CN110938611B - 一种dna聚合酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述DNA聚合酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有DNA聚合酶的活性。本发明的Deep Sea DNA聚合酶去除了野生型DNA聚合酶的部分3’→5’核酸外切酶校读活性，具有比Taq酶高5倍的保真度，稳定性好、活性高，适用于含有高GC序列和循环序列的困难模板的扩增，可以作为三代测序建库的工具酶。

Description

一种DNA聚合酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

DNA聚合酶，是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类DNA依赖型酶，最早由美国科学家Arthur Komberg于1957年在大肠杆菌中发现的，在此之后，多种DNA聚合酶陆续在其他原核生物和真核生物中被发现。DNA聚合酶种类繁多，功能各异，研究人员通常需要根据实际应用合理选择DNA聚合酶的种类，随着基因组学发展，具有5'→3'扩增活性的热稳定DNA聚合酶在分子领域得到广泛的应用。

1992年，在加利福尼亚湾深海火山口2010米处发现了一株能在104℃环境中生长的热球菌GB-D，并从该菌株的产物中分离纯化得到了高保真的耐热野生型Deep Sea DNA聚合酶。该野生型Deep Sea DNA聚合酶基因全长约2295个碱基，编码765个氨基酸，分子量为89kDa左右，具有3'→5'核酸外切酶校读活性，热稳定性强，在100℃的半衰期是8h，在95℃的半衰期是23h。

目前市面上常见的DNA聚合酶普遍存在热稳定性差、保真性低、纯度较低的问题，对于困难模板的扩增效果较差，无法满足三代测序的要求。

CN 101255435 A公开了耐热性DNA聚合酶(Bcady-pol)基因及其编码蛋白的应用，采用Ni离子柱进行纯化，得到的蛋白纯度仍然无法满足三代测序的要求。

CN 104560908 A公开了一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法，包括以下步骤：(1)破菌；(2)热处理；(3)盐析；(4)Ni离子金属螯合亲和层析；(5)透析；(6)制剂分装。然而该方法得到的Taq DNA聚合酶的热稳定性较差。

CN 108265039 A公开了一种突变Taq DNA聚合酶及其纯化方法，将天然Taq DNA聚合酶进行突变，去除了其5’-3’的DNA外切酶活性，并且引入E507R，E742A和A743H(氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定)突变。然而所述Taq DNA聚合酶的热稳定性较差。

基于此，有必要提供一种热稳定性好、纯度高、保真性好的DNA聚合酶及其表达纯化方法，应用于测序技术领域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述DNA聚合酶热稳定性好、纯度高，可以应用于三代测序中。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种DNA聚合酶，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：

(I)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；

(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有DNA聚合酶的活性；

所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为：

GSSHHHHHHSSGILDTDYITENGKPVIRVFKKENGEFKIEYDRTFEPYFYALLKDDSAIEDVKKVTAKRHGTVVKVKRAEKVQKKFLGRPIEVWKLYFNHPQDVPAIRDRIRAHPAVVDIYEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGDEELTMLAFAIATLYHEGEEFGTGPILMISYADGSEARVITWKKIDLPYVDVVSTEKEMIKRFLRVVREKDPDVLITYNGDNFDFAYLKKRCEELGIKFTLGRDGSEPKIQRMGDRFAVEVKGRIHFDLYPVIRRTINLPTYTLEAVYEAVFGKPKEKVYAEEIAQAWESGEGLERVARYSMEDAKVTYELGREFFPMEAQLSRLIGQSLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYKRNELAPNKPDERELARRRGGYAGGYVKEPERGLWDNIVYLDFRSLYPSIIITHNVSPDTLNREGCKEYDVAPEVGHKFCKDFPGFIPSLLGDLLEERQKIKRKMKATVDPLEKKLLDYRQRAIKILANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGREYIEMVIRELEEKFGFKVLYADTDGLHATIPGADAETVKKKAKEFLKYINPKLPGLLELEYEGFYVRGFFVTKKKYAVIDEEGKITTRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLEAILKHGDVEEAVRIVKEVTEKLSKYEVPPEKLVIHEQITRDLRDYKATGPHVAVAKRLAARGVKIRPGTVISYIVLKGSGRIGDRAIPADEFDPTKHRYDAEYYIENQVLPAVERILKAFGYRKEDLRYQKTK.

本发明中，将野生型DNA聚合酶的多位点氨基酸进行突变，得到的Deep Sea DNA聚合酶去除了野生型DNA聚合酶的部分3’→5’核酸外切酶校读活性，但仍具有比Taq酶高5倍的保真度，稳定性好、活性高，适用于含有高GC序列和循环序列的困难模板的扩增，可以作为三代测序建库的工具酶。

第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的DNA聚合酶的核苷酸序列，优选为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列为：

ggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcattctggataccgattacattaccgaaaacggcaaaccggtgattcgtgtgttcaaaaaagaaaacggcgaattcaaaatcgaatacgatcgtacctttgaaccgtatttttacgcgctgctgaaagatgatagcgcgatcgaagatgtgaaaaaagtgaccgcgaaacgtcatggcaccgtggtgaaagtgaaacgtgcggaaaaagtgcagaaaaaatttctgggccgtccgattgaagtgtggaaactgtatttcaaccatccgcaggatgtgccggcgattcgtgatcgtattcgtgcgcatccggcggtggtggatatttatgaatatgatatcccgttcgcgaaacgttatctgattgataaaggcctgattccgatggaaggcgatgaagaactgaccatgctggcctttgcgattgcgaccctgtatcacgaaggcgaagaatttggcaccggcccgattctgatgattagctatgcggatggcagcgaagcgcgtgtgattacctggaaaaaaatcgatctgccgtatgtggatgtggtgagcaccgaaaaagaaatgatcaaacgctttctgcgtgtggtgcgtgaaaaagatccggatgtgctgattacctataacggcgataactttgatttcgcgtatctgaaaaaacgttgcgaagaactgggcatcaaatttaccctgggccgtgatggtagcgaaccgaaaattcagcgtatgggcgatcgttttgcggtggaagtgaaaggccgtattcattttgatctgtatccggtgattcgccgtaccattaacctgccgacctataccctggaagcggtgtatgaagcggtgtttggcaaaccgaaagaaaaagtgtacgcggaagaaattgcgcaggcgtgggaaagcggcgaaggcctggaacgtgtggcgcgttatagcatggaagatgcgaaagtgacctatgaactgggccgtgaatttttcccgatggaagcgcagctgtctcgtctgattggccagagcctgtgggatgtgagccgtagcagcaccggcaacctggtggaatggtttctgctgcgtaaagcgtataaacgtaacgaactggccccgaacaaaccggatgaacgtgaactggcccgtcgtcgtggcggttatgcgggcggttatgtgaaagaaccggaacgtggcctgtgggataacattgtgtatctggattttcgtagcctgtatccgagcattattatcacccataacgtgagcccggataccctgaaccgtgaaggctgcaaagaatatgatgtggcgccggaagtgggccataaattctgcaaagatttcccgggctttattccgagcctgctgggcgatctgctggaagaacgccagaaaatcaaacgcaaaatgaaagcgaccgttgatccgctggaaaaaaaactgctggattatcgtcagcgcgcgattaaaattctggccaacagcttctatggctattatggttatgcgaaagcgcgttggtattgcaaagaatgcgcggaaagcgtgaccgcgtggggccgtgaatatatcgaaatggtgatccgcgaactggaagaaaaattcggcttcaaagtgctgtatgcggataccgatggcctgcatgcgaccattccgggtgcggatgcggaaaccgtgaaaaaaaaagcgaaagaattcctgaaatacatcaatccgaaactgccgggcctgctggaactggaatatgaaggcttttatgtgcgtggctttttcgtgaccaaaaaaaaatacgcggtgatcgatgaagaaggcaaaattaccacccgtggcctggaaattgtgcgtcgtgattggagcgaaattgcgaaagaaacccaggcgcgtgtgctggaagcgattctgaaacatggcgatgtggaagaagcggtgcgtattgttaaagaagtgaccgaaaaactgagcaaatatgaagttccgccggaaaaactggtgattcatgaacaaattacccgtgatctgcgtgattataaagcgaccggtccgcatgtggcggtggcaaaacgtctggcagcgcgtggcgtgaaaattcgtccgggcaccgtgattagctatattgtgctgaaaggcagcggccgtattggcgatcgtgcgattccggcggatgaatttgatccgaccaaacatcgttatgatgcggaatattatatcgaaaaccaggtgctgccggcggtggaacgtattctgaaagcgtttggctatcgtaaagaagatctgcgctatcagaaaaccaaaca.

本发明中，与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有≥98％同源性的多核苷酸，或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经过1～20个碱基的取代、缺失或添加而获得的核苷酸序列，同样能够编码如第一方面所述的DNA聚合酶。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第二方面所述的核苷酸序列。

优选地，所述表达载体带有组氨酸标签。

优选地，所述表达载体为pBAD。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的表达载体。

本发明中，所述表达载体为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列***pBAD重组得到的载体。

优选地，所述宿主细胞为原核生物细胞，优选为大肠杆菌。

本发明中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(上海唯地生物)。

第五方面，本发明提供了一种分泌DNA聚合酶的宿主细胞的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建如第三方面所述的表达载体；

(2)将步骤(1)所述的表达载体转化到宿主细胞，得到所述分泌DNA聚合酶的宿主细胞。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA聚合酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1’)构建如第四方面所述的宿主细胞，并对所述宿主细胞进行诱导培养；

(2’)收集诱导培养后的宿主细胞，进行裂解、离心，得到上清液；

(3’)对上清液进行纯化，得到所述DNA聚合酶。

优选地，步骤(1’)所述的诱导培养采用诱导剂进行。

优选地，所述诱导剂包括***糖。

优选地，所述诱导剂的终浓度为0.1％～0.3％，例如可以是0.1％、0.2％或0.3％。

优选地，步骤(1’)所述诱导培养的温度为20～30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。

优选地，步骤(1’)所述诱导培养的时间为12～16h，例如可以是12h、13h、14h、15h或16h。

优选地，步骤(2’)所述裂解包括采用裂解液重悬宿主细胞，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70～80℃中水浴10～20min。

本发明中，所述裂解液中含有终浓度为10～20mM Tris，50～100mM KCl，5～15mM咪唑和5％～15％甘油。

优选地，所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2～10):1，例如可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

优选地，步骤(3’)所述纯化包括Ni亲和层析、肝素亲和层析或阳离子交换层析中的任意一种或至少两种的组合，优选为Ni亲和层析、肝素亲和层析和阳离子交换层析的组合。

优选地，所述Ni亲和层析包括：将Ni层析介质和上清液的混合物加入Ni亲和柱，采用咪唑溶液洗涤，收集Ni亲和洗脱液。

优选地，所述咪唑溶液的浓度为30～400mM，例如可以是30mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM或400mM。

优选地，所述肝素亲和层析包括：将Ni亲和洗脱液和缓冲液的混合液加入肝素亲和柱，采用KCl溶液洗涤，收集肝素亲和洗脱液。

优选地，所述Ni亲和洗脱液与所述缓冲液的体积比为1:(3-5)，例如可以是1:3、1:4或1:5。

优选地，所述阳离子交换层析包括：将肝素亲和洗脱液和缓冲液的混合液加入阳离子交换柱，采用KCl溶液洗涤，收集阳离子交换洗脱液。

本发明中，肝素亲和层析和阳离子交换层析中所使用的缓冲液中含终浓度为10～20mM Tris，0.1～0.2mM EDTA，1～2mM DTT和5％～15％甘油。

本发明中，所述阳离子交换柱的介质为UniGel 30CM。

优选地，所述肝素亲和洗脱液与所述缓冲液的体积比为1:(2-5)，例如可以是1:2、1:3、1:4或1:5。

优选地，所述KCl溶液的浓度为100mM～1M，例如可以是100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M。

优选地，在阳离子交换层析之后还包括将阳离子交换洗脱液进行透析的步骤。

本发明中，通过将阳离子交换洗脱液加入透析缓冲液中进行透析，所述透析缓冲液中含终浓度为10～20mM Tris，100～200mM KCl，0.1～0.2mM EDTA，1～2mM DTT和50％甘油。

作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA聚合酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1’)构建如第四方面所述的宿主细胞，对所述宿主细胞采用0.1％～0.3％的***糖、在20～30℃下诱导培养12～16h；

(2’)收集诱导培养后的宿主细胞，采用裂解液进行重悬，所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2～10):1，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70～80℃中水浴10～20min，离心后收集上清；

(3’)对上清液依次进行Ni亲和层析、肝素亲和层析和阳离子交换层析，具体为：

(1”)将Ni层析介质和上清液的混合物加入Ni亲和柱，采用浓度梯度为30～400mM的咪唑溶液洗涤，收集Ni亲和洗脱液；

(2”)将Ni亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(3-5)混合，加入肝素亲和柱，采用浓度梯度为50mM～1M的KCl溶液洗涤，收集肝素亲和洗脱液；

(3”)将肝素亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(2-5)混合，加入阳离子交换柱，采用浓度梯度为50mM～1M的KCl溶液洗涤，收集阳离子交换洗脱液；

(4”)将阳离子交换洗脱液加入透析缓冲液中进行透析，得到纯化的DNA聚合酶。

第七方面，本发明提供了一种酶制剂，包括如第一方面所述的DNA聚合酶。

优选地，所述酶制剂还包括酶缓冲液。

第八方面，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA聚合酶、如第二方面所述的DNA聚合酶的核苷酸序列、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的宿主细胞或如第七方面所述的酶制剂在制备分子检测试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对野生型DNA聚合酶的多位点氨基酸进行突变，得到的Deep SeaDNA聚合酶稳定性好、活性高、保真度高，适用于含有高GC序列等困难模板的扩增；

(2)本发明通过对含有Deep Sea DNA聚合酶核酸序列的重组工程菌进行诱导培养，裂解菌体后得到粗产物，采用Ni亲和层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析和透析相结合的纯化方法，得到纯度达到95％的Deep Sea DNA聚合酶，满足三代测序对于DNA聚合酶的纯度要求。

附图说明

图1为pBAD-R.Deep Sea载体图；

图2为DNA聚合酶的纯化方法流程图；

图3为制备的Deep Sea DNA聚合酶与NEB对照酶(Deep Vent exo-)的SDS-PAGE电泳对比图；

图4(A)为制备的Deep Sea DNA聚合酶的活性检测的琼脂糖凝胶电泳图，图4(B)为NEB对照酶(Deep Vent exo-)的活性检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为制备的Deep Sea DNA聚合酶与NEB对照酶(Deep Vent exo-)的DNA酶污染检测对比图；

图6为制备的Deep Sea DNA聚合酶对高GC含量模板的PCR扩增图，其中，泳道1-2的引物为Homo-1-A-NKRD9(F1+R1)-GC-75.2％，泳道3-4的引物为Homo-86-Q95GK3(F1+R1)-GC-55.2％。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1重组工程菌的构建

采用基因工程技术，将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列克隆至带有His标签的pBAD载体的NcoI和HindIII酶切位点中，如图1所示，构建含有Deep Sea DNA聚合酶基因的表达载体，测序结果正确后将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，得到重组工程菌，并于-20℃环境中保存在30％甘油中。

实施例2重组工程菌的诱导培养

(1)将实施例1构建的重组工程菌在抗氨苄青霉素钠和氯霉素的LB平板上进行三区划线，37℃活化培养16h；

(2)挑取25个单菌落，接入已加入相应抗性的25mL LB液体培养基中，37℃活化培养4～5h，待菌液长至OD600值在0.3～0.6之间，得活化液；

(3)将10mL活化液加入相应抗性的500mL LB液体培养基中，37℃扩大培养4～5h，待菌液长至OD600值在0.6～0.8之间，得扩大液；

(4)向扩大液中加入终浓度为0.2％的***糖作为诱导剂，25℃诱导Deep SeaDNA聚合酶表达过夜，16h后收集菌体细胞；

(5)将菌液在7500g、4℃下离心5min，沉淀即为表达完成后的菌体。

实施例3Deep Sea DNA聚合酶的粗提

收集1L菌体，用100mL冰浴的裂解液(10mM Tris、50mM KCl、5mM咪唑、5％甘油，pH＝7.4)进行重悬，采用细胞高压破碎仪对重悬液进行破碎，破碎压力为800bar，破碎时间为2.5min，得到裂解液，将裂解液75℃水浴20min后，在4℃下以35000g离心30min，收集上清，得到粗产物。

实施例4Deep Sea DNA聚合酶的纯化

(1)Ni亲和层析

将Ni层析介质加入粗产物中，4℃下搅拌结合2h得到混合物，将混合物加入层析空柱中进行固液分离，得到Ni亲和柱；用30mM咪唑溶液预洗Ni亲和柱，再用400mM咪唑洗脱Ni亲和柱，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集含有Deep Sea DNA聚合酶的洗脱液，得Ni亲和洗脱液；

(2)肝素亲和层析

将得到的Ni亲和洗脱液溶解在低盐缓冲液(10mM Tris、0.1mM EDTA、1mM DTT、5％甘油，pH＝7.4)中，加入到肝素亲和柱中，其中，低盐缓冲液与Ni亲和洗脱液的体积比为3:1；用50mM KCl溶液预洗肝素亲和柱，随后用50mM～1M的KCl溶液梯度洗脱肝素亲和柱，洗脱5个柱体积，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集含有Deep Sea DNA 聚合酶的洗脱液，得肝素亲和洗脱液；

(3)阳离子交换层析

将肝素亲和洗脱液溶解在上述低盐缓冲液中，加入到阳离子交换柱(介质为UniGel 80CM)中，其中，低盐缓冲液与肝素洗脱液的体积比为2:1；用100mM KCl溶液预洗阳离子交换柱，随后用100mM～1M的KCl溶液梯度洗脱阳离子交换柱，洗脱5个柱体积，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集含有Deep Sea DNA 聚合酶的洗脱液，得阳离子交换洗脱液；

(4)透析

将阳离子交换洗脱液在透析缓冲液(10mM Tris，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mMDTT，50％甘油)中进行透析，所使用的透析袋大小为10kDa，阳离子交换洗脱液与透析缓冲液的体积比为1:100，透析条件为4℃、200rpm下透析16h，补加0.1％TritonX-100，得纯化的Deep Sea DNA聚合酶，于-20℃保存。

根据如图2所示的DNA聚合酶的纯化方法流程图，得到纯化的Deep Sea DNA聚合酶。

图3所示为制备的Deep Sea DNA聚合酶与NEB对照酶(Deep Vent exo-)的SDS-PAGE电泳对比图，可以看到制备的Deep Sea DNA聚合酶的PAGE胶图无杂带，蛋白纯度高达到95％以上，和NEB对照酶条带大小基本一致，蛋白浓度较Deep Vent DNA聚合酶高；图4(A)和图4(B)所示为制备的Deep Sea DNA聚合酶与NEB对照酶(Deep Vent exo-)的活性检测的琼脂糖凝胶电泳结果图，可以看出在相同单位体积酶活和相同扩增体系、条件下，制备的Deep Sea DNA聚合酶扩增效果较NEB对照酶好；图5为制备的Deep Sea DNA聚合酶与NEB对照酶(Deep Vent exo-)的DNA酶污染检测对比图，由图可知，制备的Deep Sea DNA聚合酶未降解体系中的DNA，无DNA酶污染，而NEB的对照酶有DNA酶污染；图6为制备的Deep Sea DNA聚合酶对高GC含量模板的PCR扩增图，可以看出制备的Deep Sea DNA聚合酶对引物Homo-1-ANKRD9(F1+R1)-GC-75.2％有明显扩增，对引物Homo-86-Q96GK3(F1+R1)-GC-55.2％有弱扩增。

综上所述，本发明通过对含有Deep Sea DNA聚合酶核酸序列的重组工程菌进行诱导培养，裂解菌体后得到粗产物，采用Ni亲和层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析和透析相结合的纯化方法，得到纯度达到95％的Deep Sea DNA聚合酶，满足了三代测序对于DNA聚合酶的纯度要求。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 莫纳（武汉）生物科技有限公司

<120> 一种DNA聚合酶及其制备方法和应用

<130> OISZ18012

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 772

<212> PRT

<213> Amino acid

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(772)

<400> 1

Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ile Leu Asp Thr

1 5 10 15

Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile Arg Val Phe Lys Lys

20 25 30

Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro Tyr

35 40 45

Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Asp Val Lys Lys

50 55 60

Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys Val Lys Arg Ala Glu

65 70 75 80

Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys Leu

85 90 95

Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Arg Ile Arg

100 105 110

Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala

115 120 125

Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Asp Glu

130 135 140

Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr Leu Tyr His Glu Gly

145 150 155 160

Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile Asp Leu Pro Tyr Val

180 185 190

Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val

195 200 205

Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn

210 215 220

Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu Glu Leu Gly Ile Lys

225 230 235 240

Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly

245 250 255

Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr

260 265 270

Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala

275 280 285

Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu

290 295 300

Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly Leu Glu Arg Val Ala

305 310 315 320

Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Arg Glu

325 330 335

Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Ile Gly Gln Ser Leu

340 345 350

Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu

355 360 365

Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp

370 375 380

Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Tyr Val

385 390 395 400

Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile Val Tyr Leu Asp Phe

405 410 415

Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp

420 425 430

Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala Pro Glu Val

435 440 445

Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu

450 455 460

Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Arg Lys Met Lys Ala

465 470 475 480

Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala

485 490 495

Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys

500 505 510

Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly

515 520 525

Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu Glu Glu Lys Phe Gly

530 535 540

Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu His Ala Thr Ile Pro

545 550 555 560

Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Lys Glu Phe Leu Lys

565 570 575

Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly

580 585 590

Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile

595 600 605

Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg

610 615 620

Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala

625 630 635 640

Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys Glu

645 650 655

Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val

660 665 670

Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp Tyr Lys Ala Thr Gly

675 680 685

Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile

690 695 700

Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg

705 710 715 720

Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His

725 730 735

Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val

740 745 750

Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr

755 760 765

Gln Lys Thr Lys

770

<210> 2

<211> 2318

<212> DNA

<213> Nucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2318)

<400> 2

ggcagcagcc atcatcatca tcatcacagc agcggcattc tggataccga ttacattacc 60

gaaaacggca aaccggtgat tcgtgtgttc aaaaaagaaa acggcgaatt caaaatcgaa 120

tacgatcgta cctttgaacc gtatttttac gcgctgctga aagatgatag cgcgatcgaa 180

gatgtgaaaa aagtgaccgc gaaacgtcat ggcaccgtgg tgaaagtgaa acgtgcggaa 240

aaagtgcaga aaaaatttct gggccgtccg attgaagtgt ggaaactgta tttcaaccat 300

ccgcaggatg tgccggcgat tcgtgatcgt attcgtgcgc atccggcggt ggtggatatt 360

tatgaatatg atatcccgtt cgcgaaacgt tatctgattg ataaaggcct gattccgatg 420

gaaggcgatg aagaactgac catgctggcc tttgcgattg cgaccctgta tcacgaaggc 480

gaagaatttg gcaccggccc gattctgatg attagctatg cggatggcag cgaagcgcgt 540

gtgattacct ggaaaaaaat cgatctgccg tatgtggatg tggtgagcac cgaaaaagaa 600

atgatcaaac gctttctgcg tgtggtgcgt gaaaaagatc cggatgtgct gattacctat 660

aacggcgata actttgattt cgcgtatctg aaaaaacgtt gcgaagaact gggcatcaaa 720

tttaccctgg gccgtgatgg tagcgaaccg aaaattcagc gtatgggcga tcgttttgcg 780

gtggaagtga aaggccgtat tcattttgat ctgtatccgg tgattcgccg taccattaac 840

ctgccgacct ataccctgga agcggtgtat gaagcggtgt ttggcaaacc gaaagaaaaa 900

gtgtacgcgg aagaaattgc gcaggcgtgg gaaagcggcg aaggcctgga acgtgtggcg 960

cgttatagca tggaagatgc gaaagtgacc tatgaactgg gccgtgaatt tttcccgatg 1020

gaagcgcagc tgtctcgtct gattggccag agcctgtggg atgtgagccg tagcagcacc 1080

ggcaacctgg tggaatggtt tctgctgcgt aaagcgtata aacgtaacga actggccccg 1140

aacaaaccgg atgaacgtga actggcccgt cgtcgtggcg gttatgcggg cggttatgtg 1200

aaagaaccgg aacgtggcct gtgggataac attgtgtatc tggattttcg tagcctgtat 1260

ccgagcatta ttatcaccca taacgtgagc ccggataccc tgaaccgtga aggctgcaaa 1320

gaatatgatg tggcgccgga agtgggccat aaattctgca aagatttccc gggctttatt 1380

ccgagcctgc tgggcgatct gctggaagaa cgccagaaaa tcaaacgcaa aatgaaagcg 1440

accgttgatc cgctggaaaa aaaactgctg gattatcgtc agcgcgcgat taaaattctg 1500

gccaacagct tctatggcta ttatggttat gcgaaagcgc gttggtattg caaagaatgc 1560

gcggaaagcg tgaccgcgtg gggccgtgaa tatatcgaaa tggtgatccg cgaactggaa 1620

gaaaaattcg gcttcaaagt gctgtatgcg gataccgatg gcctgcatgc gaccattccg 1680

ggtgcggatg cggaaaccgt gaaaaaaaaa gcgaaagaat tcctgaaata catcaatccg 1740

aaactgccgg gcctgctgga actggaatat gaaggctttt atgtgcgtgg ctttttcgtg 1800

accaaaaaaa aatacgcggt gatcgatgaa gaaggcaaaa ttaccacccg tggcctggaa 1860

attgtgcgtc gtgattggag cgaaattgcg aaagaaaccc aggcgcgtgt gctggaagcg 1920

attctgaaac atggcgatgt ggaagaagcg gtgcgtattg ttaaagaagt gaccgaaaaa 1980

ctgagcaaat atgaagttcc gccggaaaaa ctggtgattc atgaacaaat tacccgtgat 2040

ctgcgtgatt ataaagcgac cggtccgcat gtggcggtgg caaaacgtct ggcagcgcgt 2100

ggcgtgaaaa ttcgtccggg caccgtgatt agctatattg tgctgaaagg cagcggccgt 2160

attggcgatc gtgcgattcc ggcggatgaa tttgatccga ccaaacatcg ttatgatgcg 2220

gaatattata tcgaaaacca ggtgctgccg gcggtggaac gtattctgaa agcgtttggc 2280

tatcgtaaag aagatctgcg ctatcagaaa accaaaca 2318

Claims (11)

1.一种DNA聚合酶，其特征在于，如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述的DNA聚合酶的基因，其特征在于，如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的基因；

所述表达载体带有组氨酸标签；

所述表达载体为pBAD。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.一种分泌DNA聚合酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）构建如权利要求3所述的表达载体；

（2）将步骤（1）所述的表达载体转化到宿主细胞，得到所述分泌DNA聚合酶的宿主细胞。

7.一种如权利要求1所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1’）构建如权利要求4所述的宿主细胞，并对所述宿主细胞进行诱导培养；

（2’）收集诱导培养后的宿主细胞，进行裂解、离心，得到上清液；

（3’）对上清液进行纯化，得到所述DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤（1’）所述的诱导培养采用诱导剂进行；

所述诱导剂为***糖；

所述诱导剂的终浓度为0.1%~0.3%；

步骤（1’）所述诱导培养的温度为20~30℃；

步骤（1’）所述诱导培养的时间为12~16 h；

步骤（2’）所述裂解包括采用裂解液重悬宿主细胞，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70~80℃中水浴10~20 min；

所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2~10):1。

9.根据权利要求7所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1’）构建如权利要求4所述的宿主细胞，对所述宿主细胞采用0.1%~0.3%的***糖、在20~30℃下诱导培养12~16 h；

（2’）收集诱导培养后的宿主细胞，采用裂解液进行重悬，所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2~10):1，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70~80℃中水浴10~20 min，离心后收集上清；

（3’）对上清液依次进行Ni亲和层析、肝素亲和层析和阳离子交换层析，具体为：

（1’’）将Ni层析介质和上清液的混合物加入Ni亲和柱，采用浓度梯度为30~400 mM的咪唑溶液洗涤，收集Ni亲和洗脱液；

（2’’）将Ni亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(3-5)混合，加入肝素亲和柱，采用浓度梯度为50 mM~1 M的KCl溶液洗涤，收集肝素亲和洗脱液；

（3’’）将肝素亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(2-5)混合，加入阳离子交换柱，采用浓度梯度为50 mM~1 M的KCl溶液洗涤，收集阳离子交换洗脱液；

（4’’）将阳离子交换洗脱液加入透析缓冲液中进行透析，得到纯化的DNA聚合酶。

10.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的DNA聚合酶；

所述酶制剂还包括酶缓冲液。

11.一种如权利要求1所述的DNA聚合酶、如权利要求3所述的表达载体、如权利要求4所述的宿主细胞或如权利要求10所述的酶制剂在制备分子检测试剂盒中的应用。

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