CN105929176A - 一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：缓冲液、表面活性剂、螯合剂、防腐剂，试剂R2：缓冲液、无机盐离子、防腐剂、稳定剂、胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度。本发明具有检测方便、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性，但在心脏以外的组织中也有低浓度表达，心肌缺血性损伤出现后，H-FABP可以早在胸痛发作后1-3小时在血液中被发现，6-8小时达到峰值而且血浆水平在24-30小时内恢复正常，心型脂肪酸结合蛋白由132个氨基酸组成，分子量为15 kDa，心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因位于染色体I上，它是心脏最丰富的蛋白质之一，心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。
心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的特征看似与肌红蛋白的相似，这两种在心肌和骨骼组织中表达的低分子量胞质蛋白是线粒体氧化的基质而且在症状发作后2小时内释放，6小时出现最大浓度，24小时内恢复基线浓度，然而，他们在心脏和肌肉组织中的浓度不同，心脏中H-FABP浓度比骨骼肌中高2-10倍，与此相反，心脏细胞中肌红蛋白浓度比骨骼细胞中低2倍，肌红蛋白的正常血浆浓度比心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的高10-15倍，游离血浆肌红蛋白水平升高是被广泛接受的早期心肌损伤标志而且在1994年Bhayana等人证明了血浆肌红蛋白水平升高比CK-MB和cTnT水平升高在症状发作后3-6小时内排除急性心肌梗塞（AMI）上具有优越性。尽管在发表的几个准则中肌红蛋白被推荐为心脏损伤的早期标志物，但心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）更加具有心脏特异性而且由于其生物学特性它可能被认为是一种更准确的诊断试验。
目前，H-FABP的检测方法有酶联免疫吸附法、放射免疫法等，但这些方法都有局限性，酶联免疫吸附法操作复杂，耗时长，放射免疫法有放射性元素，对环境有一定的污染，而且测定结果准确度低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、污染环境以及测定准确度低的缺陷，而提供一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
表面活性剂 5~15 mL/L
螯合剂 10~60 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
无机盐离子 40~300 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
稳定剂 6~18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
表面活性剂 10 mL/L
螯合剂 35 mmol/L
防腐剂 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 200 mmol/L
防腐剂 0.4g/L
稳定剂 12 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-20，所述的螯合剂采用EDTA·2Na，所述的防腐剂采用叠氮钠、Proclin-300、苯酚中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化镁、氯化钾中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用叠氮钠、Proclin-300、苯酚中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用蔗糖、甘油、牛血清白蛋白中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体的制备方法为：
用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，反应完成后，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-3%为止，然后边搅拌边加入抗心型脂肪酸结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为15 g/L为止，4℃的条件下封闭8-12小时即可制备得到胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体。
作为优选，本发明还公开了上述测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
表面活性剂 5~15 mL/L
螯合剂 10~60 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
无机盐离子 40~300 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
稳定剂 6~18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为1:1；
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:200之间。
本发明的检测原理是：本品以乳胶凝集法为原理，样本中（血清或血浆）的心型脂肪酸结合蛋白可与吸附在乳胶颗粒上的抗心型脂肪酸结合蛋白抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长的吸光度值，即可算出H-FABP的含量。
样本中心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的活性（ng/mL）= CS ×（ng/mL）
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中H-FABP的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R1中添加了螯合剂，而螯合剂采用EDTA·2Na，因此在试剂R1和样本孵育的过程中，去除了金属离子对本检测的干扰，因此测定的准确度大大提高，另外本发明不含有任何放射性物质，不会对环境产生污染，而且操作比较方便。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 10 mL/L
EDTA·2Na 35 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4g/L
甘油 12 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
MES缓冲液 15 mmol/L
吐温-20 15 mL/L
EDTA·2Na 10 mmol/L
苯酚 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 50 mmol/L
氯化镁 300 mmol/L
苯酚 0.6 g/L
甘油 18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 3g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，反应完成后，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为3%为止，然后边搅拌边加入抗心型脂肪酸结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为15 g/L为止，4℃的条件下封闭8小时即可制备得到胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 10 mL/L
EDTA·2Na 35 mmol/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
叠氮钠 0.4g/L
甘油 12 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取100μl试剂R1与4μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入100μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，反应完成后，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为3%为止，然后边搅拌边加入抗心型脂肪酸结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为15 g/L为止，4℃的条件下封闭8小时即可制备得到胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
MES缓冲液 15 mmol/L
吐温-20 15 mL/L
EDTA·2Na 10 mmol/L
苯酚 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MES缓冲液 50 mmol/L
氯化镁 300 mmol/L
苯酚 0.6 g/L
甘油 18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 3g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取100μl试剂R1与4μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入100μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度。
表1为实施例1所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度为 6 ng/mL，测定结果见表1：
表1
| 第1次（ng/mL） | 第2次（ng/mL） | 第3次（ng/mL） | 均值（ng/mL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 6 | 6 | 6 | 6 | 0.00 |
| 实施例2 | 6 | 5 | 6 | 5.67 | 5.56 |
由表1可知，本发明所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度为 30 ng/mL，测定结果见表2：
表2
| 第1次（ng/mL） | 第2次（ng/mL） | 第3次（ng/mL） | 均值（ng/mL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 31 | 30 | 30 | 30.3 | 1.00 |
| 实施例2 | 32 | 31 | 31 | 31.3 | 4.33 |
由表2可知，本发明所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
表面活性剂 5~15 mL/L
螯合剂 10~60 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
无机盐离子 40~300 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
稳定剂 6~18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
表面活性剂 10 mL/L
螯合剂 35 mmol/L
防腐剂 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 200 mmol/L
防腐剂 0.4g/L
稳定剂 12 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-20，所述的螯合剂采用EDTA·2Na，所述的防腐剂采用叠氮钠、Proclin-300、苯酚中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化镁、氯化钾中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用叠氮钠、Proclin-300、苯酚中的一种或多种的组合，所述的稳定剂采用蔗糖、甘油、牛血清白蛋白中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体的制备方法为：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg 的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，反应完成后，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50mmol/L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-3%为止，然后边搅拌边加入抗心型脂肪酸结合蛋白抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为15 g/L为止，4℃的条件下封闭8-12小时即可制备得到胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
表面活性剂 5~15 mL/L
螯合剂 10~60 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 50~150 mmol/L
无机盐离子 40~300 mmol/L
防腐剂 0.2~0.6 g/L
稳定剂 6~18 g/L
胶乳包被抗心型脂肪酸结合蛋白抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的心型脂肪酸结合蛋白的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为1:1。
8.根据权利要求6所述的一种测定心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:200之间。
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| CN111272991A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-06-12 | 苏州德沃生物技术有限公司 | 抗原稳定剂 |
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