CN105961604A - 开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用 - Google Patents

开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，属于食品生物技术领域。开菲尔可应用于去除胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白及植酸的抗营养作用，是开菲尔的一种新用途。开菲尔发酵对蛋白质类抗营养因子活性有明显的去除作用，且去除效果具有发酵时间依赖关系。发酵24h的开菲尔豆酸奶中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白和植酸的残留率分别为12.6％％、46.6％、70.1％和96.7％，而发酵42h的残留率分别为10.6％％、43.8％、64.8％和93.6％，其中胰蛋白酶抑制剂活性已达到安全水平。实际应用中，可以将开菲尔用于去除豆酸奶、豆乳粉等食品生产过程中的抗营养因子，效果显著。

Description

开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及一种抗营养因子活性去除技术，具体的说，涉及开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，是一种利用开菲尔发酵去除传统生浆工艺制备乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸活性的新方法。
背景技术
大豆是我国的一种传统食品，其含有丰富的营养物质，也是日常膳食中优质的植物蛋白源。目前我国乳品行业仍然面临着奶牛单产量低、人均乳制品消费量较低的问题，大豆由于蛋白质含量非常丰富，且构成大豆蛋白的氨基酸种类非常齐全，组成比例与人体所需氨基酸相近，是一种良好的牛乳替代源。但大豆中含有多种抗营养因子，在豆乳生产加工过程中，未完全灭活的抗营养因子可能仍残留在豆乳中，进而降低了豆制品的营养价值和消化利用率，影响了大豆食品的食用安全性。因此，在豆制品加工过程中需要有针对性的采取相应的处理措施，在保持食品良好品质和风味特性的前提下，尽可能大地降低抗营养因子的负面影响。
目前，关于大豆及其制品中抗营养因子的失活方法，国内外学者已进行了许多的研究工作，通常采用的活性去除技术主要有物理法、化学法和生物法。热处理因效率高、工艺简单、成本低、无残留问题等优势在生产上得到了广泛的应用，是目前研究最为深入、应用最为广泛的活性去除技术，但其处理能力有限，对非热敏性抗营养因子活性几乎无影响。微生物发酵处理采用独特的菌种和发酵工艺，微生物大量增殖，能有效去除大豆中多种抗营养因子的活性，而且处理效率高，无化学试剂的残留，是一种理想的活性去除技术。且在发酵时部分大豆蛋白转化为菌体蛋白和小肽分子，改善了大豆蛋白的营养品质，使其在消化***中的更易降解和吸收利用。发酵过程还会产生多种生物活性因子，可以明显改善肠道微生态环境，对维持人体健康具有积极意义。
开菲尔粒是一种外形不规则的颗粒状(或薄片状、纸卷样等构型)，其上栖息着乳酸球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、酵母菌和醋酸菌等多种有益微生物，菌相极为复杂。由于众多有益微生物共同发酵作用，获得多种有益代谢产物，如乙醇、乳酸、柠檬酸及少量CO2等，形成了开菲尔特有的风味物质，也使得开菲尔乳制品具有比普通酸奶更为丰富的营养价值及保健功效。通过开菲尔发酵，可以去除豆乳中部分抗营养因子的活性，提高大豆制品的营养价值和消化利用率，具有广阔的市场发展前景。
开菲尔发酵技术在去除大豆抗营养因子活性中的应用，既可开辟开菲尔的新用途，又能为生产低抗营养因子活性发酵豆乳制品提供参考，同时也开发了豆制品中抗营养因子的活性去除新技术。
发明内容
为克服上述现有技术存在的缺陷与不足，本发明的目的在于提供开菲尔在去除抗营养因子中的应用，具体为开菲尔发酵在去除传统生浆工艺制备乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸活性的新用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用。
所述应用具体是将开菲尔用于抑制胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸的活性。
所述应用可以是将开菲尔应用于传统生浆工艺制备乳中抗营养因子的活性去除，具体是将开菲尔接种于传统生浆工艺制备乳中并按照开菲尔发酵工序发酵即可。
本发明涉及的开菲尔发酵工序，具体操作步骤如下：
(1)筛选颗粒饱满、色泽光亮、无虫蛀和霉变的大豆粒，用0.2％～0.5％的NaHCO3溶液浸泡乳化10h～12h；
(2)将浸泡后的大豆用清水冲洗干净，加入85～90℃热水，保温10min灭酶；
(3)磨浆时用蒸馏水冷法磨浆，豆水比为1:4～8，磨浆后所得豆糊用纱布过滤，获得生豆浆；
(4)将生豆浆煮沸(100℃)后保温0～20min，煮浆过程中加入质量分数4％的乳糖，期间不断进行搅拌，以免豆浆糊底或溢锅，煮浆结束后将豆乳用纱布过滤，获得熟豆乳；
(5)将熟豆乳迅速冷却至25℃～40℃后，接种体积分数2％～10％的开菲尔发酵菌液，在22℃～25℃下静置发酵6h～72h，获得成熟的酸豆乳；
(6)将成熟的酸豆乳于90℃水浴保温10min灭酶，实现传统生浆工艺制备乳中抗营养因子的活性去除；并按照各种抗营养因子的提取及活性测定方法，测定发酵乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白及植酸的含量。
本发明步骤(5)中涉及的开菲尔发酵菌液的制备，具体操作步骤如下：
①称取20g全脂奶粉，加入200mL无菌水，搅匀，制成10％的还原乳，后加热至85℃～90℃，保温10min～20min杀菌；后冷却至室温，接种开菲尔粒，在25℃静置发酵24h；
②换奶滤出开菲尔粒，按①的方法将其接种到10％的还原乳中，在25℃静置发酵24h；
③重复上述操作，继续培养3～5代，获得活化的开菲尔粒；
④将活化后的开菲尔粒接种于灭菌后的10％还原乳中，25℃静置发酵24h，所得滤液即为开菲尔菌液。
本发明首次公开了开菲尔用于去除传统生浆工艺制备乳中抗营养因子的活性，将开菲尔用于胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸的活性抑制，均属于本发明保护范畴。
采用开菲尔发酵去除豆乳抗营养因子，在其包装、说明书或其它标示材料上只要注明或提及具有开菲尔去除胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸活性的功效，则均落入本发明的保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本发明用开菲尔粒或改性开菲尔粒作为发酵剂，用于发酵传统工艺制备乳，可显著去除大豆凝集素、大豆抗原蛋白等抗营养因子活性的新用途具有以下优点：
1.通过发酵去除了豆乳中多种热敏性及非热敏性抗营养因子的活性，弥补了热处理去除法的不足，提高了大豆制品的营养价值及消化利用率。
2.本发明开辟了开菲尔的新用途。
3.本发明为大豆制品中抗营养因子的活性去除技术开发了新方法。
附图说明
图1为实施例1中开菲尔发酵对胰蛋白酶抑制剂(TI)、植酸、大豆凝集素(SBA)、β-伴大豆球蛋白含量的影响结果图；其中：A：胰蛋白酶抑制剂；B：植酸；C：大豆凝集素；D：β-伴大豆球蛋白；
图2为实施例2中开菲尔发酵乳中大豆蛋白SDS-PAGE图谱；M-marker；A-熟豆浆；B--0h；C-6h；D-12h；E-18h；F-24h；G-30h；H-36h；I-42h；J-48h；K-54h；L-60h；N-66h；P-72h。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例将开菲尔发酵菌液用于抗营养因子的活性去除，即按照传统生浆工艺制备豆乳，后接种开菲尔菌液，研究开菲尔发酵对胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、植酸和大豆抗原蛋白活性的抑制效果。
实验材料：
大豆(华夏3号，蛋白质含量43.85±0.10％)，乳糖(食品级)，碳酸氢钠(食品级)；
开菲尔粒(华南农业大学食品学院生物工程系保藏)
全脂乳粉(新西兰进口)
实验方法：
(1)菌种的活化：全脂乳粉添加无菌水溶解，制成10％(w/v)的还原乳，巴氏杀菌(85℃，10min)，冷却至室温后接种5％(m/v)的开菲尔粒，25℃发酵24h，然后滤出开菲尔粒重新接种到新鲜的还原乳中，重复上述操作，活化4次，所得菌液保存备用。
(2)传统生浆工艺乳的制备：将100g新鲜大豆用300mL 0.5％的NaHCO3溶液浸泡软化10h。用清水冲洗干净，加入适量85～90℃热水，保温10min灭酶。以1:6的豆水比湿法冷水磨浆，磨浆后所得豆糊用4层纱布过滤。将生豆浆煮沸(100℃)后保温6min，煮浆过程中加入4％的乳糖，期间不断进行搅拌，以免豆浆糊底或溢锅，煮浆结束后将豆乳用2层纱布过滤。
(3)开菲尔发酵乳的制备：将熟豆乳迅速冷却至25℃～40℃后，接种5％(5/100，v/v)的开菲尔发酵液菌种，在25℃条件下静置发酵6h～72h；将成熟的酸豆乳于90℃水浴保温10min灭酶，并按照各种抗营养因子的提取及活性测定方法，测定发酵乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白及植酸的含量。每个实验组的实验重复3次，同一时间测定的抗营养因子含量取平均值，并与生豆浆对比。
(4)所有样品中，胰蛋白酶抑制剂的活性测定方法参照于寒松(2015)(食品工业，2015(36)：169-173)的方法进行；植酸含量的测定采用FeCl3比色法；大豆凝集素和大豆抗原蛋白的含量按照购买的大豆凝集素(Invitrogen公司)和β-伴大豆球蛋白ELISA试剂盒(96T)(Invitrogen公司)说明书的方法进行。
(5)实验结果见图1所示，图中ck代表熟豆浆，为对照品；6代表接种开菲尔菌液发酵6h时的豆乳样品，其它样品以此类推。“**”表示与ck相比发酵时间对抗营养因子活性影响差异极显著(p<0.01)；“*”表示与ck相比发酵时间对抗营养因子活性影响差异显著(p<0.05)；
(6)由图1可知，在开始发酵的18h内，随着发酵时间的延长TI的活性不断降低；在18-72h的发酵中，继续延长发酵时间，TI的活性变化逐渐趋于平缓。开菲尔发酵乳中植酸含量随发酵时间的延长逐渐降低，当植酸含量达到最低值后，继续延长发酵时间对植酸含量降低幅度不大，发酵42h时残留率仍达93.6％。发酵初期6-36h内，随着发酵时间的延长，SBA含量逐渐降低，发酵36h时，SBA含量降至3.63ng/g(p<0.01)，下降近46％；在36h-72h的发酵中SBA含量降低不显著。开菲尔发酵对SPAg有较强的降解能力，与对照组相比，随着发酵时间的延长，SPAg含量逐渐降低，当发酵42h时，SPAg残留率为64.8％。这说明在一定的作用时间内，开菲尔发酵对胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝集素、大豆抗原蛋白活性具有明显的去除作用，且去除效果具有时间依赖性。
综上，开菲尔可用于抗营养因子去除，包括开菲尔应用于去除传统生浆工艺制备乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、植酸、大豆抗原蛋白。
实施例2
大豆蛋白亚基SDS-PAGE分析。
实验方法：
将实施例1所得的传统生浆工艺制备熟豆乳迅速冷却至25℃～30℃后，接种5％(v/v)的开菲尔菌液，在25℃静置发酵6h～72h；将成熟的酸豆乳于90℃水浴保温10min灭酶，后将样品冷却后置于4℃冰箱保存。
(1)样品处理：取1.00g待测样品，使其浸泡在20.0mL、0.03mol/L的Tris-HCl(pH8.0，包括0.01mol/Lβ-巯基乙醇)缓冲液中，于150r/min的摇床上28℃浸泡1h，然后4000r/min离心20min，取上清液备用。后取100μL上清液，加100μL样品溶解液，混匀，于100℃水浴中加热样品(沸水浴)处理3min，取出，冷却至室温。
(2)标准蛋白质样品处理：按购买的标准蛋白质样品的说明书处理，于100℃水浴中加热3min，取出，冷却至室温。
(3)开菲尔发酵乳中大豆蛋白亚基进行SDS-PAGE分析。在电泳板规格为125mm×100mm×1.5mm的垂直电泳槽中制胶，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，采用甘氨酸电极缓冲液。上样量为20μL，浓缩胶段用80V恒压，分离胶段采用120V恒压，直至指示剂溴酚蓝移至离胶板底线0.5cm为止。采用低分子量标准蛋白为参考，考马斯亮蓝R-250于50℃染色30min，一定浓度的NaCl溶液在摇床上脱色过夜，直至出现清晰的电泳条带为止。具体步骤如下：
(a)清洗玻璃板，并用吹风筒吹干，在塑料胶条的两面涂少量凡士林，将胶条平行贴在玻璃板的两侧，注意胶条底部要和玻璃板底部留出0.3-0.5cm的空隙，以便拆胶。将另外一块玻璃板小心放置上去，夹好胶条。
(b)将夹好塑料条的玻璃板按凹型板朝内竖直放入电泳槽内，并用夹子固定。
(c)用小烧杯按表1配制封胶液，沿高玻璃面倒入封口槽内，静置约10min直至胶凝固。于两层玻璃之间加入蒸馏水(dH2O)，检查底部和两侧是否漏水；如果漏水需重装。
(d)用小烧杯按表1配12％的分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子1-1.5cm，然后用吸管覆盖一层水，凝胶时间为15-30min，胶与水分层，把水倒掉。
(e)用小烧杯按表1配5％的浓缩胶，混匀，灌胶，***梳子。凝胶时间约10-20min，凝好胶，拔掉梳子。
(f)电泳槽的上槽(低玻璃面)加入稀释的电极缓冲液，浸泡至低玻璃面，但不能超过高玻璃面(下槽)，注意不能漏水。电泳槽的下槽加入稀释的电极缓冲液，体积基本与上槽相同。
(g)用微量注射器依次在加样孔内点样，注意不要交叉污染。用恒压电泳，浓缩胶，80V，约1h，待指示剂溴酚蓝进入分离胶后，调整分离胶的电压为160V，约3h。待指示剂离下面胶端0.5cm左右停止电泳。后用考马斯亮蓝R-250染色，氯化钠溶液脱色过夜。
表1分离胶和浓缩胶的配方
(4)实验结果见图2所示，图中M代表marker；A代表熟豆浆；B代表发酵0h；C代表发酵6h；D代表发酵12h；E代表发酵18h；F代表发酵24h；G代表发酵30h；H代表发酵36h；I代表发酵42h；J代表发酵48h；K代表发酵54h；L代表发酵60h；N代表发酵66h；P代表发酵72h；
(5)由图2可知，在发酵初期的6-36h内，随着发酵时间的延长，7S伴球蛋白的3个亚基(α'、α、β)仍然存在，11S大豆球蛋白的38ku酸性亚基和21ku碱性亚基基本未发生明显变化。发酵至42h时，7S伴球蛋白的β亚基已完全消失，α'和α亚基含量明显减少，11S大豆球蛋白的酸性亚基含量变化不明显，碱性亚基明显减少；发酵66h时，7S伴球蛋白的α'和α亚基基本消失，11S大豆球蛋白的酸性亚基含量与对照组相比有所减少，碱性亚基基本消失。同时，在上述图谱中未能清晰看到小于21.0kd的蛋白亚基存在，说明豆乳经长时间发酵后，大豆蛋白可能被降解为分子量更小的肽段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用。
2.根据权利要求1所述的开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，其特征在于：所述应用是将开菲尔用于抑制胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、植酸的活性。
3.根据权利要求1所述的开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，其特征在于：所述应用是将开菲尔应用于传统生浆工艺制备乳中抗营养因子的活性去除；将开菲尔接种于传统生浆工艺制备乳中并按照开菲尔发酵工序发酵即可。
4.根据权利要求3所述的开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，其特征在于：所述的开菲尔发酵工序，具体操作步骤如下：
(1)筛选颗粒饱满、色泽光亮、无虫蛀和霉变的大豆粒，用0.2％～0.5％的NaHCO3溶液浸泡乳化10h～12h；
(2)将浸泡后的大豆用清水冲洗干净，加入85～90℃热水，保温10min灭酶；
(3)磨浆时用蒸馏水冷法磨浆，豆水比为1:4～8，磨浆后所得豆糊用纱布过滤，获得生豆浆；
(4)将生豆浆煮沸(100℃)后保温0～20min，煮浆过程中加入质量分数4％的乳糖，期间不断进行搅拌，以免豆浆糊底或溢锅，煮浆结束后将豆乳用纱布过滤，获得熟豆乳；
(5)将熟豆乳迅速冷却至25℃～40℃后，接种体积分数2％～10％的开菲尔发酵菌液，在22℃～25℃下静置发酵6h～72h，获得成熟的酸豆乳；
(6)将成熟的酸豆乳于90℃水浴保温10min灭酶，实现传统生浆工艺制备乳中抗营养因子的活性去除；并按照各种抗营养因子的提取及活性测定方法，测定发酵乳中胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、大豆抗原蛋白及植酸的含量。
5.根据权利要求4所述的开菲尔在去除豆乳抗营养因子中的应用，其特征在于：步骤(5)中所述的开菲尔发酵菌液，具体的制备步骤如下：
①称取20g全脂奶粉，加入200mL无菌水，搅匀，制成10％的还原乳，后加热至85℃～90℃，保温10min～20min杀菌；后冷却至室温，接种开菲尔粒，在25℃静置发酵24h；
②换奶滤出开菲尔粒，按①的方法将其接种到10％的还原乳中，在25℃静置发酵24h；
③重复上述操作，继续培养3～5代，获得活化的开菲尔粒；
④将活化的开菲尔粒接种于灭菌后的10％还原乳中，25℃静置发酵24h，所得滤液即为开菲尔菌液。
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