肽、OspA核酸分子或OspA抗体的递送的一种或多种配制材料。
术语“稳定剂”是指保护疫苗的免疫原性组合物不受不利条件(如在加热或冷冻期间产生的那些条件)的影响和/或延长免疫原性组合物在稳定和免疫原性的条件或状态下的稳定性或保质期的物质或疫苗赋形剂。稳定剂的实例包括但不限于糖类,如蔗糖、乳糖以及甘露糖;糖醇如甘露醇(manitol);氨基酸如甘氨酸或谷氨酸;以及蛋白如人血清清蛋白,或明胶。
术语“抗菌性防腐剂”是指被添加至免疫原性组合物或疫苗的任何物质,所述物质抑制在反复刺穿多剂量小瓶(如果使用所述容器)时可能引入的微生物的生长。抗菌性防腐剂的实例包括但不限于如硫柳汞、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵以及苯酚的物质。
术语“免疫原性组合物”是指包含抗原(产生针对它的抗原特异性抗体)(例如,嵌合OspA分子)、刺激受试者宿主的免疫反应的佐剂以及适合的免疫惰性的药学上可接受的载体的组合物。任选地,免疫原性组合物包含一种或多种稳定剂。任选地,免疫原性组合物包含一种或多种抗菌性防腐剂。
术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指改善对特定疾病(例如,莱姆病或疏螺旋体属感染)的免疫性的生物制剂。疫苗典型地含有与引起疾病的微生物类似的试剂(例如,疏螺旋体属的嵌合OspA分子(抗原))。所述试剂刺激机体的免疫***来将所述试剂识别为外来物,破坏所述试剂并且“记住”所述试剂,这样使得免疫***可以更容易地识别并且破坏它后来碰到的这些微生物中的任何微生物。在各个方面,疫苗是预防性的(预防或改变通过任何天然或“野生”病原体引起的未来感染的作用)或治疗性的(针对本感染的疫苗)。如上文所阐述,所述疫苗组合物包括包含药学上可接受的载体的制剂。任选地,疫苗还包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种抗菌性防腐剂。
术语“有效量”和“治疗有效量”各自是指用于支持如本文所阐述的OspA多肽的一种或多种生物活性的可观察水平的核酸分子、多肽、组合物或抗体的量。例如,在本发明的一些方面,有效量将是预防、中和或降低疏螺旋体属感染所必要的量。
术语“组合”是指本发明的两个或更多个核酸分子或本发明的两个或更多个多肽。在一些方面,施用本发明的分子的组合来提供免疫力或抵抗来自本文描述的疏螺旋体属的六种血清型(1至6)中的至少四种血清型的感染。在各个方面,使用了本发明的两个或三个分子或多肽的组合。在某些方面,向受试者施用本发明的分子的组合来提供针对来自本文描述的疏螺旋体属的所有六种血清型(1至6)的免疫性。后一种组合已显示出提供针对表达核酸分子或多肽的组合中不存在的OspA类型的疏螺旋体属的异源菌株的免疫性。
术语“联合疫苗”是指含有针对一种或多种疾病的一种以上疫苗组合物或一种以上保护性抗原的疫苗制剂。除了针对一种或多种其它疾病的抗原之外,本发明还包括包含针对莱姆病或疏螺旋体属的OspA嵌合抗原的联合疫苗。在各个方面,一种或多种其它疾病是蜱传疾病。在某些方面,其它蜱传疾病是落基山斑疹热、巴贝斯虫病、回归热、科罗拉多蜱热、人单核细胞埃立克体病(HME)、人粒细胞埃立克体病(HGE)、南方蜱叮咬相关的皮疹疾病(STARI)、兔热病、蜱瘫痪、波瓦桑脑炎、寇热病、克里米亚刚果出血热、胞裂虫病、南欧斑疹热或蜱传脑炎。在特定方面,本发明包括包含一种或多种疫苗的联合疫苗,所述一种或多种疫苗包括蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗以及落基山斑疹热疫苗。在一些方面,联合疫苗包含具有与针对疏螺旋体属感染或莱姆病的免疫相容的季节性免疫程序的疫苗组合物。在更特定的方面,联合疫苗可用于预防多种疾病,用于这些疾病流行的地理位置。
术语“疏螺旋体属”是指疏螺旋体属的螺旋体类的革兰氏阴性细菌的一个种类。在一个方面,“广义伯氏疏螺旋体”是指较宽意义上的伯氏疏螺旋体。莱姆病或疏螺旋体病的几乎所有病例都是由三个同基因型种阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及狭义伯氏疏螺旋体(其是指狭义上的伯氏疏螺旋体)中的一个引起的。疏螺旋体属的OspA血清型与种类相关联;血清型1对应于狭义伯氏疏螺旋体,血清型2对应于阿氏疏螺旋体并且血清型3至7对应于伽氏疏螺旋体。在各个方面,本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物还提供了针对其它种类的疏螺旋体属的保护作用,所述其它种类的疏螺旋体属包括但不限于日本疏螺旋体、安德森疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、西尼伽疏螺旋体、土德疏螺旋体、塔卢基疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、宫本疏螺旋体或孤星疏螺旋体。
“受试者”被给予了非植物、非原生生物的生物的常规含义。在大多数方面,受试者是动物。在特定方面,动物是哺乳动物。在更特定方面,哺乳动物是人类。在其它方面,哺乳动物是宠物或伴侣动物、驯养家畜或动物园动物。在某些方面,哺乳动物是猫、狗、马或牛。在其它各个方面,哺乳动物是鹿、小鼠、花栗鼠、松鼠、负鼠或浣熊。
莱姆病(疏螺旋体病或莱姆疏螺旋体病)
在一些方面,本发明包括嵌合OspA分子和包含这些分子的组合物以预防莱姆病或疏螺旋体属感染。莱姆病在本领域中又称为疏螺旋体病或莱姆疏螺旋体病,因此,所有这些术语都包括在本发明内。同样地,本发明包括预防或治疗莱姆病的方法,所述方法包括施用本文描述的嵌合OspA分子。莱姆病或疏螺旋体病是由属于疏螺旋体属的至少三种革兰氏阴性细菌引起的感染性疾病。存在已发现的至少13种疏螺旋体属种类,已知其中三种是与莱姆病相关的。引起莱姆病的疏螺旋体属种类被统称为广义伯氏疏螺旋体,并且显示大量基因多样性。广义伯氏疏螺旋体组是由可能造成绝大多数的病例的三个紧密相关的种类构成。狭义伯氏疏螺旋体是美国莱姆病(但所述莱姆病还存在于欧洲)的主要病因,而阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体引起了欧洲的大多数病例。一些研究还提出疏螺旋体属种类(例如,比塞蒂疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、卢西塔尼疏螺旋体以及法雷斯疏螺旋体)有时可能会感染人类。虽然这些种类看起来似乎不是疾病的重要病因,但针对这些种类的免疫保护也被包括在本发明内。
莱姆病是北半球最常见的蜱传疾病。所述疾病是以康乃狄格州(Connecticut)的村庄莱姆来命名的,在1975年在所述村庄中鉴定出许多病例。疏螺旋体属通过属于硬蜱属(“硬蜱”)的一些种类的受感染的蜱虫的叮咬传播到人类。在一些情况下,早期症状包括发热、头痛、疲劳、抑郁以及称为游走性红斑的特征性圆形皮肤红疹。如果不治疗,那么稍后的症状经常可以涉及关节、心脏以及中枢神经***。在大多数情况下,感染和其症状可通过抗生素(尤其是疾患早期治疗时)来消除。然而,过晚、延迟或不充分的治疗可以导致更严重的症状,所述症状可能致残并且难以治疗。症状如在感染之后持续的关节炎有时通过抗生素来消除。
一些团体辩称,“慢性”莱姆病造成在识别出的晚期莱姆病的症状之外的一系列医学上无法解释的症状,并且需要另外的长期抗生素治疗。然而,长期治疗是备受争议的并且关于所述治疗的争论已产生了针对治疗指南的立法行动。
莱姆病被分类成动物传染病,这是因为莱姆病是通过蜱虫从包括啮齿动物和鸟类的天然储存宿主传播到人类,而所述蜱虫是以啮齿动物和鸟类这两组宿主为生。硬蜱属的硬体蜱虫是莱姆病的主要载体。大多数的人类感染是由处于幼虫阶段的蜱虫引起的,这是因为蜱虫幼虫十分之小并且可能进食很长一段时间,而不被检测到。蜱虫叮咬因处于幼虫阶段的蜱虫的较小体型以及防止宿主感觉到因叮咬而产生的任何瘙痒或疼痛的蜱虫分泌物而经常不被察觉。
莱姆病基于症状、客观身体上的发现(如游走性红斑、面神经麻痹或关节炎)、可能暴露于受感染的蜱虫的经历以及血清学血液测试而进行临床诊断。接近一半的莱姆病患者将发展成特征性靶心状红疹,但许多患者可能都不会联想到蜱虫叮咬。对于没有莱姆病症状的人来说,不推荐进行实验室测试。
因为在实验室中很难培养疏螺旋体属细菌,所以莱姆病的诊断典型地是基于临床检查发现结果和暴露于地方性莱姆区的经历。认为仅出现在所有病例的约50%中的游走性红斑(EM)红疹就足以确立莱姆病的诊断,即便是在血清学血液测试是阴性的情况下。血清学测试可以用于支持临床上疑似的病例但其自身并没有诊断性。晚期莱姆病的诊断经常因可能模仿许多其它疾病的症状的多方面表现而变得困难。为此原因,评论家将莱姆称为新的“伟大模仿者”。在一些情况下,莱姆病被误诊为多发性硬化症、类风湿性关节炎、纤维肌痛、慢性疲乏综合征(CFS)、狼疮或其它自体免疫和神经变性疾病。因此,本领域中对预防或治疗莱姆病的疫苗存在很大的需求。
疏螺旋体属的外膜蛋白A(OspA)
在各个方面,本发明包括疏螺旋体属的嵌合OspA分子和包含这些分子的组合物以预防和治疗莱姆病或疏螺旋体属感染。在过去十年中已鉴定了数种疏螺旋体属外膜蛋白,所述外膜蛋白在这种螺旋体被从蜱虫传播到哺乳动物时通过体温和/或哺乳动物的宿主特异性信号来进行上调。
伯氏疏螺旋体的主要外膜蛋白OspA因它作为疫苗候选物潜力而成为特别受关注的脂蛋白。来自疏螺旋体属的欧洲和北美洲菌株的OspA的血清型和基因分析已证明了抗原异质性和结构异质性。OspA被描述于已公布的PCT专利申请WO 92/14488、Jiang等(Clin.Diagn.Lab.Immunol.1:406-12,1994)中并且在本领域中是已知的。在小鼠、仓鼠以及狗的攻击研究中已显示Osp A诱导保护性免疫。人类的临床试验已显示OspA的制剂在人体中是安全的并且具有免疫原性(Keller等,JAMA(1994)271:17641768)。
虽然OspA表达在来自北美洲的伯氏疏螺旋体的绝大多数临床分离物中,但从欧洲的临床疏螺旋体属分离物的检查中出现了不同的景象。在欧洲,莱姆病主要是由疏螺旋体属的三种同基因型种,即伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及阿氏疏螺旋体引起的。本发明涉及提供针对疏螺旋体属的所有同基因型种的保护性免疫的嵌合OspA分子。本发明描述了编码共有共同特点的三种相异的脂质化OspA分子的三种嵌合OspA基因的设计和合成。每个基因代表两个OspA血清型并且这些基因被设计成编码安全且高度免疫原性,并且向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护的稳定的OspA分子。本发明还描述了不具有突变和不具有密码子优化的三种原始嵌合OspA基因,所述基因编码共有共同特点的三种相异的脂质化OspA分子。每个基因代表两个OspA血清型并且编码向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护的分子。
已识别出欧洲分离物之中的七个主要的OspA血清型(指示为血清型1至7,Wilske等,J.Clin.Microbiol.31:340-50,1993)。OspA血清型与种类相关联;血清型1对应于狭义伯氏疏螺旋体,血清型2对应于阿氏疏螺旋体并且血清型3至7对应于伽氏疏螺旋体。欧洲疏螺旋体属分离物的流行病学研究指示基于OspA类型1、2、3、4、5以及6的疫苗在欧洲将提供98.1%的莱姆病的理论覆盖率并且覆盖96.7%的侵袭性疾病分离物。本发明提供可以提供针对所有六种血清型1至6的保护性免疫的六种嵌合OspA核酸分子(SEQ ID NO:1、3以及5和SEQ IDNO:168、170以及172)和六种嵌合OspA多肽分子(SEQ ID NO:2、4以及6和SEQ ID NO:169、171以及173)。六种合成OspA基因被设计成编码OspA分子,所述OspA分子具有来自以下的保护性表位:OspA血清型1和2(lipB sOspA 1/2251(SEQ ID NO:1(核酸)和2(氨基酸))和orig sOspA 1/2(SEQ ID NO:168(核酸)和169(氨基酸)));OspA血清型6和4(lipB sOspA6/4(SEQ ID NO:3(核酸)和4(氨基酸))和orig sOspA6/4(SEQ ID NO:170(核酸)和171(氨基酸)));以及OspA血清型5和3(lipB sOspA 5/3(SEQ ID NO:5(核酸)和6(氨基酸))和origsOspA 5/3(SEQ ID NO:172(核酸)和173(氨基酸)))。嵌合OspA基因是使用合成的重叠寡核苷酸来制作的。在某些方面,以高产率和纯度产生这些重组蛋白,并且在各个方面,可操纵所述重组蛋白来最大化合意的活性并最小化不合意的活性。
嵌合OspA核酸分子和多肽分子
在各个方面,本发明包括疏螺旋体属的嵌合OspA核酸和多肽分子。本发明的OspA核酸包括核酸分子,所述核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:如SEQ IDNO:1(lipB sOspA 1/2251)、SEQID NO:3(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:5(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:7(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:9(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:11(sOspA5/3)、SEQID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(origsOspA 5/3)中阐述的核苷酸序列或如SEQ IDNO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipBsOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)中阐述的编码多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7、9以及11的核酸序列缺少编码lipB前导序列(MRLLIGFALALALIG(SEQID NO:13)的核酸序列。此外,代替在SEQID NO:2、4以及6中的lipB前导序列的羧基末端处存在的半胱氨酸残基,SEQ ID NO:7、9以及11的核酸序列对在SEQ ID NO:8、10以及12的氨基末端处的甲硫氨酸残基进行编码。SEQ ID NO:1、3以及5是lipB sOspA多核苷酸,并且SEQID NO:2、4以及6是lipB sOspA多肽。
在一些方面,本发明包括不具有突变并且不具有密码子优化的疏螺旋体属的原始(“orig”)嵌合OspA核酸分子和多肽分子。因此,本发明的OspA核酸包括核酸分子,所述核酸分子包含以下,基本上由以下组成或由以下组成:如SEQ ID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(orig sOspA 5/3)中阐述的核苷酸序列或如SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(origsOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)中阐述的编码多肽的核苷酸序列。
下表1中陈述了用于嵌合OspA分子的DNA和氨基酸序列的序列鉴定编号。
表1.嵌合OspA DNA和氨基酸序列
lipB sOspA 1/2251
氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
MRLLTGFALALALTGCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGKYDLLATVDKLELKGTSDKNNGS
GVLEGVKTNKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITMADGT
RLEYTGIKSDGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSMNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKT
AAWNSKTSTLTI SVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:1)
catatgcgtctgttgatcggctttgctctggcgctggctctgatcggctgcgcacagaaaggtgctgagt
ctattggttccgtttctgtagatctgcccggtgaaatgaaggttctggtgagcaaagaaaaagacaagaa
cggcaagtacgatctcatcgcaaccgtcgacaagctggagctgaaaggtacttctgataaaaacaacggc
tctggtgtgctggagggcgtcaaaactaacaagagcaaagtaaagcttacgatctctgacgatctcggtc
agaccacgctggaagttttcaaagaggatggcaagaccctcgtgtccaaaaaagtaacttccaaagacaa
gtcctctacggaagaaaaattcaacgaaaaaggtgaggtgtctgaaaagatcatcaccatggcagacggc
acccgtcttgaatacaccggtattaaaagcgatggtaccggtaaagcgaaatatgttctgaaaaacttca
ctctggaaggcaaagtggctaatgataaaaccaccttggaagtcaaggaaggcaccgttactctgagcat
gaatatctccaaatctggtgaagtttccgttgaactgaacgacactgacagcaqcgctqcgactaaaaaa
actgcagcgtggaattccaaaacttctactttaaccattagcgttaacagcaaaaaaactacccagctgg
tgttcactaaacaagacacgatcactgtgcagaaatacgactccgcaggcaccaacttagaaggcacgqc
agtcgaaattaaaacccttgatgaactgaaaaacgcgctgaaataagctgagcggatcc
互补链(SEQ ID NO:48)
catatgcgtctgttgatcggctttgctttggcgctggctttaatcggctgtgcacagaaaggtgctgagt
ctattggttccgtttctgtagatctgcccgggggtatgaaagttctggtaagcaaagaaaaagacaaaaa
cggtaaatacagcctgatggcaaccgtagaaaagctggagcttaaaggcacttctgataaaaacaacggt
tctggcaccctggaaggtgaaaaaactaacaaaagcaaagtaaagcttactattgctgaggatctgagca
aaaccacctttgaaatcttcaaagaagatggcaaaactctggtatctaaaaaagtaaccctgaaagacaa
gtcttctaccgaagaaaaattcaacgaaaagggtgaaatctctgaaaaaactatcgtaatggcaaatggt
acccgtctggaatacaccgacatcaaaagcgataaaaccggcaaagctaaatacgttctgaaagacttta
ctctggaaggcactctggctgctgacggcaaaaccactctgaaagttaccgaaggcactgttactctgag
catgaacatttctaaatccggcgaaatcaccgttgcactggatgacactgactctagcggcaataaaaaa
tccggcacctgggattctgatacttctactttaaccattagcaaaaacagccagaaaactaaacagctgg
tattcaccaaagaaaacactatcaccgtacagaactataaccgtgcaggcaatgcgctggaaggcagccc
ggctgaaattaaagatctggcagagctgaaagccgctttgaaataagctgagcggatcc
lipB sOspA 6/4
氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
MRLLLGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPSGMTVLVSKEKDKNSKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGS
GTLEGEKTNKSKVKLTIADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGETSEKTIVMANGT
RLEYTDIKSDGSGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSMNILKSGEITVALDDSDTTQATKK
TGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:3)
catatgcgtctgttgatcggctttgctctggcgctggctctgatcggctgcgcacagaaaggtgctgagt
ctattggttccgtttctgtagatctgcccggtggcatgaccgttctggtcagcaaagaaaaagacaaaaa
cggtaaatacagcctcgaggcgaccgtcgacaagcttgagctgaaaggcacctctgataaaaacaacggt
tccggcaccctggaaggtgaaaaaactaacaaaagcaaagtgaaactgaccattgctgatgacctcagcc
agaccaaattcgaaattttcaaagaagatgccaaaaccttagtatccaaaaaagtgaccctgaaagacaa
gtcctctaccgaagaaaaattcaacgaaaagggtgaaacctctgaaaaaaccatcgtaatggcaaatggt
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ccctggaaggcaccctcgctgccgacggcaaaaccaccttgaaagttaccgaaggcactgttgttttaag
catgaacatcttaaaatccggtgaaatcaccgttgcgctggatgactctgacaccactcaggccactaaa
aaaaccggcaaatgggattctaacacttccactctgaccatcagcgtgaattccaaaaaaactaaaaaca
tcgtgttcaccaaagaagacaccatcaccgtccagaaatacgactctgcgggcaccaacctcgaaggcaa
cgcagtcgaaatcaaaaccctggatgaactgaaaaacgctctgaaataagctgagcggatcc
互补链(SEQ ID NO:49)
ggatccgctcagcttatttcagcqcgtttttcagttcatcaagggttttaatttcgactgccgtgccttc
taagttggtgcctgcggagtcgtatttctgcacagtgatcgtgtcttgtttagtgaacaccagctgggta
gtttttttgctgttaacgctaatggttaaagtagaagttttggaattccacgctgcagtttttttagtcg
cagcgctgctgtcagtgtcgttcagttcaacggaaacttcaccagatttggagatattcatgctcagagt
aacggtgccttccttgacttccaaggtggttttatcattagccactttgccttccagagtgaagtttttc
agaacatatttcgctttaccggtaccatcgcttttaataccggtgtattcaagacgggtgccgtctgcca
tggtgatgatcttttcagacacctcacctttttcgttgaatttttcttccgtagaggacttgtctttgga
agttacttttttggacacgagggtcttgccatcctctttgaaaacttccagcgtggtctgaccgagatcg
tcagagatcgtaagctttactttgctcttgttagttttgacgccctccagcacaccagagccgttgtttt
tatcagaagtacctttcagctccagcttgtcgacggttgcgatgagatcgtacttgccgttcttgtcttt
ttctttgctcaccagaaccttcatttcaccgggcagatctacagaaacggaaccaatagactcagcacct
ttctgtgcgcagccgatcagagccagcgccagagcaaagccgatcaacagacgcatatg
lipB sOspA 5/3
氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKNGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGS
GTLEGEKTNKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVMANGT
RLEYTDIKSDKTGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSMNISKSGEITVALDDTDSSGNKKS
GTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALESSPAEIKDLAELKAALK
DNA序列(SEQ ID NO:5)
catatgcgtctgttgatcggctttgctttggcgctqqctttaatcggctgtgcacagaaaggtgctgagt
ctattggttccgtttctgtagatctgcccgggggtatgaaagttctggtaagcaaagaaaaagacaaaaa
cggtaaatacagcctgatggcaaccgtagaaaagctggagcttaaaggcacttctgataaaaacaacggt
tctggcatcctggaaggtgaaaaaactaacaaaagcaaagtaaagcttaGtattgctgaggatctgagca
aaaccacctttgaaatcttcaaagaagatggcaaaactctggtatctaaaaaagtaaccctgaaagacaa
gtcttctaccgaagaaaaattcaacgaaaagggtgaaatctctgaaaaaactatcgtaatggcaaatggt
acccgtctggaatacaccgacatcaaaagcgataaaaccggcaaagctaaatacgttctgaaagacttta
ctctggaaggcactctggctgctgacggcaaaaccactctgaaagttaccgaaggcactgttactctgag
catgaacatttctaaatccggcgaaatcaccgttgcactggatgacactgactctagcggcaataaaaaa
tccggcacctgggattctgatacttctactttaaccattagcaaaaacagccagaaaactaaacagctgg
tattcaccaaagaaaacactatcaccgtaaagaactataaccgtgcaggcaatgcgctggaaggcagccc
ggctgaaattaaagatctggcagagctgaaagccgctttgaaataagctgagcggatcc
互补链(SEQ ID NO:50)
ggatccgctcagcttatttcagagcgtttttcagttcatccagggttttgatttcgactgcgttgccttc
gaggttggtgcccgcagagtcgtatttctggacggtgatggtgtcttctttggtgaacacgatgttttta
gtttttttggaattcacgctgatggtcagagtggaagtgttagaatcccatttgccggtttttttagtgg
cctgagtggtgtcagagtcatccagcgcaacggtgatttcaccggattttaagatgttcatgcttaaaac
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ttcagaacgtatttggctttgccggagccatcgcttttgatgtcggtgtattccagacgggtaccatttg
ccattacgatggttttttcagaggtttcacccttttcgttgaatttttcttcggtagaggacttgtcttt
cagggtcacttttttggatactaaggttttggcatcttctttgaaaatttcgaatttggtctggctgagg
tcatcagcaatggtcagtttcactttgcttttgttagttttttcaccttccagggtgccggaaccgttgt
ttttatcagaggtgcctttcagctcaagcttgtcgacggtcgcctcgaggctgtatttaccgtttttgtc
tttttctttgctgaccagaacggtcatgccaccgggcagatctacagaaacggaaccaatagactcagca
cctttctgtgcgcagccgatcagagccagcgccagagcaaagccgatcaacagacgcatatg
sOspA 1/2251
氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
MAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVIVSKEKDKNGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKTNKSKVKL
TISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITMADGTRLEYTGIKSDGTGKA
KYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSMNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVN
SKKTTQLVFTKQDTTTVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:7)
catatggcacagaaaggtgctgagtctattggttccgtttctgtagatctgcccggtgaaatgaaggttc
tggtgagcaaagaaaaagacaagaacggcaagtacgatctcatcgcaaccgtcgacaagctggagctgaa
aggtacttctgataaaaacaacggctctggtgtgctggagggcgtcaaaactaacaagagcaaagtaaag
cttacgatctctgacgatctcggtcagaccacgctggaagttttcaaagaggatggcaagaccctcgtgt
ccaaaaaagtaacttccaaagacaagtcctctacggaagaaaaattcaacgaaaaaggtgaggtgtctga
aaagatcatcaccatggcagacggcacccgtcttgaatacaccggtattaaaagcgatggtaccggtaaa
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aggaaggcaccgttactctgagcatgaatatctccaaatctggtgaagtttccgttgaactgaacgacac
tgacagcagcgctgcgactaaaaaaactgcagcgtggaattccaaaacttctactttaaccattagcgtt
aacagcaaaaaaactacccagctggtgttcactaaacaagacacgatcactgtgcagaaatacgactcca
acggcaccaacttagaaggcacggcagtcgaaattaaaacccttgatgaactgaaaaacgcgctgaaata
agctgagcggatcc
互补链(SEQ ID NO:56)
gtataccgtgtctttccacgactcagataaccaaggcaaagacatctagacgggccactttacttccaag
accactcgtttctttttctgttcttgccgttcatgctagagtagcgttggcagctgttcgacctcgactt
tccatgaagactatttttgttgccgagaccacacgacctcccgcaqttttqattqttctcgtttcatttc
gaatgctagagactgctagagccagtctggtgcgaccttcaaaagtttctcctaccgttctgggagcaca
ggttttttcattgaaggtttctgttcaggagatgccttctttttaagttgctttttccactccacagact
tttctagtagtggtaccgtctqccgtgggcagaacttatgtggccataattttcgctaccatggccattt
cgctttatacaagactttttqaagtgagaccttccgtttcaccgattactattttggtggaaccttcagt
tccttccgtggcaatgagactcgtacttatagaggtttagaccacttcaaaggcaacttgacttgctgtg
actgtcgtcgcgacgctgatttttttgacgtcgcaccttaaggttttgaagatgaaattggtaatcgcaa
ttgtcgtttttttgatgggtcgaccacaagtgatttgttctgtgctagtgacacgtctttatgctgaggt
tgccgtggttgaatcttccgtgccgtcagctttaattttgggaactacttgactttttgcgcgactttat
tcgactcgcctagg
sOspA 6/4
氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
MAQKGAESIGSVSVDLPGGMTVTVSKEKDKNGKYSLEATVDKLELKSTSDKNNSSSTLESEKTNKSKVKL
TIADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGETSEKTIVMANSTRLEYTDIKSDGSGKA
KYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSMNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISV
NSKKTKNIVFTKEDTTTVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:9)
catatggcacagaaaggtgctgagtctattggttccgtttctgtagatctgcccggtggcatgaccgttc
tggtcagcaaagaaaaagacaaaaacggtaaatacagcctcgaggcgaccgtcgacaagcttgagctgaa
aggcacctctgataaaaacaacggttccggcaccctggaaggtgaaaaaactaacaaaagcaaagtgaaa
ctgaccattgctgatgacctcagccagaccaaattcgaaattttcaaagaagatgccaaaaccttagtat
ccaaaaaagtgaccctgaaagacaagtcctctaccgaagaaaaattcaacgaaaagggtgaaacctctga
aaaaaccatcgtaatggcaaatggtacccgtctggaatacaccgacatcaaaagcgatggctccggcaaa
gccaaatacgttctgaaagacttcaccctggaaggcaccctcgctgccgacggcaaaaccaccttgaaag
ttaccgaaqgcactgttgttttaaqcatgaacatcttaaaatccggtgaaatcaccgttqcqctqgatga
ctctgacaccactcaggccactaaaaaaaccggcaaatgggattctaacacttccactctgaccatcagc
gtgaattccaaaaaaactaaaaacatcgtgttcaccaaagaagacaccatcaccgtccagaaatacgact
ctgcgggcaccaacctcgaaggcaacgcagtcgaaatcaaaaccctggatgaactgaaaaacgctctgaa
at aagct gagcggat cc
互补链(SEQ ID NO:57)
gtataccgtgtctttccacgactcagataaccaaggcaaagacatctagacgggccaccgtactggcaag
accagtcgtttctttttctgtttttgccatttatgtcggagctccgctggcagctgttcgaactcgactt
tccgtggagactatttttgttgccaaggccgtgggaccttccacttttttgattgttttcgtttcacttt
gactggtaacgactactggagtcggtctggtttaagctttaaaagtttcttctacggttttggaatcata
ggttttttcactgggactttctgttcaggagatggcttctttttaagttgcttttcccactttggagact
tttttggtagcattaccgtttaccatgggcagaccttatgtggctgtagttttcgctaccgaggccgttt
cggtttatgcaagactttctgaagtgggaccttccgtgggagcgacggctgccgttttggtggaactttc
aatggcttccgtgacaacaaaattcgtacttgtagaattttaggccactttagtggcaacgcgacctact
gagactgtggtgagtccggtgatttttttggccgtttaccctaagattgtgaaggtgagactgqtagtcg
cacttaaggtttttttgatttttgtagcacaagtggtttcttctgtggtagtggcaggtctttatgctga
gacgcccgtggttggagcttccgttgcgtcagctttagttttgggacctacttgactttttgcgagactt
tattcgactcgcctagg
sOspA 5/3
氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
MAQKGAESIGSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKNGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKL
TTAEDLSKTTFETFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVMANGTRLEYTDTKSDKTGKA
KYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSMNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKN
SQKTKQLVFTKENTTTVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
DNA序列(SEQ ID NO:11)
catatggcacagaaaggtgctgagtctattggttccgtttctgtagatctgcccgggggtatgaaagttc
tggtaagcaaagaaaaagacaaaaacggtaaatacagcctgatggcaaccgtagaaaagctggagcttaa
aggcacttctgataaaaacaacggttctggcaccctggaaggtgaaaaaactaacaaaagcaaagtaaag
cttactattgctgaggatctgagcaaaaccacctttgaaatcttcaaagaagatggcaaaactctggtat
ctaaaaaagtaaccctgaaagacaagtcttctaccgaagaaaaattcaacgaaaagggtgaaatctctga
aaaaactatcgtaatggcaaatggtacccgtctggaatacaccgacatcaaaagcgataaaaccggcaaa
gctaaatacgttctgaaagactttactctggaaggcactctggctgctgacggcaaaaccactctgaaag
ttaccgaaggcactgttactctgagcatgaacatttctaaatccggcgaaatcaccgttgcactggatga
cactgactctagcggcaataaaaaatccggcacctgggattctgatacttctactttaaccattagcaaa
aacagccagaaaactaaacagctggtattGaccaaagaaaacactatcaccgtacagaactataaccgtg
caggcaatgcgctggaaggcagcccggctgaaattaaagatctggcagagctgaaagccgctttgaaata
agctqaqcqqatcc
互补链(SEQ ID NO:58)
gtataccgtgtctttccacgactcagataaccaaggcaaagacatctagacgggcccccatactttcaag
accattcgtttctttttctgtttttgccatttatgtcggactaccgttggcatcttttcgacctcgaatt
tccgtgaagactatttttgttgccaagaccgtgggaccttccacttttttgattgttttcgtttcatttc
gaatgataacgactcctagactcgttttggtggaaactttagaagtttcttctaccgttttgagaccata
gattttttcattgggactttctqttcagaagatqqcttctttttaagttgcttttcccactttagagact
tttttgatagcattaccgtttaccatgqqcagaccttatgtggctgtagttttcgctattttggccgttt
cgatttatgcaagactttctgaaatgagaccttccgtgagaccgacgactgccgttttggtgagactttc
aatggcttccgtgacaatgagactcgtacttgtaaagatttaggccgctttagtggcaacgtgacctact
gtgactgagatcgccgttattttttaqgccgtggaccctaagactatgaagatgaaattggtaatcgttt
ttgtcggtcttttgatttgtcgaccataagtggtttcttttgtgatagtggcatgtcttgatattggcac
gtccgttacgcgaccttccgtcgggccgactttaatttctagaccgtctcgactttcggcgaaactttat
tcqactcqcctaqq
OrigsOspA 1/2
氨基酸序列(SEQ ID NO:169)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLEL
KGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKF
NEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSK
NISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAG
TNLEGTAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:168)
atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgt
tagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaagttcttg
taagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaagcttgag
cttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaagctgacaa
aagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaagttttcaaag
aagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtcatcaacagaaqaa
aaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagcagacggaaccagact
tgaatacacaggaattaaaagcqatggatctqgaaaagctaaagaggttttaaaaaacttta
ctcttgaaggaaaagtagctaatgataaagtaacattggaagtaaaagaaggaaccgttact
ttaagtaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaacttaatgacactgacagtag
tgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaaaaacttctactttaacaattagtqtta
acagcaaaaaaactacacaacttgtgtttactaaacaagacacaataactgtacaaaaatac
gactccgcaggtaccaatttagaaggcacagcagtcgaaattaaaacacttgatgaacttaa
aaacgctttaaaatag
Orig sOspA 6/4
氨基酸序列(SEQ ID NO:171)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSTLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLE
LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEE
KFNEKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTV
VLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQK
YDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
DNA序列(SEQ ID NO:170)
atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgt
tagcacgcttgatgaaaaaaatagcgtttcagtagatttacctggtggaatgacagttcttg
taagtaaagaaaaagacaaagacggtaaatacagtctagaggcaacagtagacaagcttgag
cttaaaggaacttctgataaaaacaacggttctggaacacttgaaggtgaaaaaactgacaa
aagtaaagtaaaattaacaattgctgatgacctaagtcaaactaaatttgaaattttcaaag
aagatgccaaaacattagtatcaaaaaaagtaacccttaaagacaagtcatcaacagaagaa
aaattcaacgaaaagggtgaaacatctgaaaaaacaatagtaagagcaaatggaaccagact
tgaatacacagacataaaaagcgatggatccggaaaagctaaagaagttttaaaagacttta
ctcttgaaggaactctagctgctgacggcaaaacaacattqaaagttacagaaggcactgtt
gttttaagcaagaacattttaaaatccggagaaataacagttgcacttgatgactctgacac
tactcaggctactaaaaaaactggaaaatgggattcaaatacttccactttaacaattaqtg
tgaatagcaaaaaaactaaaaacattgtatttacaaaagaagacacaataacagtacaaaaa
tacgactcagcaggcaccaatctagaaggcaacgcagtcgaaattaaaacacttgatgaact
taaaaacgctttaaaataa
OrigsOspA 5/3
氨基酸序列(SEQ ID NO:173)
MKKYLLGIGLILALIAcKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE
LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEE
KFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTV
TLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNY
NRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
DNA序列(SEQ ID NO:172)
atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgt
tagcagccttgatgaaaaaaatagcgtttcagtagatttacctggtqgaatgaaagttcttg
taagtaaagaaaaagacaaagatggtaaatacagtctaatggcaacagtaqaaaagcttgag
cttaaaggaacttctgataaaaacaacggttctggaacacttgaaggtgaaaaaactgacaa
aagtaaagtaaaattaacaattgctgaggatctaagtaaaaccacatttgaaatcttcaaag
aagatggcaaaacattagtatcaaaaaaagtaacccttaaagacaagtcatcaacagaagaa
aaattcaacgaaaagqqtqaaatatctqaaaaaacaataqtaaqaqcaaatgqaaccagact
tgaatacacagacataaaaagcgataaaaccggaaaagctaaagaagttttaaaagacttta
ctcttgaaggaactctagctgctgacggcaaaacaacattgaaagttacagaaggcactgtt
actttaagcaagaacatttcaaaatccggagaaataacagttgcacttgatgacactgactc
tagcggcaataaaaaatccggaacatgggattcagatacttctactttaacaattagtaaaa
acagtcaaaaaactaaacaacttgtattcacaaaagaaaacacaataacagtacaaaactat
aacagagcaggcaatgcgcttgaaggcagcccagctgaaattaaagatcttgcagagcttaa
agccgctttaaaataa
本发明的OspA多肽包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:SEQ ID NO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQID NO:10(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ IDNO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(origsOspA 5/3)的氨基酸序列和相关多肽。相关多肽包括OspA多肽类似物、OspA多肽变体以及OspA多肽衍生物。在一些方面,OspA多肽取决于制备它们的方法而具有氨基末端甲硫氨酸残基。在相关方面,本发明的OspA多肽包含OspA活性。
在一个实施方案中,相关核酸分子包含以下或由以下组成:与如SEQ ID NO:1(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:3(lipB sOspA 6/4)、SEQID NO:5(lipB sOspA 5/3)、SEQID NO:7(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:9(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:11(sOspA 5/3)、SEQ IDNO:168(orig sOspA1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(origsOspA5/3)中所示的核苷酸序列具有约百本之七十(70%)的同一性或相似性的核苷酸序列,在某些方面,所述相关核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:编码多肽的核苷酸序列,所述多肽与如SEQ IDNO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(origsOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(origsOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(origsOspA 5/3)中阐述的多肽具有约百分之七十(70%)的同一性。在各个实施方案中,核苷酸序列与如SEQ ID NO:1(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:3(lipBsOspA 6/4)、SEQ ID NO:5(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:7(sOspA1/2251)、SEQ IDNO:9(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:11(sOspA 5/3)、SEQ IDNO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ IDNO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ IDNO:172(origsOspA 5/3)中示出的核苷酸序列具有约70%或约71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%,或约80%,或约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%,或约90%,或约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性,或者所述核苷酸序列对多肽进行编码,所述多肽与如SEQ ID NO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQID NO:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipBsOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ IDNO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)中阐述的多肽序列具有约70%,或约71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%,或约80%,或约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%,或约90%,或约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在一些实施方案中,确定序列同一性和/或相似性的方法被设计成给出被测试的序列之间的最大匹配度。可公开获得的计算机程序中描述了确定同一性和相似性的方法。在一些方面,确定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包,所述GCG程序包包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.,12:387(1984);威斯康星洲麦迪逊的威斯康星大学(University of Wisconsin)的GeneticsComputer Group的BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul等,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST手册,Altschul等,NCB/NLM/NIHBethesda,MD 20894;上文的Altschul等(1990))公开获得。熟知的SmithWaterman算法也用于确定同一性。
在一些方面,用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案使得仅两个序列的较短区域匹配,并且这一较小的对准区域可能具有十分高的序列同一性,即使在两个全长序列之间不存在显著的关系。因此,在一个实施方案中,选择的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶标多肽的至少50个邻接的氨基酸的对准。例如,使用计算机算法GAP(威斯康星洲麦迪逊的威斯康星大学的Genetics Computer Group),使序列同一性百分比将被确定的两个多肽对准以用于它们各自的氨基酸的优化匹配(如通过算法确定的“匹配跨度”)。间隙开放罚分(其被计算为平均对角线值的3倍;“平均对角线值”是所使用的比较矩阵的对角线值的平均值;“对角线值”是通过特定的比较矩阵分配给每个绝佳的氨基酸匹配的分值或数值)和间隙扩展罚分(其通常是间隙开放罚分的1/10)以及比较矩阵如PAM 250或BLOSUM 62与算法一起结合使用。算法还使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵,见Dayhoff等,Atlas ofProteinSequence and Structure,5(3)(1978);对于BLOSUM 62比较矩阵,见Henikoff等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:10915-10919(1992))。
在各个方面,用于多肽序列比较的参数包括以下:
算法:Needleman等,J.Mol.Biol.,48:443-453(1970);
比较矩阵:来自上文的Henikoff等,(1992)的BLOSUM 62;
间隙罚分:12
间隙长度罚分:4
相似性阈值:0
GAP程序可与以上参数一起使用。前述参数是使用GAP算法用于多肽比较(同时末端间隙不存在罚分)的默认参数。
在一些方面,用于核酸分子序列比较的参数包括以下:
算法:上文的Needleman等,(1970);
比较矩阵:匹配=+10,失配=0
空隙罚分:50
空隙长度罚分:3
GAP程序也可与以上参数一起使用。前述参数是用于核酸分子比较的默认参数。本领域技术人员使用了其它示例性算法、空隙开放罚分、空隙扩展罚分、比较矩阵、相似性阈值等,包括在1997年9月的第9版威斯康星包的程序手册中(Program Manual,WisconsinPackage,Version 9,September,1997)阐述的那些。待做出的特定选择对于本领域技术人员来说将变得清楚并且将取决于待做出的特定比较,如DNA与DNA、蛋白与蛋白、蛋白与DNA;并且此外,无论比较是在给定的序列对之间(在该情况下通常优选GAP或BestFit)还是在一个序列与序列的一个大数据库之间(在该情况下优选FASTA或BLASTA)。
在一些方面,核酸序列的差异导致氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2(lipB sOspA1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的保守性和/或非保守性修饰。
对SEQ ID NO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO:8(sOspA 1/2251)、SEQID NO:10(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的保守性修饰(和对编码核苷酸的相应修饰)将产生具有与天然存在的OspA多肽的功能性和化学特征相似的功能性和化学特征的OspA多肽。相比之下,OspA多肽的功能性和/或化学特征的实质性修饰是通过选择SEQ IDNO:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ IDNO:8(sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:10(sOspA 6/4)、SEQ ID NO:12(sOspA 5/3)、SEQ ID NO:169(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:171(origsOspA 6/4)或SEQ ID NO:173(orig sOspA 5/3)的氨基酸序列中的取代来实现,所述取代在它们维持以下的作用方面显著不同:(a)取代区中的分子骨架的结构,例如,作为薄片或螺旋构型,(b)在靶标位点处的分子的带电性或疏水性或者(c)侧链的本体。
例如,在一些方面,“保守性氨基酸取代”包括用非天然残基取代天然氨基酸残基,这样使得在那个位置处几乎没有或没有对氨基酸残基的极性或带电性的影响。此外,在某些方面,如先前已针对“丙氨酸扫描突变”所描述,在多肽中的任何天然残基也由丙氨酸取代。
保守性氨基酸取代还涵盖典型地通过化学肽合成而非通过生物***中的合成而被并入的非天然存在的氨基酸残基。这些非天然存在的氨基酸残基包括类肽物和其它逆转或倒转形式的氨基酸部分。
在各个方面,天然存在的残基基于共有的侧链性质而被划分成以下类别:
1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3)酸性:Asp、Glu;
4)碱性:His、Lys、Arg;
5)影响链的取向的残基:Gly、Pro;以及
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
例如,在一些方面,非保守性取代包括用这些类别中的一个类别的成员交换来自另一个类别的成员。在各个方面,所述取代的残基被引入与OspA多肽垂直同源区同源或相似的OspA多肽的区域,或者被引入分子的非同源区域。
在做出所述改变时,经常考虑氨基酸的亲水指数。基于每个氨基酸的疏水性和带电性特征而将亲水指数分配给每个氨基酸。所述指数是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);以及精氨酸(-4.5)。
本领域中理解到氨基酸亲水指数在将交互性生物功能赋予蛋白中的重要性。Kyte等,J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知的是,某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或分值的其它氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数而做出改变时,亲水指数在±2内的氨基酸的取代在某些方面是优选的,亲水指数在±1内的那些氨基酸的取代在其它方面是特别优选的,并且亲水指数在±0.5内的那些氨基酸的取代在各个方面是更特别优选的。
本领域中还应理解的是,类似氨基酸的取代可以基于亲水性而有效地进行,特别是在由此产生的生物功能等效蛋白或肽是部分意图用于免疫实施方案中时,如在本情况下。如由它的邻近氨基酸的亲水性掌控的蛋白的最大局部平均亲水性与它的免疫原性和抗原性相关联,即与蛋白的生物性质相关联。
以下亲水性值被分配给了这些氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸酯(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值而做出改变时,亲水性值在±2内的氨基酸的取代在某些方面是优选的,亲水性值在±1内的那些氨基酸的取代在其它方面是特别优选的,并且亲水性值在±0.5内的那些氨基酸的取代在各个方面是更特别优选的。技术人员还基于亲水性鉴定出来自一级氨基酸序列的表位。这些区域又称为“表位核心区”。
本领域技术人员可以在希望进行所述取代时确定所希望的氨基酸取代(无论是保守性的还是非保守性的)。例如,如本文所描述,氨基酸取代可以用于鉴定OspA多肽的重要残基,或者提高或降低OspA多肽对它们的底物的亲和力。
在一些方面,本发明包括在核苷酸序列中的核苷酸和在氨基酸序列中的氨基酸的取代。所述取代包括1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、1至35、1至40、1至45、1至50、1至55、1至60、1至65、1至70、1至75、1至80、1至85、1至90、1至95、1至100、1至150以及1至200个核苷酸。同样地,取代包括1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、1至35、1至40、1至45、1至50、1至55、1至60、1至65、1至70、1至75、1至80、1至85、1至90、1至95以及1至100个氨基酸。在各个方面,所述取代是保守性的或非保守性的。
表2中阐述了示例性氨基酸取代。
表2.氨基酸取代
技术人员可以使用熟知的技术来确定SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173中阐述的多肽的适合的类似物或变体。为了鉴定出在不破坏活性的情况下可能发生改变的分子的适合的区,本领域技术人员可以靶向相信对活性来说不重要的区。例如,在已知来自同一种类或来自其它种类的具有相似活性的相似多肽时,本领域技术人员可以比较OspA多肽的氨基酸序列与所述相似的多肽。用所述比较,可以鉴定出在相似多肽中保守的分子的残基和部分。应理解的是,相对于所述相似的多肽,不保守的OspA多肽区中的改变不太可能对OspA多肽的生物活性和/或结构造成不利的影响。本领域技术人员还会了解到,即使在相对保守的区域中,可以用化学上相似的氨基酸来取代天然存在的残基,同时保留活性(保守性氨基酸残基取代)。
在一些实施方案中,OspA多肽变体包括糖基化变体,其中与SEQID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173中阐述的氨基酸序列相比,已改变了糖基化位点的数目和/或类型。在一个实施方案中,OspA多肽变体包含比SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173中阐述的氨基酸序列更大或更小的N键联的糖基化位点。N键联的糖基化位点的特征在于以下序列:Asn-X-Ser或Asn-X-Thr,其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。产生这一序列的氨基酸残基的取代提供了潜在的新位点以用于添加N键联的糖链。作为替代方案,消除这一序列的取代将去除现存的N键联的碳水化合物链。还提供了N键联的碳水化合物链的重排,其中消除了一个或多个N键联的糖基化位点(典型地是天然存在的那些位点)并且产生了一个或多个新的N键联的位点。另外的OspA变体包括半胱氨酸变体,其中与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173中阐述的氨基酸序列相比,一个或多个半胱氨酸残基缺失,或取代另一种氨基酸(例如,丝氨酸)。半胱氨酸变体在如在不溶性包涵体分离之后,OspA多肽必须被再折叠成生物活性构象时是有用的。半胱氨酸变体通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基,并且典型地具有偶数的半胱氨酸残基以便最小化由未成对的半胱氨酸导致的相互作用。
本发明进一步提供包含如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173中示出的蛋白的携带表位部分的多肽。术语“表位”是指抗体可以结合的蛋白的区域。参见,例如Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)。表位可以是线性的或是具有构象的,后者主要由在蛋白折叠时形成表位的蛋白的不连续区域组成。线性表位的长度通常为至少6个氨基酸残基。模拟部分蛋白序列的相对较短的合成肽常规上能够引出与部分模拟的蛋白发生反应的抗血清。参见Sutcliffe等,Science 219:660-666(1983)。识别短的线性表位的抗体在采用变性蛋白的如蛋白质印迹法的分析和诊断应用中尤其有用。参见Tobin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350-4356(1979)。短肽的抗体在某些情况下也识别处于天然构象的蛋白并且因此可用于监视蛋白表达和蛋白分离,并且可用于如通过ELISA或在免疫沉淀研究中检测溶液中的OspA蛋白。
嵌合OspA核酸分子和多肽分子的合成
核酸分子编码包含OspA多肽的氨基酸序列的多肽并且可以容易地以多种方式获得,所述方式包括但不限于重组DNA方法和化学合成。
重组DNA方法通常是在Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY(1989)和/或Ausubel等编,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishers Inc.和Wiley andSons,NY(1994)中阐述的那些方法。在各个方面,按照根据下文阐述的描述来进行的重组表达技术来产生这些多核苷酸并表达被编码的多肽。例如,通过将编码OspA多肽的氨基酸序列的核酸序列***适当的载体,本领域技术人员可以容易地产生大量所希望的核苷酸序列。然后,所述序列可以用于产生检测探针或扩增引物。作为替代方案,可以将编码OspA多肽的氨基酸序列的多核苷酸***表达载体。在一些方面,通过将表达载体引入适当的宿主,大量产生被编码的OspA多肽或OspA多肽。
同样地,本领域中熟知核酸和多肽的化学合成,如由Engels等,Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734(1989)描述的那些化学合成。这些方法尤其包括用于核酸合成的磷酸三酯、亚磷酰胺以及H-磷酸酯法。在一方面,用于所述化学合成的方法是使用标准的亚磷酰胺化学法的聚合物支持的合成。典型地,编码OspA多肽的氨基酸序列的DNA的长度将是数百个核苷酸。使用这些方法将大于约100个核苷酸的核酸合成为数个片段。然后将所述片段连接在一起以便形成本发明的全长核苷酸序列。在特定方面,编码多肽的氨基末端的DNA片段具有编码甲硫氨酸残基的ATG。
在本发明的特定方面,嵌合OspA编码序列是使用合成的重叠寡核苷酸来制作的。由于未使用来自疏螺旋体属细胞的DNA,所以合成方法的另一个益处是避免了疏螺旋体属培养基中存在的动物源性材料(即,血清或血清白蛋白)中含有的外来试剂的污染。这一策略大致上还减少了制作嵌合基因所需的操纵次数,这是因为所述策略允许在单一个步骤内进行序列改变,如优化表达(OspB前导序列)的修饰,引入限制性位点以便促进克隆的修饰,或避免潜在的知识产权问题的修饰。所述策略还使密码子使用被优化用于大肠杆菌宿主,这是因为已知很少用于大肠杆菌中的密码子的存在会对外来基因的高水平表达的呈现阻碍(Makoff等,Nucleic Acids Res.17:10191-202,1989;Lakey等,Infect.Immun.68:233-8,2000)。也使用技术人员已知的其它方法。
在某些实施方案中,核酸变体含有已经被改变来用于在给定的宿主细胞中优化表达OspA多肽的的密码子。特定的密码子改变取决于被选择用于表达的一个或多个OspA多肽和一个或多个宿主细胞。所述“密码子优化”可以通过多种方法来进行,例如,通过选择优选用于在给定的宿主细胞中高度表达的基因的密码子。在一些情况下,使用并有高度表达的细菌基因的密码子偏好性的密码子频率表如“Ecohigh.cod”的计算机算法并且,所述算法由威斯康星洲麦迪逊的Genetics ComputerGroup的Wisconsin包9.0版提供。其它有用的密码子频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”以及“Yeast_high.cod.”。
在某些方面,使用标准的连接技术将编码OspA多肽的氨基酸序列的核酸分子***适当的表达载体。典型地选择在采用的特定宿主细胞中能够发挥作用的载体(即,载体可与宿主细胞的机制相容,这样使得可以进行基因的扩增和/或基因的表达)。在各个方面,编码OspA多肽的氨基酸序列的核酸分子是在原核、酵母菌、昆虫(杆状病毒***)和/或真核宿主细胞中进行扩增/表达。宿主细胞的选择部分取决于OspA多肽是会被翻译后修饰(例如,糖基化和/或磷酸化)。如果是,那么优选酵母菌、昆虫或哺乳动物宿主细胞。对于表达载体的评论,参见Meth.Enz.,第185卷,D.V.Goeddel编.,Academic Press Inc.,SanDiego,CA(1990)。
克隆载体包括本领域中已知的所有载体。参见,例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版.Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在一个方面,pUC18用作所有中间步骤的克隆载体,这是因为用这种质粒比用载体pET30a更易于进行基因操纵和测序。主要特点显然是编码LacZα肽的lacZ基因片段是从碱基对149至469(lac启动子在碱基对507处),编码氨西比林抗性决定子的bla基因是从碱基对1629至2486(bla启动子在碱基对2521处),复制起点在碱基对867处,以及多个克隆位点是从碱基对185至451(图12)。
表达载体包括本领域中所有已知的载体,包括但不限于并有重组的多核苷酸的粘粒、质粒(例如,裸或脂质体中含有的质粒)以及病毒。使用本领域中已知的技术经由转化或转染将表达载体***(例如,经由转化或转导)适当的宿主细胞中以便表达多核苷酸和多肽。参见,例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版.Cold Spring Harbor,N.Y:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在一方面,pET30a(Novagen)是用作用于最终完整的OspA基因***的表达载体。在pET载体中,基因是在T7启动子的控制下进行克隆并且通过在宿主细胞中提供T7RNA聚合酶的来源来诱导表达(直到提供T7RNA聚合酶的来源时才发生表达)。主要特点是编码卡那霉素抗性(kan)的基因在碱基对4048至4860处,lacI基因在碱基对826至1905处、F1复制起点在碱基对4956至5411处,以及多个克隆位点是从碱基对158至346(图13)。
在已构建载体并且已将编码OspA多肽的核酸分子***载体的合适的位点之后,将完整的载体***适合的宿主细胞以用于扩增和/或多肽表达。在各个方面,OspA多肽的表达载体转化进入选择的宿主细胞是通过熟知的方法如转染、感染、氯化钙介导的转化、电穿孔、微注射、脂转染或DEAE葡聚糖方法或其它已知的技术来完成。选择的方法将部分地随待使用的宿主细胞的类型而变化。这些方法和其它适合的方法为技术人员所熟知并且例如阐述于上文的Sambrook等中。
在一些方面,宿主细胞是原核宿主细胞(如大肠杆菌)或真核宿主细胞(如酵母菌、昆虫或脊椎动物细胞)。宿主细胞在适当的条件下进行培养时合成OspA多肽,所述OspA多肽随后可以从培养基进行收集(如果宿主细胞将所述多肽分泌到培养基)或直接从产生所述多肽的宿主细胞进行收集(如果所述多肽未被分泌)。适当的宿主细胞的选择取决于各种因素,如希望的表达水平、活性所需或必要的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的难易程度。所述宿主细胞包括但不限于细菌、酵母菌、真菌、病毒、无脊椎动物以及哺乳动物来源的宿主细胞。对于所述宿主细胞的实例,参见Maniatis等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。在其它方面,自Maniatis(上文的)手册出版以来本领域中使用的宿主细胞也用于本发明中。
在一方面,宿主细胞是大肠杆菌细胞。大肠杆菌的适合的菌株包括但不限于BL21、DH5α、HMS174(DE3)、DH10B或E.CLONI 10G(Lucigen,Middleton,Wis.)。在一些实施方案中,将宿主细胞进行工程改造以便增强载体的转化效率和/或维护。
在一方面,大肠杆菌菌株DH5α[基因型:endA1hsdR17(rK-mK+)supE44thi-1recA1gyrA(Nalr)relA 1D(lacZYA-argF)U 169deoR(F80dlacD(lacZ)M15](Gibco BRL)用于所有的中间克隆步骤中。这一菌株源自于在基因工程改造中使用最广泛的宿主之一:大肠杆菌菌株K12。菌株为amp-,以便允许选择具有含有氨西比林抗性基因(amp)的载体的转化株。
在另一方面,大肠杆菌菌株HMS174(DE3)被用作用于表达的宿主。大肠杆菌HMS174(DE3)宿主细胞[基因型:F-recA1hsdR(rk12-mk12+)RifR(DE3)](Novagen)用于本文描述的各种实施例中,以用于最终的克隆步骤。菌株为kan-,以便允许选择具有含有卡那霉素抗性基因(kan)的载体的转化株。
使用技术人员熟知的标准培养基来培养包含OspA多肽表达载体的宿主细胞。所述培养基通常将含有细胞生长和存活所必要的所有营养素。用于培养大肠杆菌细胞的适合的培养基包括例如卢里亚肉汤(LB)和/或极品肉汤(TB)。用于培养真核细胞的适合的培养基包括罗斯维尔公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培养基1640(RPMI1640)、最低必须培养基(MEM)和/或达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium,DMEM),在一些情况下,所有这些培养基被补充有如正在培养的特定细胞系指示的血清和/或生长因子。用于昆虫培养的适合的培养基是必要时由酵母自溶液、水解乳白蛋白和/或胎牛血清补充的格雷氏培养基(Grace's medium)。
典型地,可用于被转化的细胞的选择性生长的抗生素或其它化合物作为补充物被添加至培养基中。待使用的化合物将由存在于转化宿主细胞所用的质粒上的可选标记元件进行规定。例如,在可选标记元件是卡那霉素抗性时,添加至培养基的化合物将为卡那霉素。用于选择性生长的其它化合物包括氨西比林、四环素以及新霉素。
由宿主细胞产生的OspA多肽的量可以使用本领域中已知的标准方法来进行评估。这类方法包括但不限于蛋白印迹分析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、色谱分离如高效液相色谱法(HPLC)、免疫检测如免疫沉淀和/或活性测定如DNA结合凝胶位移测定。
在一些情况下,OspA多肽在分离时不具备生物活性。用于“再折叠”或转换多肽至它的三级结构并且产生二硫键的各种方法被用于恢复生物活性。所述方法包括在特定浓度的促溶剂的存在下将溶解的多肽暴露于通常大于7的pH值。促溶剂的选择与用于包涵体增溶的选择相似,但促溶剂通常在较低的浓度下使用并且不必与用于增溶的促溶剂相同。在一些情况下,再折叠/氧化溶液还含有还原剂或具体比例的还原剂+它的氧化形式以便产生特定的氧化还原电位,从而允许在一个或多个蛋白的半胱氨酸桥的形成过程中发生二硫键移位。一些普遍使用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫双GSH、氯化亚铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷(DTT)以及2-2巯基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。共溶剂经常被使用来增加再折叠的效率,并且用于这一目的的更普遍的试剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
如果在表达OspA多肽时,未形成有效程度的包涵体,那么在细胞匀浆物的离心作用之后主要在上清液中发现所述多肽。使用方法如本文描述的那些方法或本领域中另外已知的方法使多肽进一步从上清液中分离。
来自溶液的OspA多肽的纯化可以使用本领域中已知的多种技术来完成。如果多肽已被合成,使得所述多肽在它的羧基或氨基末端处含有标记物如六聚组氨酸(OspA多肽/六聚His)或其它小肽如FLAG(Eastman Kodak Co.,New Haven,CT)或myc(Invitrogen,Carlsbad,CA),那么多肽经常在一步法中通过使溶液通过亲和柱得以纯化,在所述亲和柱中,柱基质对标记物具有高的亲和力。例如,聚组氨酸以大的亲和力和特异性结合镍;因此镍的亲和柱(如镍柱)可以用于纯化OspA多肽/聚合His。参见,例如Ausubel等编,Current Protocols inMolecular Biology,第10.11.8节,John Wiley&Sons,纽约州(1993)。
此外,OspA多肽可以通过使用能够特异地识别并且结合OspA多肽的单克隆抗体进行纯化。用于纯化的适合的程序因此包括但不限于亲和色谱法、免疫亲和色谱法、离子交换色谱法、分子筛色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、电泳(包括非变性凝胶电泳)之后凝胶洗脱,以及制备型等电位聚焦(“Isoprime”仪/技术,Hoefer Scientific,San Francisco,CA)。在一些情况下,组合两种或更多种纯化技术来达成增加的纯度。
还使用本领域中已知的技术通过化学合成方法(如固相肽合成)来制备OspA多肽,如由Merrifield等,J.Am.Chem.Soc.,85:2149(1963)、Houghten等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5132(1985)以及Stewart&Young,"Solid Phase PeptideSynthesis",Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)阐述的那些技术。所述多肽被合成,在氨基末端上具有或没有甲硫氨酸。在一些方面,使用在这些参考文献中阐述的方法来使化学合成的OspA多肽氧化以便形成二硫桥。化学合成的OspA多肽有望具有可与由重组产生或从天然来源纯化而来的相应OspA多肽可比的生物活性,并且因此经常可与重组OspA多肽互换使用。应了解的是,本领域中已知用于产生核酸和多肽的众多其它的方法,并且所述方法可以用于产生OspA多肽。
OspA多肽分子的化学衍生物
考虑到本文中以下阐述的公开内容,本领域技术人员可制备OspA多肽的被化学修饰的衍生物。以与天然附接至多肽的分子的类型或位置不同的方式来修饰OspA多肽衍生物。在一些方面,衍生物包括由一个或多个天然附接的化学基团的缺失而形成的分子。在一方面,包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173或者OspA多肽变体的氨基酸序列的多肽是通过共价附接一种或多种聚合物而被修饰。例如,所选择的聚合物典型地是水溶性的,这样使得聚合物附接的蛋白在水相环境如生理环境中不会发生沉淀。适合的聚合物的范围包括聚合物的混合物。在某些方面,对于最终产物制剂的治疗用途来说,聚合物将是药学上可接受的。
在各个方面,聚合物各自具有任何的分子量并且具有支链或不具有支链。聚合物各自典型地具有介于约2kDa至约100kDa之间的平均分子量(术语“约”指示在水溶性聚合物的制剂中,一些分子将重于或一些分子将轻于所陈述的分子量)。在各个方面,每种聚合物的平均分子量是介于约5kDa至约50kDa、介于约12kDa至约40kDa以及介于约20kDa至约35kDa。
适合的水溶性聚合物或其混合物包括但不限于N键联或O键联的碳水化合物;糖;磷酸盐;聚乙二醇(PEG)(包括已用于衍生蛋白的PEG形式,包括单-(C1-C10)氧烷基-或芳氧基-聚乙二醇);单甲氧基聚乙二醇;葡聚糖(如(例如)约6kDa的低分子量葡聚糖);纤维素;或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡硌烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylatedpolyol)(例如,甘油)以及聚乙烯醇。本发明还涵盖的是有时用于制备多肽的共价附接多聚体的双功能交联分子,所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173或者OspA多肽变体的氨基酸序列。
在一些方面,化学衍生是在用于使蛋白与活化聚合物分子发生反应的任何适合的条件下进行。用于制备多肽的化学衍生物的方法通常包括以下步骤:(a)在包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171或173或者OspA多肽变体的氨基酸序列的多肽被附接至一个或多个聚合物分子的条件下使多肽与活化聚合物分子(如聚合物分子的反应性酯或醛衍生物)发生反应,和(b)获得一种或多种反应产物。最佳的反应条件是基于已知的参数和所希望的结果来确定的。例如,聚合物分子:蛋白的比例越大,被附接的聚合物分子的百分比越大。在一个实施方案中,OspA多肽衍生物在氨基末端处具有单一个聚合物分子部分(参见,例如美国专利号5,234,784)。
在某些方面,多肽的PEG化具体是通过本领域中已知的任何PEG化反应来进行,如例如在以下参考文献中所描述:Francis等,Focus onGrowth Factors,3:4-10(1992);EP0154316;EP 0401384以及美国专利号4,179,337。例如,如本文中所描述,PEG化是经由与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行。对于酰化反应来说,所选择的一种或多种聚合物应具有单一个反应性酯基。对于还原烷基化来说,所选择的一种或多种聚合物应具有单一个反应性醛基。例如,反应性醛是水稳定性聚乙二醇丙醛或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利号5,252,714)。
在另一个实施方案中,将OspA多肽化学连接至生物素,并且然后允许偶联的生物素/OspA多肽分子结合至抗生物素蛋白,从而产生四价的抗生物素蛋白/生物素/OspA多肽分子。还将OspA多肽共价连接至二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP),并且使所得的偶联物与抗DNP或抗TNP-IgM一起沉淀以便形成化合价为10的十聚偶联物。在某些方面,与非衍生分子相比,本文公开的OspA多肽衍生物具有其它活性、增强的或减弱的生物活性或其它特征如增加的或降低的半衰期。
免疫原性组合物、疫苗以及抗体
本发明的一些方面包括免疫原性组合物和疫苗。本发明的免疫原性嵌合OspA分子与一种或多种抗原组合使用以便在受试者体内引出抗OspA免疫反应(即,充当疫苗)。示例性免疫原性OspA多肽(SEQ IDNO:2、4、6、169、171以及173)被组合递送以便引出针对疏螺旋体属的血清型1至6中的任何一种或多种血清型,并且更通常来说针对如本文论述的疏螺旋体属的许多其它种类的免疫反应。免疫反应还可以通过递送编码本发明的OspA多肽的质粒载体(即,施用“裸DNA”)来产生。在一些方面,OspA核酸分子(SEQ ID NO:1、3、5、168、170以及172)是通过注射、经由脂质体或通过本文描述的其它施用方式来进行递送。一旦接受免疫,受试者就会引出针对疏螺旋体属的血清型1至6和疏螺旋体属的其它种类的OspA蛋白的加强的免疫反应。
如上文所陈述,因此包括OspA多肽与OspA核酸分子作为抗原用于本发明的免疫原性和/或疫苗组合物中。在某些方面,将核酸与蛋白都递送给受试者。在特定方面,提出针对核酸疫苗的免疫反应通过同时施用同族蛋白而得以增强(参见WO 99/30733)。核酸和蛋白不需要在相同的组合物中施用。核酸与蛋白必须仅在免疫反应的诱导期期间进行施用,免疫反应在一些方面被掩蔽或阻止直到核酸已激发免疫***。在特定方面,旨在使疫苗将核酸和蛋白抗原递送至抗原递呈细胞中(参见WO 97/28818)。在各个方面,核酸和蛋白是例如通过共价偶联来进行复合的。在另一些方面,还包括脂质体制剂以便增强疫苗抗原的免疫原性。
在某些方面,本发明的免疫原性组合物包括本文描述的任何一种或多种OspA分子组合药学上的载体,其中组合物诱导产生特异地结合外膜蛋白A(OspA)蛋白的抗体。在一些方面,免疫原性组合物还包含稳定剂或抗菌性防腐剂。在特定方面,免疫原性组合物诱导产生特异地结合疏螺旋体属的抗体。在其它方面,组合物诱导产生中和疏螺旋体属的抗体。
在一些方面,本发明包括在包含本文描述的嵌合OspA分子(抗原)的免疫原性组合物中使用佐剂。在某些方面,如果抗原与佐剂共同施用,那么免疫原性会显著提高。在一些方面,使用的佐剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.001%至50%的溶液。佐剂增强抗原的免疫原性但本身不必具有免疫原性。
在各个方面,佐剂对接种疫苗具有许多正面影响。在一些情况下,佐剂加速稳固的免疫反应在受试者体内的产生。在其它情况下,佐剂增加免疫反应的水平,延长免疫反应的持续时间并且提高免疫记忆。佐剂经常被用于克服特定受试者组(例如,年长患者或免疫受到抑制的患者)的变弱的免疫性或提高特定“高危组”(如但不限于极为年幼或年长的组)的免疫原性。在各个方面,佐剂的免疫增强作用引起在最终制剂中给出保护性反应所需的抗原的量的减少(即,节省剂量)。
通常来说,佐剂基于它们的主导作用机制而被分成两个主要的组:第一组是先天性免疫***受体或传感器的激动剂,如钟样受体(TLR)激动剂、C型凝集素受体激动剂、视黄酸诱导基因1(RIG-1)样受体(RLR)激动剂以及含有核苷酸结合域和富含亮氨酸的重复的受体(NLR)激动剂。第二组是充当递送***的又称为TLR独立佐剂的物质。TLR激动剂佐剂的实例是ASO4(Glaxo Smith Kline),一种作为佐剂用于商用乙型肝炎和***状瘤(papilloma)病毒疫苗中的TLR-4激动剂;Vaxinate,一种鞭毛蛋白融合蛋白TLR-5激动剂;以及众多的TLR-9激动剂佐剂,如使用双链DNA(dsDNA)和寡核苷酸CpG或ODN1a的那些激动剂佐剂。属于这一类别佐剂的其它TLR激动剂包括糖脂类(TLR-1)、脂磷壁酸和脂蛋白(TLR-1/TLR-2和TLR-2/TLR-6)脂多糖、脂寡糖和单磷酰脂质A(MPL)(TLR-4)、双链RNA(TLR-3);肽聚糖(TLR-6)、单链RNA(TLR-7)。两种C型凝集素受体激动剂佐剂的实例包括均源自于真菌细胞壁的β-葡聚糖(凝集素-1)和甘露聚糖(凝集素-2)。RLR受体激动剂佐剂包括单链病毒RNA和双链病毒DNA,而NLR激动剂佐剂包括肽聚糖降解产物、微生物产物以及非感染性晶体颗粒。在所有情况下,激动剂通过直接激活先天性免疫***受体以便触发免疫增强炎症反应来起作用。第二组佐剂即TLR独立佐剂大多充当递送***并且通过抗原递呈细胞增强抗原摄取和抗原呈递。在一些情况下,这些佐剂还可以通过使抗原局部地保留在施用部位附近以便产生促进抗原缓慢而持续地释放到免疫***的细胞的储库效应来起作用。佐剂还将免疫***的细胞吸引到抗原储库并且刺激所述细胞以便引出免疫反应。TLR独立佐剂的实例包括矿物盐,如氢氧化铝和磷酸铝(统称为明矾)以及磷酸钙;水包油乳液(例如,MF59、AS03以及ProVax);油包水乳状液(Montanide、TiterMax);生物聚合物(Advax);植物衍生物,尤其是皂苷的部分,所述皂苷的部分是来自南美皂皮树(Quillaja saponaria)的树皮的三萜系化合物提取物(SFA-1、QS21、Quil A);主要由皂苷部分、甾醇以及任选地磷脂组成的免疫刺激复合物(ISCOM和ISCOM基质)(ISCOMATRIX和Matrix-M);脂质体,其是具有各种大小和带电性的磷脂球(Vaxfectin和Vaxisome);病毒样颗粒和病毒体,其是含有病毒表面抗原如流行性感冒血细胞凝集素和神经氨酸苷酶的脂质体;具有各种组成的纳米颗粒;壳聚糖、肽如聚精氨酸以及称为KLK肽的一种肽。
单独或组合使用本文以上列出的佐剂。TLR依赖性佐剂和TLK独立佐剂的组合经常优选作为抗原,并且相信TLR依赖性佐剂通过TLR独立佐剂运输至抗原递呈细胞,这同样会刺激摄取和稳定性,而TLR依赖性佐剂将通过激活TLR信号传导来直接增强免疫力。
TLR依赖性和TLR独立佐剂组合的实例包括AS01:MPL(TLR-4激动剂)、脂质体以及QS-21(均是TLR独立佐剂)的混合物;AS04:MPL(TLR-4激动剂)和氢氧化铝/磷酸盐;IC31:ODN1a(TLR-9激动剂)和KLK肽(TLR独立佐剂);以及费氏完全佐剂(一种结核分枝杆菌(TLR-4激动剂)的膜提取物)与水包油乳液(TLR独立佐剂)。
组要由多个TLR独立佐剂组成的组合也被用于最大化加入佐剂的疫苗制剂的免疫增强作用。使用不同衔接子蛋白的TLR激动剂经常进行组合(例如,用于质膜结合TLR-3或TLR-4受体的激动剂与TLR(TLR-7、TLR-8以及TLR-9)激动剂的组合,所述质膜结合TLR-3或TLR-4受体利用TRIF(含有钟/白介素1受体域的衔接子蛋白诱导INF-β)衔接子途径,所述TLR(TLR-7、TLR-8以及TLR-9)在胞内体细胞器或溶酶体细胞器中进行表达并且利用MyD88(髓性分化原发反应蛋白)衔接子蛋白途径)。
这些免疫刺激性试剂或佐剂也提高了疫苗的宿主免疫反应。在一些情况下,物质如脂多糖类可以充当内在佐剂,因为它们通常是用作疫苗的被杀死或减毒细菌的组分。外在佐剂如本文以上列出的那些是典型地非共价连接至抗原并且经过配制来增强宿主免疫反应的免疫调节剂。
宽范围的外在佐剂可以激起对抗原的有力的免疫反应。这些佐剂包括复合至膜蛋白抗原的皂苷(免疫刺激性复合物)、普流尼克聚合物与矿物油,含被杀死的分枝杆菌的矿物油、费氏完全佐剂、细菌产物如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A和脂质体。在某些方面,为了有效地诱导体液免疫反应(HIR)和细胞介导的免疫性(CMI),免疫原在佐剂中被乳化。
理想佐剂的合意特征包括以下任何特征或所有特征:缺乏毒性;刺激持久的免疫反应的能力;制造简易性和长期储存稳定性;引出针对经由各种途径施用的抗原的CMI和HIR的能力;与其它佐剂的协同性;选择性地与抗原呈递细胞(APC)群体进行相互作用的能力;特异地引出适当的TH1或TH2细胞特异性免疫反应的能力;以及针对抗原选择性地增加适当的抗体同种型(例如,IgA)水平的能力。
以引用的方式并入本文中的美国专利号4,855,283教导包括N-糖基酰胺、N-糖基脲以及N-糖基氨基甲酸酯的糖脂类似物,所述糖脂类似物各自在糖残基处被氨基酸取代,作为免疫调节剂或佐剂。美国专利号4,855,283报道显示出与天然存在的糖脂如鞘糖脂和甘油糖脂的结构相似性的N-糖脂类似物能够在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中引出强大的免疫反应。一些糖脂已由通过异头碳原子直接与糖连接的长链烷基胺和脂肪酸合成而来,以便模拟天然存在的脂质残基的功能。
在一些方面,免疫原性组合物含有足够增强针对免疫原的免疫反应的量的佐剂。适合的佐剂包括但不限于铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、单磷酰基脂质A、分枝菌酸衍生物、非离子性嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈(Polphosphazene)和衍生物以及免疫刺激性复合物(ISCOM)如由Takahashi等(Nature 344:873-875,1990)描述的那些。在一些方面,佐剂是合成佐剂。在特定方面,合成佐剂是吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)。
本发明的另一方面是一种包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的载体的疫苗。如本文以上所论述,在某些方面,疫苗包括一种或多种稳定剂和/或一种或多种防腐剂。
在一方面,提供了包含至少一种重组表达构建体和佐剂的疫苗,所述至少一种重组表达构建体包含操作地连接至编码抗原(本文描述的嵌合OspA多肽)的核酸序列的启动子。在一个实施方案中,重组表达构建体(包含OspA多核苷酸的表达载体)存在于病毒载体中,在另外某些实施方案中存在于选自以下的病毒中:腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒以及逆转录酶病毒。
本发明的另外方面包括本文描述的嵌合OspA分子的抗体。在各个方面,本发明包括嵌合OspA分子以便制作抗OspA抗体并且提供针对疏螺旋体属感染的免疫性。在一些方面,向受试者(例如,被动免疫)施用这些抗OspA抗体(例如,鼠类、人类或人源化单克隆抗体或单链抗体)以便实现针对疏螺旋体属的血清型1至6中的任何一种或多种血清型的OspA蛋白的免疫反应。如本文所使用,术语“抗体”是指对一种或多种OspA多肽具有特异性的分子。使用本领域中已知的方法来制备适合的抗体。在某些方面,OspA抗体能够结合OspA多肽的某些部分,由此抑制多肽与一种或多种OspA多肽受体的结合。结合本发明的嵌合OspA多肽的抗体和抗体片段是在本发明的范围之内。
在一些方面,本发明的抗体包括特异地结合通过用多肽对动物进行免疫而产生的一种或多种OspA多肽的抗体或其片段,所述多肽包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、169、171以及173组成的组的氨基酸序列。在其它方面,本发明包括特异地结合多肽的抗体或其片段,所述多肽由选自由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、168、170以及172组成的组的核酸序列编码。在各个方面,抗体或其片段是人类的、人源化的、多克隆的或单克隆的。在另一些方面,抗体是Fab或Fab'抗体。在特定方面,抗体包含可检测的标签。在一些方面,抗体是抗体的经过化学修饰的衍生物。
根据本发明的嵌合OspA分子的施用刺激人类或动物体内的免疫或抗体反应。在一些方面,一起施用三种嵌合OspA分子(例如,脂质化OspA 1/2251、脂质化OspA 6/4OspA以及脂质化OspA5/3;或原始OspA 1/2、原始OspA 6/4以及原始OspA 5/3)以便引出针对本文论述的所有六种血清型(1至6)的抗体反应。这种抗体反应意指本发明方法在各个方面仅用于刺激免疫反应(与还为保护性反应相对),因为所得抗体(不具有保护作用)尽管如此也还是有用的。通过本领域中熟知的技术从引出抗体来制备单克隆抗体;并且那些单克隆抗体被用于熟知的抗体结合测定、诊断试剂盒或测试中以便确定广义伯氏疏螺旋体的存在或不存在或者确定是否已简单地刺激了针对螺旋体的免疫反应。在某些方面,单克隆抗体被用于免疫吸附色谱法以便回收或分离疏螺旋体属抗原如OspA。
在各个方面,本发明的OspA抗体是多克隆的,包括单特异性多克隆抗体、单克隆(MAbs)抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体如CDR移植抗体、人类抗体、单链抗体和/或双特异性抗体,以及其片段、变体或衍生物。抗体片段包括结合至OspA多肽上的表位的抗体的那些部分。所述片段的实例包括由全长抗体的酶促裂解产生的Fab和F(ab’)的片段。其它结合片段包括由重组DNA技术如含有编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒的表达产生的那些片段。
针对OspA多肽的多克隆抗体通常是借助于OspA多肽和佐剂的多次皮下注射、肌内注射或腹膜内注射而在受试者(包括兔、小鼠或其它动物或哺乳动物)体内产生。在某些方面,使本发明的OspA多肽偶联至载体蛋白是有用的,所述载体蛋白在待免疫的物种中具有免疫原性,如钥孔虫戚血兰素、血清、生蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。而且,佐剂如明矾被用于增强免疫反应。在免疫之后,从被免疫的受试者体内抽取血样并且测定血清的抗OspA多肽抗体效价。
针对OspA多肽的单克隆抗体是通过使用通过培养物中的连续的细胞系提供抗体分子的产生的任何方法来产生。用于制备单克隆抗体的适合的方法的实例包括Kohler等,Nature,256:495-497(1975)的杂交瘤法和Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)与Brodeur等,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,第51至63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987)的人类B细胞杂交瘤法。本发明还提供产生与OspA多肽发生反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
在一些情况下,本发明的单克隆抗体经过修饰用作治疗剂。一个实施方案是“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与源自于特定的物种或属于特定的抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源,而链的剩余部分与源自于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源。还包括所述抗体的片段,只要它们展示出所希望的生物活性即可。参见美国专利号4,816,567和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1985)。
在另一个实施方案中,本发明的单克隆抗体是“人源化”抗体。本领域中熟知用于人源化非人类抗体的方法(参见美国专利号5,585,089和5,693,762)。通常来说,人源化抗体具有来自一个非人类来源的一个或多个氨基酸残基被引入所述抗体。例如,可以使用本领域中描述的方法(Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988))通过用啮齿动物互补决定区(CDR)的一部分取代人类抗体的相应区域来进行人源化。
在一个替代实施方案中,人类抗体由噬菌体展示文库产生(Hoogenboom等,J.Mol.Biol.227:381(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581(1991))。这些方法通过展示丝状噬菌体表面上的抗体谱并且随后通过它们与所选抗原的结合来选择噬菌体来模拟免疫鉴定。一种所述技术被描述于PCT申请号PCT/US98/17364(Adams等),该申请描述了使用所述方法来分离针对MPL-和msk-受体的高亲和力和功能上激动的抗体。
嵌合、CDR移植以及人源化抗体典型地是通过重组方法来产生。使用本领域中已知的或本文描述的材料和程序将编码抗体的核酸引入宿主细胞并且进行表达。在一个实施方案中,抗体产生于哺乳动物宿主细胞如CHO细胞中。在各个方面,单克隆(例如,人类)抗体是通过重组DNA在宿主细胞中的表达或如本文所描述通过在杂交瘤细胞中表达来产生。在一些方面,单克隆抗体或其片段被人源化。在特定方面,单克隆抗体是如本文描述的F237/BK2。
在某些方面,本发明包括用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法,所述方法包括向受试者施用可有效预防或治疗疏螺旋体属感染或莱姆病的量的如本文描述的抗体或其片段的步骤。在特定方面,抗体或其片段是高免疫血清、高免疫血浆或其纯化的免疫球蛋白部分。在其它方面,抗体或其片段是纯化的免疫球蛋白制剂或免疫球蛋白片段制剂。
在各个方面,本发明的抗OspA抗体被用于任何已知的测定方法,如竞争性结合测定、直接和间接夹心式测定以及免疫沉淀测定(Sola,Monoclonal Antibodies:A Manualof Techniques,第147-158页(CRCPress,Inc.,1987)),以用于检测和量化OspA多肽。抗体将以对于所采用的测定方法来说适当的亲和力结合OspA多肽。
在某些方面,对于诊断或临床应用来说,抗OspA抗体被标记有可检测部分。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如,在某些方面,可检测部分是放射性同位素,如3H、14C、32P、35S或125I;荧光化合物或化学发光化合物,如异硫氰酸荧光素、若丹明或萤光素;或酶,如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶(Bayer等,Meth.Enzym.184:138-163(1990))。
竞争性结合测定依赖于被标记的标准(例如,OspA多肽或其免疫反应性部分)与测试样品分析物(OspA多肽)竞争结合有限数量的抗OspA抗体的能力。测试样品中OspA多肽的量与结合至抗体的标准的量成反比。为了促进确定结合的标准的量,典型地使抗体在竞争之前或之后不溶解,这样使得可方便地分离结合至抗体的标准和分析物与仍未结合的标准和分析物。
夹心式测定典型地包括使用两种抗体,每种抗体能够结合至待检测和/或待量化的蛋白的不同免疫原性部分或表位。在夹心式测定中,测试样品分析物典型地是通过固定在固体支撑物上的第一抗体来结合,并且此后第二抗体结合至分析物,从而形成不可溶的三部分复合物。参见,例如美国专利号4,376,110。在一些情况下,第二抗体本身标记有可检测部分(直接夹心式测定)或者第二抗体使用标记有可检测部分的抗免疫球蛋白抗体来进行测量(间接夹心式测定)。例如,一种类型的夹心式测定是酶联免疫吸附测定(ELISA),在该情况下,可检测部分是酶。
抗OspA抗体也可用于体内成像。在某些方面,将标记有可检测部分的抗体施用于动物的血流中,并且测定经过标记的抗体在宿主体内的存在和位置。在各个方面,抗体标记有在动物体内可检测的任何部分,无论是通过核磁共振、放射学还是本领域中已知的其它检测手段。在本发明的一些方面,OspA抗体用作治疗剂。
嵌合OspA组合物和施用
为了将本文描述的OspA嵌合多肽施用于受试者,将OspA多肽配制成包含一种或多种药学上可接受的载体的组合物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指如下文所描述,分子实体和组合物在使用本领域中熟知的途径进行施用时不产生过敏反应或其它不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。在一些方面,组合物与水或常见有机溶剂形成溶剂合物。同样包括所述溶剂合物。
在各个方面,本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物进行口服施用、局部施用、经皮施用、肠胃外施用、通过吸入喷雾施用、经***施用、直肠施用或通过颅内注射施用。如本文使用的术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、脑池内注射,或输注技术。同样涵盖静脉内注射、真皮内注射、肌肉内注射、***内注射、腹膜内注射、鞘内注射、眼球后注射、肺内注射和/或在特定部位处进行外科植入的施用。通常来说,组合物基本上不含有热原以及可能对接受者产生伤害的其它杂质。
药用组合物的制剂将根据所选择的施用途径而变化(例如,溶液、乳液)。包含待施用的组合物的适当的组合物是在生理学上可接受的媒介物或载体中进行制备。对于溶液或乳液来说,适合的载体包括例如水或醇的溶液/水溶液、乳液或混悬液,包括盐水和缓冲介质。在一些方面,肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏油或固定油。在某些方面,静脉内媒介物包括各种添加剂、防腐剂,或液体、营养素或电解质补充物。
在各个方面,取决于施用途径,在含有OspA多肽作为活性成分的本发明的化合物和方法中有用的药用组合物含有药学上可接受的载体或添加剂。所述载体或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄胞原、***胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。取决于本发明的剂量形式,适当时,所使用的添加剂选自但不限于上述物质或其组合。
在各个方面,多种水性载体(例如,水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸或水性混悬液)含有与适于制造水性混悬液的赋形剂相混合的活性化合物。这类赋形剂是悬浮剂,例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶以及***胶;分散剂或润湿剂,在一些情况下,是天然存在的磷脂,例如卵磷脂或环氧烷与脂肪酸的缩合产物,例如聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物,例如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或环氧乙烷与源自于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯,或环氧乙烷与源自于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物,例如聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯(polyethylene sorbitanmonooleate)。在一些方面,水性混悬液含有一种或多种防腐剂,例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。
在一些方面,OspA组合物在使用之前进行冷冻干燥以用于存储并且在适合的载体中进行复原。已显示出这一技术对于常规免疫球蛋白来说是有效的。采用了本领域中已知的任何适合的冷冻干燥和复原技术。本领域技术人员应了解的是,冷冻干燥和复原会引起不同程度的抗体活性损失并且经常要调节用量以便进行补偿。
适于通过添加水来制备水性混悬液的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性化合物。上文已经提及的那些物质示例出适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂。
在某些方面,在这些制剂中的OspA的浓度差别很大,例如按重量计从小于约0.5%(通常为或至少约1%)至多达15%或20%,并且根据所选择的特定施用模式,主要基于液体体积、粘度等而进行选择。因此,例如并且在无限制情况下,用于肠胃外注射的典型的药用组合物被制作成含有1ml无菌缓冲水和50mg凝血因子。用于静脉内输注的典型组合物可以被制作成含有多达250ml无菌林格氏溶液和150mg凝血因子。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于所属领域技术人员来说是已知并且显而易见的,并且被更详细描述在例如Remington's Pharmaceutical Science,第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1980)。每次施用的有效剂量通常在每公斤体重0.01mg至1000mg范围内。
在各个方面,药用组合物是呈无菌可注射水性、油质混悬液,分散液或用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末形式。在一些方面,混悬液是根据已知技术使用上文提及的那些适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。在某些方面,无菌可注射制剂是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶或混悬液,例如作为1,3-丁二醇中的溶液。在一些实施方案中,载体是溶剂或分散介质,含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇以及液态聚乙二醇等)、其适合的混合物、植物油、林格氏溶液以及等渗氯化钠溶液。此外,无菌固定油常规上被用作溶剂或悬浮介质。在各个方面,为此目的采用了包括合成甘油或甘油二酯的任何温和的固定油。此外,脂肪酸如油酸可用在制备可注射物中。
在所有的情况下,所述形式必须是无菌的并且必须是流体性的到存在可易于注射性的程度。合适的流动性通过例如以下得以维持:使用涂层如卵磷脂,在分散液情况下维持所需的粒径以及使用表面活性剂。所述形式在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染行为进行保存。对微生物行为的预防通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现,所述抗菌剂和抗真菌剂例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下,需要包括等渗剂,例如,糖或氯化钠。在某些方面,可注射组合物的延长吸收通过在组合物中使用延迟吸收剂来实现,所述延迟吸收剂例如,单硬脂酸铝和明胶。
在某些方面,可用于施用的组合物是与摄取增强剂或吸收增强剂一起配制以便提高它们的功效。所述增强剂包括(例如)水杨酸、甘氨胆酸盐/亚油酸盐、乙醇酸盐(glycholate)、抑肽酶、杆菌肽、SDS、癸酸盐等。参见,例如Fix(J.Pharm.Sci.,85:1282-1285,1996)和Oliyai等(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:521-544,1993)。
此外,用于本发明的化合物和方法中的组合物的亲水性和疏水性性质得到较好的平衡,由此增强了它们对体外和尤其是体内使用的实用性,而缺少所述平衡的其它组合物则具有大为减少的实用性。明确来说,本发明的组合物在水性介质中具有适当程度的溶解性,这允许体内的吸收和生物利用,同时在脂质中还具有一定程度的溶解性,这允许化合物穿过细胞膜到达推定的作用部位。
在特定方面,本文描述的OspA多肽被配制到包含佐剂的疫苗组合物中。本领域中已知的任何佐剂皆用于疫苗组合物的各个方面中,所述佐剂包括基于油的佐剂如费氏完全佐剂和费氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如,海藻糖二霉菌酸酯)、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即,胞壁质、粘肽或糖蛋白如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物)、蛋白聚糖(例如,从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)提取的蛋白聚糖)、链球菌制剂(例如,OK432)、BiostimTM(例如,01K2),EP 109 942、EP 180 564以及EP 231 039的“Iscom”,氢氧化铝、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol)、植物油(如花生油)、脂质体、多元醇、Ribi佐剂***(参见,例如GB-A-2 189 141)或白细胞介素,特别是刺激细胞介导的免疫性的那些佐剂。美国专利号4,877,612中已描述了由无枝酸菌属(Amycolata)-放线菌目(Actinomycetales)中的细菌属-的提取物组成的替代佐剂。此外,专利佐剂混合物是可商购的。使用的佐剂部分取决于接受的受试者。施用的佐剂的量取决于受试者的类型和体型。最佳剂量通过常规方法可易于确定。
疫苗组合物任选地包括疫苗相容性药学上可接受的(即,无菌并且无毒)充当药用媒介物、赋形剂或介质的液体、半固体或固体稀释剂。使用本领域中已知的任何稀释剂。示例性稀释剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟苯甲酯和羟苯丙酯、滑石、海藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、***胶、磷酸钙、矿物油、可可脂以及可可属油。
疫苗组合物被包装成便于递送的形式。组合物被封在胶囊、片剂、囊剂、扁囊剂、明胶、药纸或其它容器内。在与免疫原性组合物进入接受有机体相容时,特别是在以单位剂量形式递送免疫原性组合物时,优选这些递送形式。所述剂量单位被包装在例如片剂、胶囊、栓剂、小瓶或扁囊剂内。
本发明包括用于诱导受试者体内免疫反应(包括在哺乳动物宿主体内诱导Osp A抗体)的方法,所述方法包括施用有效量的本文描述的Osp A组合物。同样地,本发明包括用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文描述的疫苗组合物的步骤。
疫苗组合物通过本文以上详细描述的任何常规方法被引入待免疫的受试者中。在某些方面,在一段时间内以单剂量或多剂量施用组合物(如下文更详细描述)。
给予嵌合OspA组合物/用于诱导免疫反应的方法
待施用的免疫原性组合物或疫苗组合物的有用剂量将取决于改变药物作用的各种因素而发生变化,例如,受试者的年龄、状况、体重、性别以及饮食,任何感染的严重程度,施用时间,施用模式以及其它临床因素。
在一些方面,本发明的制剂或组合物通过初始大丸药,接着在一段时间过去之后加强递送来施用。在某些方面,本发明的制剂是通过初始大丸药,接着进行连续输注以便维持药物产品的治疗性循环水平来施用。在特定方面,本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物是在不同时间段之后以疫苗接种方案进行施用。在一些方面,疫苗接种是以对于去往易于受到疏螺旋体属感染的区域的旅行者来说快速的免疫方案来递送。作为另一个实施例,本发明的组合物或制剂是作为一次性剂量被施用。如由良好的医疗实践和个别受试者的临床状况所确定,本领域普通技术人员可易于优化有效的剂量和施用方案。给药频率取决于药剂的药物代谢动力学参数和施用途径。
药用制剂是由本领域技术人员根据施用途径和所希望的剂量确定。参见,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.(1990,MackPublishing Co.,Easton,PA18042)第1435-1712页,所述参考文献的公开内容是以引用的方式并入。在一些情况下,所述制剂影响被施用组合物的物理状态、稳定性、体内释放率以及体内清除率。取决于施用途径,在特定方面根据体重、体表面积或器官大小计算出适合的剂量。在一些方面,适当的剂量是通过使用用于确定血水平剂量的已建立的测定法结合适当的剂量-反应数据来确定的。在某些方面,测量个体的抗体效价以便确定最佳剂量和施用方案。最终剂量方案将由主治医生或医师确定,其中考虑改变药用组合物的作用的各种因素,例如,组合物的比活性,受试者的反应性,受试者的年龄、状况、体重、性别和饮食,任何感染的严重程度或恶性状况,施用时间以及其它临床因素。在进行研究时,将出现关于用于预防和/或治疗相关病状的适当剂量水平和治疗持续时间的其它的信息。
在某些方面,OspA免疫原性或疫苗组合物包含足以引起受试者体内的免疫反应的任何剂量的OspA核酸分子或多肽。治疗所采用的OspA免疫原性或疫苗组合物的有效量将取决于例如治疗环境和治疗目的。本领域技术人员应理解的是,用于疫苗接种或治疗的适当剂量水平因此将部分地取决于递送的分子、OspA分子使用针对的适应症、施用途径以及患者的体型(体重、体表面积或器官大小)和状况(年龄和总体健康状况)而发生变化。因此,在一些情况下,临床医师滴定剂量并且修改施用途径以便获得最佳治疗效果。
在各个方面,取决于上文提及的因素,典型剂量在从约0.1μg/kg至多达100mg/kg或更高的范围内。在其它实施方案中,剂量可以在从0.1μg/kg至多达约100mg/kg;或1μg/kg至多达约100mg/kg;或5μg/kg至多达约100mg/kg范围内。举例来说,本发明中有用的OspA多肽的剂量近似是10μg/ml,20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml、250μg/ml、260μg/ml、270μg/ml、280μg/ml、290μg/ml、300μg/ml、320μg/ml、340μg/ml、360μg/ml、380μg/ml、400μg/ml、420μg/ml、440μg/ml、460μg/ml、480μg/ml、500μg/ml、520μg/ml、540μg/ml、560μg/ml、580μg/ml、600μg/ml、620μg/ml、640μg/ml。在特定方面,典型剂量包含每位受试者0.1至5.0ml。在更特定方面,典型剂量包含每位受试者0.2至2.0ml。在某些方面,剂量包含每位受试者0.5至1.0ml。
给药的频率将取决于所使用的制剂中的OspA分子的药物代谢动力学参数。典型地,临床医师将施用组合物直到达到达成所希望的效果的剂量。在各个方面,组合物因此以单一剂量或者随着时间的推移以两个或更多个剂量(其可能或可能不含有相同量的所希望的分子),或者以连续输注经由植入设备或导管来进行施用。适当的剂量的进一步细化常规是由本领域普通技术人员来进行的并且在由他们常规进行的工作范围内。适当的剂量经常是通过使用常规获得的适当的剂量反应数据来确定。
试剂盒
作为另一方面,本发明包括包含用于向受试者施用一种或多种OspA多肽的一种或多种药用制剂的试剂盒,所述制剂以促进它们用于向受试者施用的方式进行包装。
在指定实施方案中,本发明包括用于产生单一剂量施用单元的试剂盒。在各个方面,试剂盒各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。本发明的范围内还包括含有单室和多室预装填注射器(例如,液体注射器和二室预装填注射器(lyosyringe))的试剂盒。
在另一个实施方案中,所述试剂盒包括本文描述的药用制剂(例如,包含治疗性蛋白或肽的组合物),所述药用制剂被包装在一个容器如密封瓶或器皿中,描述化合物或组合物在实践所述方法中的用法的标签被贴在容器上或被包括在包装中。在一个实施方案中,药用制剂被包装在容器中,以使得容器的顶部空间的量(例如,在液体制剂与容器顶部之间的空气的量)十分之小。优选地,顶部空间的量是可忽视的(即,几乎不存在)。
在一方面,试剂盒含有具有治疗性蛋白或肽组合物的第一容器和具有用于该组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一方面,药用制剂是以单位剂量形式进行包装。试剂盒任选地进一步包括适于根据特定施用途径来施用药用制剂的设备。在一些方面,试剂盒含有描述药用制剂的用法的标签。
本文引用的每个公开、专利申请、专利和其它参考文献是在与本公开相一致的程度上以引用的方式全部并入。
应理解的是,本文描述的实施例和实施方案仅是出于说明性目的并且根据所述实施例和所述实施方案的各种修改和变化将被提出给本领域技术人员且被包括在本申请的精神和权利范围以及随附权利要求的范围内。本文引用的所有公开案、专利以及专利申请是出于所有目的以引用的方式全部并入。