CN105949286A - 牛病毒性腹泻病毒i型e2蛋白的表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用。其优点为：(1)建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达、纯化方法，可制备纯的BVDV E2蛋白；(2)仅用BVDV的E2蛋白免疫兔子制备抗体，比用全病毒免疫牛本身制备的抗体特异性好，背景浅，易判定；使用FITC标记二抗，建立了间接荧光法，因此敏感性更好；操作简单：采用预混液，减少操作时间；(3)用纯的BVDV E2蛋白包被，优化了封闭条件、血清及抗体保存液，建立了BVDV抗体间接ELISA方法，组装了敏感且价格低廉的BVDV抗体间接ELISA试剂盒，可改变长期依赖进口BVDV抗体ELISA试剂盒的局面。

Description

牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用

技术领域

本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及在牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA试剂盒的组装和牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光检测试剂盒的组装应用，属兽用生物制品领域。

技术背景

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)均属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。而BVDV有I型和II型两种生物型，在我国主要为I型。我国近几年来牛感染BVDV而持续带毒现象非常普遍。猪瘟活疫苗在生产过种中要用到牛血清、胰酶、牛睾丸等材料，这些材料中若带有低滴度的BVDV，会造成猪瘟细胞苗的污染。另外，用含BVDV抗体的牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养。更为严重的是，猪使用被BVDV污染的猪瘟疫苗后可感染BVDV，出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。为了有效防控BVDV在牛群中的流行，控制猪用活疫苗的生物原料质量，开发BVDV抗体和抗原检测试剂具有重要意义。

目前，检测BVDV方法主要有病毒分离、血清中和试验和电镜检查等，这些方法耗时费力，需6～7d甚至更长时间才能获得检测结果，不利于实验室样品检测工作。目前一般使用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验检测BVDV。但目前商品化的免疫荧光抗体是用BVDV全病毒免疫牛制备的，试验时背景深，效价低，给结果判定带来困难。酶联免疫吸附试验敏感性低，往往造成漏检。另外，BVDV抗体和抗原检测试剂主要依赖国外进口试剂，不利于我国BVDV防控工作的顺利开展。因此，急需开发价格低廉、敏感特异的BVDV抗体和病原检测试剂。

E2蛋白是BVDV的主要结构蛋白，可产生保护性免疫反应。因此，是开发BVDV亚单位疫苗和检测试剂的首选靶蛋白。国内已采用了多种方式对其进行原核表达(如:徐兴然等,牛病毒性腹泻病病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达，中国预防兽医学报，2005，27(2)：98-101；杨有武等,牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备,动物医学进展，2013，34(9)：128-132)，但原核表达产物为包涵体，无正确结构，活性差。因此，需进一步研究BVDVE2蛋白的表达方法，以获取可溶性的高活性蛋白。

发明内容

本发明的目的是建立BVDV E2蛋白的表达方法，开发BVDV抗体和抗原检测试剂。本发明的

技术方案

1.一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列(序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVME2-His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo.12544。

2.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的应用，其特征在于用该BVDV的E2蛋白免疫动物制备抗体，并用此抗体为基础组装的BVDV病原间接免疫荧光染色试剂盒。

3.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于用该BVDV的E2蛋白作为包被抗原，以及优化的封闭液、血清稀释液等组装成BVDV抗体间接ELISA试剂盒。

本发明的主要技术原理

参考BVDVI型E2基因序列，设计合成引物，从标准毒株BVDV BA株(CVCC AV69，中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p144)感染材料中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增获得天然的BVDV E2基因；

BVDE2F：5’-CAGTCGACCA CCTAGACTGC AAACCTG-3’27(序列1)

BVDE2R：5’-ACCGGTACCT ATGGACTCGG CGAAGTAATC CTTGTG-3’36(序列2)

再通过叠合PCR技术将天然的BVDV E2基因与分泌信号肽Mels基因及6聚组氨酸(6His)纯化标签融合，获得转移载体；

将转移载体通过转座技术克隆至杆状病毒基因组中，构建重组杆状病毒，获得BVDV E2蛋白；

将获得的BVDV E2蛋白加上适宜佐剂，乳化后免疫动物，制备高免血清，用于组装BVDV间接免疫荧光检测试剂盒；

或者将纯化的BVDV E2蛋白包被抗原，经封闭后加入适宜二抗组装BVDV抗体间接ELISA试剂盒。

本发明具体实施方式

一、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白的表达

1.BVDV E2基因序列的获得

提取BVDV BA株(CVCC AV69)感染材料中提取病毒RNA，通过常规RT-PCR技术，获得BVDV E2基因，克隆至pMD 18载体，命名为：pMD-E2。

2.E2基因与信号肽序列和6His融合

分别提取pMD-E2，通过叠合PCR技术获得与信号肽Mels基因和6His的融合基因Mels-E2-6His(序列1)，克隆至pMD 18载体。构建的融合基因质粒命名为pMD-ME2-His。

质粒pMD-ME2-His中携带的Mels-E2-6His序列(序列3):

起始“ACCATG……TCGAC”为Mels序列(1-78)

6His序列“GGTG……CATG”(1157-1210)

3.亚克隆至杆状病毒转移载体

将pMD-ME2-His和pFastBac1分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断ME2-His与pFastBac1线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为pFB-ME2-His。

4.转座获得重组杆粒DNA

将pFB-ME2-His转化DH10Bac(Invitrogen公司)构建出的杆粒DNA命名为：bME2-His。

5.重组病毒的获得

将重组杆粒bME2-His用转染试剂Cellfectin(Invitrogen)转染sf9细胞，扩大培养，收集培养上清进行PCR鉴定。获得杆状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒，该毒株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo.12544。

6.表达分析

将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock，第三代记为P3Stock。前三代均做为种毒，取第3代培养上清接种48孔板中的sf9细胞，同时设不接毒对照。60小时后弃上请，用预冷的固定液(丙酮:甲醇＝1:1)固定。弃固定液，加鼠抗6His抗体，37℃孵育50min，用PBS洗3遍，加FITC标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育50min，用PBS洗3遍，荧光显微镜下观察(图1)。结果表明，接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色荧光(图1a)，而未接毒sf9细胞孔未显荧光(图1b)。说明重组病毒能表达BVDV E2蛋白。

7.蛋白纯化

将鉴定正确的种毒用sf9细胞扩增至P6代，测定病毒滴度。用ExpressFive培养基(Invitrogen公司)悬浮培养High Five昆虫细胞(Invitrogen公司)(27℃，180r/min震荡培养)，待High Five昆虫细胞长至对数生长期时，更换新的ExpressFive培养基，调整细胞浓度为2～5×10^-6/ml，将重组杆状病毒以10MOI剂量感染细胞，96小时后收获。2000r/min离心10min，取上清，加入0.1％的甲醛溶液灭活病毒后，用Ni离子柱HisTrap HP(GE产品)纯化，按产品说明书进行，获得的产物为E2重组蛋白，测定蛋白浓度，分装后-80℃冻存备用。

8.BVDV高免血清的制备

将纯化的蛋白按1:1(v/v)比例加入完全弗氏佐剂，乳化后免疫大耳白兔，皮下多点注射，每只1ml(约50ug/只)，28天后加免一次。加免14天后心脏采血，分离血清。56℃热灭活40min，加入20％甘油PBS后分装冻存备用。使用前用PBS稀释至一定浓度。

二、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白应用

1.BVDV间接免疫荧光方法的建立

将处于对数生长期的MDBK细胞系传代，加至24孔板，待细胞长至60-80％满时，吸干培养基，接种稀释好的BVDV，每孔0.5mL，37℃5％CO₂培养箱中吸附1.5h后换2％FBS的MEM维持液每孔0.5mL，37℃5％CO₂培养箱中培养48h后，吸干培养液，加入预冷的丙酮∶甲醇(1:1)0.5mL，固定30min，吸干，风干后每孔加入0.5mL PBS漂洗一次。将制备的BVDV E2抗体用5％马血清的PBS按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，各稀释度每孔加200uL，37℃温育1h，弃抗体液，PBS漂洗三次，然后加入FITC标记羊抗兔抗体(Sigma公司)(1:500稀释)，每孔200uL，37℃温育1h后，用PBS漂洗三次。置倒置荧光显微镜下观察(图3)。同时用AHVLA McAb染色液作对照。结果表明，随着稀释度的增加，免疫荧光逐渐减弱，而1∶50有轻微非特异性背景。1:100和1:200倍稀释效果最佳。

2.BVDV抗体间接ELISA方法的建立

(1)抗原包被浓度和血清稀释度的确定

采用棋盘滴定法。将纯化的E2蛋白在酶标板上从左到右的按照4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL……19ng/mL浓度稀释，每孔100μL，4℃放置16h。用PBST洗液洗板1次，每孔加入5％马血清PBS，4℃封闭24h。阳性对照血清和阴性对照血清分别进行10倍、50倍、100倍稀释，加入反应板中，每孔100μL。37℃反应1h，PBST洗液洗涤3次，每孔加入100μL兔抗牛酶标二抗(1:30000)，37℃反应1h，PBST洗液洗涤3次，每孔加入底物显色液100μL，避光显色10min，每孔加入100μL终止液，于450nm处读数仪读取OD值，620nm作为参考波长。结果见下图4。

从图中阳性对照血清的OD值可以看出，当包被抗原浓度在4μg/mL～0.25μg/mL浓度之间时，阳性血清的OD值维持在一个较稳定的范围内。随着抗原包被浓度的进一步下降，OD值与包被蛋白的浓度出现一定的线性关系。因此，选择拐点浓度作为抗原包被的最佳浓度，即0.25μg/mL。

当包被抗原浓度为0.25μg/mL时，综合考虑阴阳性血清OD值，P/N值等，将血清的最终稀释倍数确定为100倍。

(2)封闭液的选择

分别采用3％BSA、5％PVP、10％马血清、3％明胶作为封闭剂进行封闭，封闭条件为4℃24h。比较标准阳性对照血清和标准阴性对照血清的OD值的比值(P/N值)，确定最佳的封闭液成分。

通过对多种封闭液封闭效果的比较，选择阳性血清OD值和P/N值都较高的作为本方法的封闭剂，结果见下图5。

从图5中可以看出3％明胶作为封闭剂时，阳性血清的P/N值最高，因此，选择3％明胶作为本方法的封闭剂。

(3)酶标二抗的最适浓度

将酶标二抗进行10000×、20000×、30000×和40000×稀释，对阴阳性对照血清进行检测，比较S/N值，确定酶标二抗的最适稀释倍数，结果见下图6。

从图中可以看出，酶标二抗稀释20000×时，S/N值最高，因此，确定酶标二抗的最适稀释倍数为20000×。

(4)临界值的确定

采用本研究建立的ELISA方法对45份田间阴性血清进行检测，并用IDEXX试剂盒进行比较。经ROC曲线分析，本方法OD值的临界值暂定为0.1935，结果见下图7。

3.试剂组装

(1)BVDV间接免疫荧光检测试剂盒

1)BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的组份配制

PBS:NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄2.83g，溶于1L去离子水中。

稀释液:5ml马血清稀释至100ml PBS中。

BVDV高免血清：将纯化的蛋白按1:1(v/v)比例加入完全弗氏佐剂，乳化后免疫大耳白兔，皮下多点注射，每只1ml(约50μg/只)，28天后加免一次。加免14天后心脏采血，分离血清。56℃热灭活40min，加入20％甘油后分装冻存备用。使用前用PBS稀释至一定浓度。

FITC标记羊抗兔抗体：为商品化试剂，用稀释液稀释至一定浓度。

2)BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的组装

将准备好的BVDV荧光抗体染色试剂盒的组份按下表(表1)组装：

表1 BVDV荧光抗体染色试剂盒的组份

组份	规格	数量
			BVDV E2高免血清	2ml/管	1管
FITC标记羊抗兔抗体	1ml/管	1管
			稀释液	50ml/瓶	1瓶
PBS	50ml/瓶	1瓶

(2)BVDV抗体间接ELISA试剂盒的组装

1)BVDV抗体间接ELISA试剂盒的组分

试剂盒组成包括:包被抗原的ELISA板、10×PBS、10×PBST、3％明胶PBS液、TMB显色液A和B、0.75％过氧化氢尿素溶液、终止液、阳性血清对照、阴性血清对照。

包被液：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，溶于1L双蒸水。

PBS：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄2.83g，溶于1L去离子水中。

PBST：PBS中加入0.05％Tween-20，用于洗涤液。

3％明胶PBS液：PBS中加入3％明胶，用于封闭液，和血清稀释液。

TMB显色液：

显色液A：200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。

显色液B：Na₂HPO₄ 14.6g、柠檬酸9.33g，加注射用水至900mL，调pH至5.0～5.4，补加注射用水定容至1000mL。

工作液：10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入1mL显色液A，混匀后加入50μL0.75％过氧化氢尿素溶液。

终止液：2M H₂SO₄。

包被抗原的ELISA板：将纯化的BVDV E2蛋白用包被液按一定浓度稀释后，包被ELISA板，每孔包被100μl，4℃包被12h。用PBS洗涤3次，每次300μl/孔，用3％明胶PBS液进行封闭，每孔300μl，37℃封闭40min，用PBS洗涤3次，每次300μl/孔，在洗板机上进行。室温凉干，加入封口袋中，抽真空封好。

2)BVDV抗体间接ELISA试剂盒的组装

将准确好的ELISA板、10×PBS、10×PBST、3％明胶PBS液、TMB显色液A和B、0.75％过氧化氢尿素溶液、终止液、阳性血清对照、阴性血清对照等一一放入试剂盒中，封闭，帖签，4℃保存。

附图说明

图1 6His荧光抗体染色结果图中显示重组病毒能表达BVDV E2蛋白的检测结果，其中图1a显示接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色荧光；图1b显示未接毒sf9细胞孔未显荧光。

图2纯化的BVDV E2蛋白，显示本发明构建的重组杆状病毒表达纯化所得的BVDVE2蛋白。

图3 BVDV免疫荧光染色结果，其中图1a显示本发明BVDV抗体荧光染色结果；图1b显示AHVLA McAb染色液染色结果。

图4包被抗原浓度比较

图5不同封闭剂效果比较

图6酶标二抗的最适浓度

图7临界值分析

图8本发明技术路线

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物有：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BVDV BA株(CVCC AV69，中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p144)；重组杆状病毒BacVME2-His株，其父本为来自DH10Bac菌(Invitrogen公司)中的杆状病毒基因组，通过将外源基因BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列克隆入pFastBac1质粒后与DH10Bac菌中的杆状病毒基因组后获得的重组干状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒，该菌株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo.12544。

本发明的优点

本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用。其优点为：

1.建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达、纯化方法，可制备纯的BVDV E2蛋白。

2.仅用BVDV的E2蛋白免疫兔子制备抗体，比用全病毒免疫牛本身制备的抗体特异性好，背景浅，易判定；使用FITC标记二抗，建立了间接荧光法，因此敏感性更好；操作简单：采用预混液，减少操作时间。

3.用纯的BVDV E2蛋白包被，优化了封闭条件、血清及抗体保存液，建立了BVDV抗体间接ELISA方法，组装了敏感且价格低廉的BVDV抗体间接ELISA试剂盒，可改变长期依赖进口BVDV抗体ELISA试剂盒的局面。

实施例

实施例1

──重组杆状病毒的构建

1.转座获得重组杆粒DNA

将pFB-ME2-His转化DH10Bac构建出的杆粒DNA命名为：bME2-His。

试剂配制：

SOC培养基：2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM Nacl，2.5mMKCl，将以上组分高压灭菌后，加入滤菌的Mg²⁺溶液和葡萄糖溶液，调至浓度为：20mM MgSO₄、10mM MgCl₂、20mM葡萄糖。

LA-Bac抗性琼脂平板：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，琼脂12g，1000ml去离子水溶解，高压灭菌，冷却后加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四环毒至10μg/ml，IPTG至40μg/ml，Bluo gal至100μg/ml。

抗性LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，1000ml去离子水溶解，高压灭菌，冷却至55℃左右，加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四环毒至10μg/ml。

具体操作如下：

将1管DH10Bac感受态细胞(Invitrogen公司)和5μl pFB-ME2-His质粒混匀，-20℃冷冻30min，取出后冰上静置10min，加入1ml SOC培养基，37℃180r/min培养1h，取100μl涂LA-Bac抗性琼脂平板。37℃培养24h。取白斑接种5ml抗性LB培养基，37℃培养过夜。PCR鉴定。

2.重组病毒的获得

将重组杆粒bME2-His用转染试剂Cellfectin转染sf9细胞，扩大培养，收集培养上清进行PCR鉴定。获得重组病毒命名为杆状病毒BacVME2-His株。该毒株已于2016年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.。

试剂：

转染试剂：cellfectin(Invitrogen)，10362-100

Grace培养基(Invitrogen)，11595-030

Sf900II培养基(Invitrogen)，10902-088

操作过程：

1)将处于对数生长期的sf9细胞用弯头巴氏吸管吹散后转移至60mm组织培养皿中，吸附约0.5h。数量约2×10⁶个细胞，约可铺满70％～80％的面积。

2)准备转染液：

①100μlGrace培养基与9μl cellfectin混合

②100μlGrace培养基与4μl质粒混合

③将A、B液轻轻混合，室温静置30min后加入800μl Grace培养基。

3)小心地吸走60mm组织培养板上的培养基，并用Grace培养基轻轻漂洗两遍。并吸走所有培养基。

4)将转染混合物轻轻地全部加入到60mm组织培养板中，与sf9细胞室温作用4h。期间要轻轻摇动数次。

5)4h后将1ml Sf900II培养基加至60mm组织培养皿中，用封口膜封口后于细胞培养箱中27℃培养。转染后每天观察转染细胞单层的形态变化及生长特征，细胞出现明显的细胞病变，72h后收集上清，做为病毒基础种子液，记为P1Stock，获得的重组杆状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒，该毒株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。

6)提取病毒DNA进行PCR测序鉴定。

实施例2

──BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的检测

采集田间牛血清样本180份，将处于对数生长期的MDBK细胞系传代，加至24孔板，待细胞长至60％～80％满时，吸干培养基，接种稀释好的牛血清样本，每个样本接种4孔，每孔0.5mL，37℃5％CO₂培养箱中吸附1.5h后换2％FBS的MEM维持液每孔0.5mL，37℃5％CO₂培养箱中培养48h后，吸干培养液，加入预冷的丙酮∶甲醇(1:1)0.5mL，固定30min，吸干，风干后每孔加入0.5mL PBS漂洗一次。用用本研究建立的BVDV间接免疫荧光检测试剂盒和AHVLAMcAb染色液同步检测田间牛血清样本180份，各检测2孔，统计BVDV检出率。结果，共检测出6份阳性样本，符合率为100％。

实施例3

——BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX试剂盒比较

用本研究开发的BVDV抗体间接ELISA试剂盒检测牛血清样本749份，统计二者的符合率。结果自建BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒阳性符合率为92.9％，阴性符合率为97.7％，总符合率为95.7％(表2)。

表2 自建BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒符合率

Claims (3)

1.一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列(序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVME2-His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。

2.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的应用，其特征在于用该BVDV的E2蛋白免疫动物制备抗体，并用此抗体为基础组装的BVDV病原间接免疫荧光染色试剂盒。

3.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于用该BVDV的E2蛋白作为包被抗原，以及优化的封闭液、血清稀释液等组装成BVDV抗体间接ELISA试剂盒。