CN112939956B - 一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针分子式为C₁₉H₁₉NO₃S₂，其结构式如下：

Description

一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针及其制备方 法和应用

技术领域

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

汞的化合物能与生物体内核酸、酶和蛋白质反应，从而对生命体造成损害。次氯酸本身具有较强的亲核性和氧化性，在生命体的免疫防御方面起着重要作用。因此，简单，可靠，精准地检测出汞离子与次氯酸根离子具有非常重要的意义。

目前测定汞和次氯酸含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循环法、毛细管电泳法和HPLC法等，这些方法各有优点，但也都有不足之处。比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差；碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法，但对样品溶液的酸度和温度反应敏感，不易操作；酶循环法是利用酶的底物特异性来放大被测物质的测定方法，但使用的工具酶用量大，成本较高；毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低，而且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离的重现性，这些弊端都会导致疾病诊断的误差；HPLC法准确性高，样品处理简单，但受色谱柱局限，且耗费时间很长。

而荧光探针检测法以无损、可视化原位检测等优点备受研究者重视，但是能够与汞离子和次氯酸根离子特异性响应并且能将二者区分的荧光探针尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针。该荧光探针实现了对汞离子和次氯酸根离子的特异性识别响应，不受干扰离子的影响，而且直接肉眼观察就能判断汞离子和次氯酸根离子的存在与否。

本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于检测汞离子和次氯酸根离子的荧光探针，所述荧光探针的分子式为C₁₉H₁₉NO₃S₂，结构式如下：

上述用于检测汞离子和次氯酸根离子的合成路线如下：

制备方法具体包括以下步骤：

(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，于氮气保护下回流至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，经重结晶后得到化合物1；

(2)将步骤(1)制备的化合物1溶于甲醇中，然后加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应11～15h后，经浓缩冷却析出晶体，用去离子水洗涤后得到化合物2；

(3)将步骤(2)制备的化合物2加入到HI中，回流反应12～24h后，经冷却、过滤、洗涤得到化合物3；

(4)将步骤(3)制备的化合物3、乌洛托品和多聚甲醛加入到乙酸中，回流反应1～3h后，降温至80～90℃并加入过量浓盐酸继续反应35～40min，冷却后过滤取滤液，经二氯甲烷萃取得粗产品，所得粗产品利用柱色谱分离，得到化合物4；

(5)将步骤(4)制备的化合物4、无水硫酸镁、对甲苯磺酸加入四氢呋喃中，并在氮气保护下搅拌得到混合溶液；将1,4-乙二硫醇溶于四氢呋喃中，并将其加至上述混合溶液中，于常温下搅拌6～8h，反应结束后去除溶剂，经柱色谱分离得到荧光探针。

优选的，步骤(1)中4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺的摩尔比为1:(5～7)。

优选的，步骤(2)中化合物1与甲醇钠的摩尔比为1:(8～12)。

优选的，步骤(3)中化合物2的用量为1.5～2.0g，HI的用量为20～40mL。

优选的，步骤(4)中化合物3与乌洛托品的摩尔比为1:(1～1.5)；乌洛托品和多聚甲醛的质量比为1:(1～1.5)。

优选的，步骤(5)中化合物4、无水硫酸镁、对甲苯磺酸和1,4-乙二硫醇的摩尔比为1:(1～3):(1～1.2):(1～1.2)。

上述荧光探针在汞离子和次氯酸根离子荧光检测中的应用，具体用于汞离子和次氯酸根离子含量的荧光检测、目视定性检测和细胞成像检测。

和现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明以新型萘酰亚胺染料，设计并合成了萘酰亚胺-1,4-乙二硫醚荧光探针，在PBS体系中，所述荧光探针整体分子呈淡黄色、弱黄色的荧光，随着体系中特定分析物汞离子和次氯酸根离子浓度的不断增加，诱导1,4-乙二硫醚与汞离子和次氯酸根离子反应，使1,4-乙二硫醚和汞离子形成难溶物，或者使1,4-乙二硫醚和次氯酸根反应，荧光探针释放出萘酰亚胺染料分子单体，荧光强度显著增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离子等对检测效果几乎无影响，因而实现了对汞离子和次氯酸根离子的特异性识别响应；

2.本发明直接肉眼观察就能判断汞离子和次氯酸根离子的存在与否，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针的核磁氢谱图；

图2为实施例1制备的荧光探针的核磁碳谱图；

图3中(a)为实施例1制备的荧光探针与10当量的汞离子随反应时间的增加荧光光谱的变化图，(b)为520nm处荧光强度随反应时间增加的变化情况(Ex＝410nm，Em＝400-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图4中(a)为实施例1制备的荧光探针与不同当量的汞离子反应后的荧光光谱的变化图，(b)为520nm处荧光强度随汞离子加入当量的变化情况(Ex＝410nm，Em＝400-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图5为实施例1制备的荧光探针与不同阳离子反应后的荧光光谱的变化结果(Ex＝410nm，Em＝400-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图6为实施例1制备的荧光探针与不同阳离子反应后520nm处的荧光强度的柱状图(Ex＝410nm，Em＝400-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)，图中：从左往右(1-19)依次为空白对照、Hg²⁺、K⁺、Na⁺、Al³⁺、Mg²⁺、Fe^3+-、Ag⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Cs²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Cu²⁺、Sn²⁺、Ba²⁺、Ni³⁺；

图7为实施例1制备的荧光探针与汞离子反应前后的溶液在日光灯下的颜色变化；其中：(a)为荧光探针与汞离子反应前，(b)为荧光探针与汞离子反应后；

图8为实施例1制备的荧光探针与汞离子反应前后的溶液在紫外灯下的颜色变化；其中：(a)为荧光探针与汞离子反应前，(b)为荧光探针与汞离子反应后；

图9为实施例1制备的荧光探针Probe在加入次氯酸后随时间变化的紫外吸收光谱；

图10中(a)为实施例1制备的荧光探针与0-0.5当量的次氯酸根离子随反应时间的增加荧光光谱的变化图，(b)为560nm处荧光强度随反应时间增加的变化情况(Ex＝430nm，Em＝440-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图11中(a)为实施例1制备的荧光探针与0.5-1.5当量的次氯酸根离子反应后的荧光光谱的变化结果；(b)为530nm处荧光强度随汞离子加入当量的变化情况(Ex＝430nm，Em＝440-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图12为实施例1制备的荧光探针与不同阴离子反应后的荧光光谱的变化结果(Ex＝430nm，Em＝440-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)；

图13为实施例1制备的荧光探针与不同阴离子反应后530nm处的荧光强度的柱状图(Ex＝430nm，Em＝440-750nm，Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)，图中：从左往右(1-17)依次为空白对照、ClO^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、CN^-、PO₄ ^3-、Ac^-、SO₄ ^2-、CO₃ ^2-、HSO₄ ^-、SCN^-、HS^-、SO₃ ^2-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-；

图14为实施例1制备的荧光探针与次氯酸根离子反应前后的溶液在日光灯下的颜色变化；其中：(a)为荧光探针与次氯酸根离子反应前，(b)为荧光探针与次氯酸根离子反应后；

图15为实施例1制备的荧光探针与次氯酸根离子反应前后的溶液在紫外灯下的颜色变化；其中：(a)为荧光探针与次氯酸根离子反应前，(b)为荧光探针与次氯酸根离子反应后。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明，但并不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)分别称量4-溴-1,8-萘二甲酸酐4.10g(15mmol)与正丁胺1.12g(15mmol)加入到30ml乙醇中，于氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，经乙醇重结晶后即得所述化合物1，产量为14.41g、收率89％，其结构式如下：

(2)取3.31g(10mmol)步骤(1)制备的化合物1溶于20ml甲醇中，然后依次加入甲醇钠0.70(10mmol)和五水硫酸铜0.25g(1mmol)，回流反应12h后，浓缩后冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得化合物2，产量2.51g、收率87.2％，其结构式如下：

(3)将2.13g(7.5mmol)步骤(2)制备的化合物2加入到30mL浓HI(质量分数为57％)中，于140℃下回流反应8h(通过TLC监测，化合物2反应完全)，经冷却过滤、***洗涤后即得化合物3，产量1.38g、收率93％，其结构式如下：

(4)取200.4mg(0.744mmol)的化合物3、乌洛托品104.3mg(0.744mmol)、多聚甲醛104.3mg于50mL圆底烧瓶中，加入过量乙酸(15mL左右)回流1h，降温至85℃，加入过量浓盐酸(质量分数为37.5％，15mL左右)反应35min；将反应液冷却到室温，加入去离子水稀释，过滤取滤液，用二氯甲烷萃取得粗产品，然后用硅胶柱进行分离得到化合物4，硅胶颗粒大小为200-300目，柱分离洗脱剂配比为石油醚:乙酸乙酯＝3:1(体积比，下同)，化合物4的产率为80.69％，结构式如下：

(5)取化合物4(300mg，1.02mmol)、无水硫酸镁(1g，8.30mmol)、对甲苯磺酸(210mg，1.20mmol)加入到10ml四氢呋喃中，在氮气保护下搅拌10min得混合溶液，将1,4-乙二硫醇(213.05mg，1.22mmol)溶于5ml无水四氢呋喃中，将其缓慢滴加至上述混合溶液中，于常温下搅拌7h，全程氮气保护；然后经硅胶柱色谱分离得到所述荧光探针，所用硅胶颗粒大小为200-300目，所用洗脱剂:石油醚:二氯甲烷＝1:4，产率为59.61％，荧光探针的结构式如下：

图1和图2分别为本实施例制备的荧光探针的核磁氢谱图和核磁碳谱图。根据图1和图2的结构表征结果，其中碳谱数据为：¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.35(s),163.74(s),158.22(s),134.14(s),132.00(s),129.47(s),129.00(s),126.17(s),123.79(s),122.40(s),115.13(s),114.60(s),55.87(s),40.20(d,J＝11.5Hz),40.14(s),30.27(s),20.40(s),13.88(s)，综合上述数据可以判断，得到了预期结构的荧光探针。

荧光检测应用试验

(1)试剂准备

a.荧光探针溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)的配制：

取实施例1所制备的荧光探针溶于乙醇中，配制成浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的荧光探针溶液；

b.各种阳离子及阴离子的标准溶液的配制：

各种阳离子及阴离子的标准品均用去离子水配置成为浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的标准溶液，此外氯化汞和次氯酸钠另外再配制一份浓度为1.00×10^-2mol·L^-1的标准溶液；

c.荧光探针与汞离子的性质检测

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μL加入到比色皿中，再加入浓度为1.00×10^-2mol·L^-1的氯化汞标准溶液，用乙醇稀释至3mL，然后每隔1min测量其荧光性质一次，直到其荧光强度不再增强为止(Ex＝410nm，Em＝400-750nm,Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)，所得荧光光谱如图3中(a)所示，由图3中(a)可见，随反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，说明探针与汞离子作用存在一定的时间效应，为探针其他响应性研究中提供可靠的作用时间。图3中(b)为520nm处荧光强度随反应时间增加的变化情况，随着时间增加，在30min内，荧光强度达到最大值，如图3(b)所示，荧光强度随着时间延长不再发生变化，荧光强度比加入汞离子前增加14倍，最大发射波长发生蓝移，从560nm蓝移到530nm。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30组30μL且依次加入到30支试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，余下35个试管中再依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.3、3.6、4.0、4.5、5当量的浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的氯化汞标准溶液，然后用乙醇稀释至3mL，测量其荧光性质(Ex＝410nm，Em＝400-750nm，Ex.Slit/Em.Slit2.5/2.5)，荧光光谱如图4中(a)所示，由图4中(a)可见，随着加入的汞离子当量的增加，荧光强度逐渐增强，且在0-20μM范围内，如图4中(b)所示荧光强度与汞离子当量存在线性关系，根据检出限计算公式D＝3σ/k(其中σ为空白标准偏差，k为拟合曲线斜率)，得该探针的检出汞离子的检出限达到为0.04μM。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出19组30μL且分别加入到19个试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，余下18个试管中再依次加入步骤b配制的10当量的浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的以下标准溶液：Hg²⁺；K⁺；Na⁺；Al³⁺；Mg²⁺；Fe³⁺；Ag⁺；Cd²⁺；Co²⁺；Zn²⁺；Cs²⁺；Mn²⁺；Ca²⁺；Sr²⁺；Cu²⁺；Sn²⁺；Ba²⁺；Ni³⁺，然后用乙醇稀释至3mL，120min后检测溶液的荧光发射光谱(Ex＝410nm，Em＝400-750nm,Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)，结果如图5所示；图6为荧光探针与不同阳离子反应后于520nm处的荧光强度的柱状图(从左往右(即从编号1-19)依次为空白对照、Hg²⁺、K⁺、Na⁺、Al³⁺、Mg²⁺、Fe^3+-、Ag⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Cs²⁺、Mn²⁺、Ca^{2 +}、Sr²⁺、Cu²⁺、Sn²⁺、Ba²⁺、Ni³⁺)。

由图5和图6可以看出，其他离子与本实施例所述荧光探针几乎没有荧光响应，而汞离子与荧光探针存在显著的荧光响应，说明本发明的荧光探针对汞离子的检测有较高的选择性，能够用于汞离子的检测。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μL加入到试管当中，再向试管中加入浓度为1.00×10^-2mol·L^-1的氯化汞标准溶液，然后用乙醇稀释至3mL，如图7所示，日光灯下，肉眼可见，汞离子可以使荧光探针的乙醇溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从橘黄色(图中(a))变成黄绿色(图中(b))；再如图8所示，紫外灯下，肉眼可视，汞离子诱导荧光探针发出黄绿色荧光(图中(b))，说明本发明荧光探针是一种具有生色传感功能的荧光探针，可用于汞离子的目视定性检测，极大地方便了汞离子的快速定性检测。

d.荧光探针与次氯酸根离子的性质检测

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μL加入到比色皿中，再加入浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的次氯酸钠标准溶液15μL，用乙醇稀释至3mL，然后每隔1min测量其紫外吸收光谱，直到吸光度不再增强为止，所得紫外光谱如图9所示，由图9可见，随反应时间的增加，最大吸收波长从460nm蓝移至435nm，吸收强度略有降低。反应速度很快，加入次氯酸后，10秒钟内就反应完全，延长时间，吸收光谱不再发生变化，说明探针能快速识别次氯酸根离子。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出16组30μL且依次加入到30支试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，余下15个试管中再依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5当量的浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的次氯酸钠标准溶液，然后用乙醇稀释至3mL，测量其荧光性质(Ex＝430nm，Em＝440-750nm，Ex.Slit/Em.Slit 2.5/2.5)，荧光光谱分别如图10中(a)和图11中(a)所示，可以看出，随着加入的次氯酸根离子当量的增加，荧光强度逐渐增强，加入0.5当量时，荧光强度达到峰值，继续加入次氯酸根离子，荧光逐渐减弱，0-5μM，如图10中(b)和图11中(b)所示荧光强度与次氯酸根离子当量存在线性关系，根据检出限计算公式D＝3σ/k(其中σ为空白标准偏差，k为拟合曲线斜率)检测限达到0.01μM。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出18组30μL且分别加入到17个试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，1个试管加入0.5当量的浓度为1.00×10^{- 3}mol·L^-1的的次氯酸钠标准溶液，余下15个试管中再依次加入步骤b配制的10当量的浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的标准溶液F^-；Cl^-；Br^-；I^-；CN^-；PO₄ ^3-；Ac^-；SO₄ ^2-；CO₃ ^2-；HSO₄ ^-；SCN^-；HS^-；SO₃ ^2-；HCO₃ ^-；NO₃ ^-，然后用乙醇稀释至3mL，120min后检测溶液的荧光发射光谱(Ex＝430nm，Em＝440-750nm,Ex.Slit/Em.Slit＝2.5/2.5)，如图12所示；图13为荧光探针与不同阴离子反应后在530nm处的荧光强度的柱状图(从左往右(即编号从1-17)依次为空白对照、ClO^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、CN^-、PO₄ ^3-、Ac^-、SO₄ ^2-、CO₃ ^2-、HSO₄ ^-、SCN^-、HS^-、SO₃ ^2-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-)。由图12和图13可以看出，除次氯酸根离子外的其他离子与本发明所述荧光探针几乎没有荧光响应，而次氯酸根离子与本发明所述荧光探针存在显著的荧光响应，说明本发明所述荧光探针对汞离子的检测有较高的选择性，能够用于次氯酸根离子的检测。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μL加入到试管当中，再向试管中加入浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的次氯酸钠标准溶液15μL，然后用PBS稀释至3mL，与次氯酸根离子反应前后的溶液在日光灯下的颜色变化，如图14所示；可以看出，日光灯下，肉眼可见，次氯酸根离子可以使荧光探针的PBS溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从橘黄色(图14中(a))变成黄绿色(图14中(b))；与次氯酸根离子反应前后的溶液在紫外灯下的颜色变化，如图15所示，可以看出，紫外灯下肉眼可视，次氯酸根离子诱导荧光探针发出黄绿色荧光(图15中(b))，说明本发明所述荧光探针是一种具有生色传感功能的荧光探针，可用于次氯酸根离子的目视定性检测，极大地方便了次氯酸根离子的快速定性检测。

Claims (1)

1.一种荧光探针在次氯酸根离子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针的分子式为C₁₉H₁₉NO₃S₂，结构式如下：

，用于次氯酸根离子含量的荧光检测、目视定性检测和细胞成像检测。

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