CN107033879A - 一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：其制备过程和后处理过程相对简单，有良好的选择性和较高的灵敏度，抗干扰能力强。此外，在待测溶液中加入本发明所述荧光探针后，用肉眼就可以观察到溶液的颜色变化。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的检测谷胱甘肽的荧光探针，在小分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的天然活性肽，它由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。谷胱甘肽在体内以两种形态存在，即还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽，通常所指的谷胱甘肽也是还原型谷胱甘肽。医学研究表明谷胱甘肽与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症等，它们在生物体内的含量变化可以作为这些疾病诊断的依据，开发选择性识别谷胱甘肽的检测方法显得尤为重要。
目前测定活性肽含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循环法、毛细管电泳法和HPLC 法等，这些方法各有优点，但也都有不足之处。
比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差；
碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法，但对样品溶液的酸度和温度反应敏感，不易操作；
酶循环法是利用酶的底物特异性来放大被测物质的测定方法，但使用的工具酶用量大，成本较高；
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低，而且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性；
HPLC法准确性高，样品处理简单，但受色谱柱局限，且耗费时间很长。
而荧光探针检测法以无损、可视化原位检测等优点备受研究者重视，但是能够与谷胱甘肽特异性响应的荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。
本发明采用如下技术方案：
一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：
上述用于检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺反应得到N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(2)以铜盐作催化剂，将步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠反应得到N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(3)将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺与浓HBr反应得到N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(4)取步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，依次加入4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺，加入DS，反应后经后处理即得；
DS结构如下：
优选地，所述步骤(1)的具体合成方法如下：将摩尔比为1：1.2-6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，乙醇重结晶后即得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺。
优选地，所述步骤(2)的具体合成方法如下：取步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺溶于甲醇中，然后加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应2-4小时，浓缩后，冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺；
N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠的摩尔比为1：8-12。
优选地，所述步骤(3)的具体合成方法如下：将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8- 萘二甲酰亚胺加入到浓HBr中，回流反应10-20小时，冷却过滤，***洗涤后即得N-正丁基 -4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺。
优选地，所述步骤(4)的具体合成方法如下：将步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶和DS，0-5℃搅拌10min后，再滴加二环己基碳二亚胺的无水二氯甲烷溶液，滴加时间控制在5-15min，滴加完成后，0-5℃搅拌10-20min，然后于氮气保护下，室温反应10-24h，冷冻(-20℃，2h)后过滤，真空干燥得粗产品，将所得粗产品采用柱色谱分离即得所述荧光探针；
柱色谱分离所用的洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝400-50：1；
N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、DS与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：0.05：1.2：1.2。
上述用于检测谷胱甘肽的荧光探针的应用，用于待测样品中谷胱甘肽含量的荧光检测、目视定性检测和细胞成像检测，其中细胞成像检测的具体操作过程为本领域所公知，本发明不再赘述。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，其制备过程和后处理过程相对简单，有良好的选择性和较高的灵敏度，抗干扰能力强。此外，在待测样品中加入本发明所述荧光探针后，用肉眼就可以观察到溶液的颜色变化。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的检测谷胱甘肽的荧光探针，在小分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述荧光探针的合成路线图；
图2为本发明所述荧光探针的核磁氢谱图；
图3为本发明所述荧光探针的核磁碳谱图；
图4为本发明所述荧光探针的核磁质谱图；
图5为本发明所述荧光探针与不同氨基酸及离子反应后的荧光谱图；
图6为本发明所述荧光探针与不同氨基酸及离子反应后的紫外-可见吸收光谱的变化结果；
图7为本发明所述荧光探针与不同当量的谷胱甘肽、半胱氨酸反应后的荧光光谱的变化结果；
图8为本发明所述荧光探针与10当量的谷胱甘肽、半胱氨酸反应后的荧光强度随时间的变化结果；
图9为本发明所述荧光探针与不同当量的谷胱甘肽、半胱氨酸反应后的紫外-可见吸收光谱的变化结果；
图10为本发明所述荧光探针与10当量的谷胱甘肽、半胱氨酸反应后的紫外-可见吸收光谱随时间的变化结果；
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。
实施例1
一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，其制备方法，包括以下步骤：
(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺反应得到N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
所述步骤(1)的具体合成方法如下：将摩尔比为1：1.2-6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，乙醇重结晶后即得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺。
(2)以铜盐作催化剂，将步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠反应得到N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
所述步骤(2)的具体合成方法如下：取步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺溶于甲醇中，然后依次加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应2-4小时(此时TLC监测发现，N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺已反应完全)，浓缩后，冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得N- 正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺；
N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠的摩尔比为1：8-12。
(3)将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺与浓HBr反应得到N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
所述步骤(3)的具体合成方法如下：将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺1.5-2.5g加入到20-30mL浓HBr中，回流反应10-20小时(此时TLC监测发现，N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺已反应完全)，冷却过滤，***洗涤后即得N-正丁基-4-羟基 -1,8-萘二甲酰亚胺。
(4)取步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，加入4-二甲氨基吡啶、DS 和二环己基碳二亚胺，反应后经后处理即得，DS结构式如下：
DS的合成方法如下：
化合物3-1的合成方法如下：
将苯并噻吩-2-硼酸(3.09g,17mmol)加入100mL的圆底烧瓶中，然后加入30mL的乙醇，在机械搅拌的条件下逐滴滴加过氧化氢(5.6mL,30％)，反应8h后，溶液的颜色由粉红变为深红，减压蒸出乙醇，剩余物溶于100mL水中，用氯仿(每次60mL)萃取3次，有机层用MgSO4干燥，并且在真空的条件下浓缩，浓缩得到的剩余物用200-300目硅胶分离得化合物3-1，分离时所用洗脱剂为体积比为9：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。
化合物3-1：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.41-7.14(m,1H),3.95(s,1H).
化合物3-2的合成
在100mL的圆底烧瓶中，取化合物3-1(200mg)溶解在10mL四氢呋喃中，升温至 55～65℃，加入单水氢氧化锂的水溶液，搅拌15～18小时后，冷却至室温，加入水和***的混合溶液至反应停止，加入浓盐酸调节pH值为1.8～2.2，分离有机层，饱和食盐水洗涤后，无水Na2SO4干燥，然后减压蒸除有机溶剂，剩余物用柱色谱分离得桔色晶体化合物3-2，分离时所用的洗脱剂为体积比为9：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂；其中，中间体3-1与单水氢氧化锂的摩尔比为1：1.2-2。
化合物3-2：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.45-7.36(m,1H),7.23(t,J＝4.8Hz,1H),7.19 (dd,J＝5.6,3.6Hz,2H),3.82(s,2H),3.49(s,1H).MS(m/z):166.9[M-H]-
化合物DS的合成
在100mL的圆底烧瓶中，加入2,2’-二硫二吡啶(220mg)，用30mL的二氯甲烷溶解，冷却至0℃，在此条件下加入化合物3-2(168mg)，0℃反应10分钟后，再室温反应4-8小时，然后减压蒸除有机溶剂，用200-300目硅胶分离得到白色固体化合物DS，分离时所用的洗脱剂为体积比为3：1的石油醚和丙酮的混合溶剂。
DS：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.43(d,J＝5.0Hz,1H),7.84–7.61(m,3H),7.27 (tdd,J＝10.5,5.7,2.5Hz,3H),5.51(s,2H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.17,159.02, 149.02,137.85,135.68,134.68,130.95,129.07,127.98,121.32,120.29.)
所述步骤(4)的具体合成方法如下：将步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和DS，0-5℃搅拌10min后，再滴加二环己基碳二亚胺(DCC)的无水二氯甲烷溶液，滴加时间控制在5-15min，滴加完成后，0-5℃搅拌10-20min，然后于氮气保护下，室温反应10-24h，冷冻(冷冻条件为-20℃，2h)后过滤，真空干燥得粗产品，将所得粗产品采用柱色谱分离即得所述荧光探针；
柱色谱分离所用的洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝400-50：1；
N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、DS与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：0.05：1.2：1.2。
根据图2至图4的结构表征结果，可以判断，上述制备方法得到了预期结构的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：
荧光检测应用试验
(1)试剂准备
a.荧光探针溶液(1.00×10-3mol·L-1)的配制：
取0.00264g(M＝528.12)实施例1所制备的荧光探针溶于5mL乙腈中，配制成浓度为 1.00×10-3mol·L-1的荧光探针溶液；
b.各种氨基酸及阴离子标准溶液的配制
各种氨基酸及阴离子的标准品均用去离子水配置成为浓度为1.00×10-3mol·L-1和1.00×10-2 mol·L-1的标准溶液，所述氨基酸及阴离子列举如下：谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)、 NO2 -、CH3COO-、Br-、F-、HS-、I-、HSO3 -、SO4 2-、Cl-、SO3 2-；、CO3 2-、HCO3 -、CN-；
其中，谷胱甘肽和半胱氨酸分别另外配制一组1.00×10-2mol·L-1的标准溶液；
c.PBS缓冲溶液(0.01mol·L-1，pH＝7.4)的配制：
母液配置：0.2mol·L-1K2HPO4溶液：称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL水中；
0.2mol·L-1 KH2PO4溶液：称取27.2g KH2PO4·2H2O溶于1000mL水中；
0.2mol·L-1 PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol·L-1KH2PO4溶液，81mL的0.2mol·L-1 K2HPO4溶液混合，然后取50mL、0.2mol·L-1 PBS母液，加水稀释至1000mL即可。
配置16组体积均为3mL的缓冲体系，所述缓冲体系由pH为7.4的PBS缓冲液(10mM)和占PBS缓冲液33％(体积比)的乙醇混合而成，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，并依次作以下处理：
第0组——空白对照；第1组——100μM GSH；第2组——100μM Cys；第3组——100μM NO2 -；第4组——100μM CH3COO-；第5组——100μM Br-；第6组——100μM F-；第7组——100μM HS-；第8组——100μM I-；第9组——100μM HSO3 -；第10组——100 μM SO4 2-；第11组——100μM Cl-；第12组——100μM SO3 2-；第13组——100μM CO3 2-；第14组——100μMHCO3 -；第15组——100μM CN-；然后室温下进行荧光光谱检测(激发波长：450nm，发射波长：550nm，狭缝:5/5nm)，荧光检测结果如图5所示，可以看出，第1组和第2组的荧光强度明显高于其余组，说明本发明所述荧光探针对谷胱甘肽和半胱氨酸存在特异响应。需要说明的是，虽然本发明所述荧光探针对谷胱甘肽和半胱氨酸均存在特异响应，但是在病变的细胞中，谷胱甘肽含量的含量要远远大于半胱氨酸，也就是说，半胱氨酸对谷胱甘肽的影响基本可以忽略，不少文章中也出现类似情况，探针本身对谷胱甘肽和半胱氨酸都有响应，但是通常认为这是一种检测谷胱甘肽的荧光探针！
配置11组体积均为3mL的上述缓冲体系，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，并依次作以下处理：
第1组——空白对照；第2组——100μM GSH；第3组——100μM Cys；第4组——100μM NO2 -；第5组——100μM Br-；第6组——100μM F-；第7组——100μM HS-；第8组——100μMI-；第9组——100μM SO4 2-；第10组——100μM Cl-；第11组——100μM SO3 2-，然后室温下进行紫外-可见光谱检测，如图6所示，可以看出，探针在加入谷胱甘肽与半胱氨酸后，紫外-可见光谱发生明显变化，可利用紫外-可见光谱实现探针对含硫氨基酸尤其是谷胱甘肽的选择性识别。
配置多组3mL缓冲体系，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，并依次加入当量梯度变化(变化范围为0-3当量)的浓度为1.00×10-3mol·L-1的谷胱甘肽或半胱氨酸的标准液，然后室温下进行荧光光谱检测(激发波长：450nm，发射波长：550nm，狭缝:5/5 nm)，如图7所示，可以看出，谷胱甘肽和半胱氨酸的变化趋势相同，均是随着加入当量的增加，荧光强度逐渐增强，且在一定范围内，荧光强度与半胱氨酸或谷胱甘肽当量存在线性关系，由此可实现一定范围内的定量检测，具体的定量检测方法为本领域技术人员所公知，此处不再赘述。
配置两组3mL缓冲体系，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，然后分别加入浓度为1.00×10-2mol·L-1的谷胱甘肽和半胱氨酸的标准液30μL，室温下进行荧光光谱检测(激发波长:450nm，狭缝:5/5nm)，开始每隔10s进行荧光检测，以后时间间隔逐渐变大，检测结果如图8所示，随着检测时间的递增，荧光强度逐渐增强，说明探针与谷胱甘肽或者半胱氨酸有一定的响应时间，只有探针与含硫氨基酸作用一定时间后，才能释放最强荧光，时间效应的确定将有助于其他探针响应性，选择性的测试。
配置多组3mL缓冲体系，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，并依次加入当量梯度变化(变化范围为0-3当量)的浓度为1.00×10-3mol·L-1的谷胱甘肽或半胱氨酸的标准液，然后室温下进行紫外-可见光谱检测，表明探针紫外-可见光谱与谷胱甘肽浓度在一定浓度范围内呈线性变化，以此可利用紫外-可见光谱实现含硫氨基酸的定量分析。紫外- 可见光谱如图9所示，
同时，图9中涵盖了目视定性检测结果，谷胱甘肽图中为仅荧光探针(左)和荧光探针+ 谷胱甘肽(右)，半胱氨酸图中为仅荧光探针(左)和荧光探针+半胱氨酸(右)，通过两者的对比，可以明显看出，荧光探针与谷胱甘肽或半胱氨酸共存时存在荧光响应，在待测样品溶液中，加入荧光探针后，荧光检测如能肉眼观察到荧光，即可判定谷胱甘肽或半胱氨酸的存在。
配置两组3mL缓冲体系，在缓冲体系中加入步骤a所配制的荧光探针溶液30μL，然后分别加入浓度为1.00×10-2mol·L-1的谷胱甘肽和半胱氨酸的标准液30μL，室温下进行紫外-可见光谱检测，开始每隔10s进行紫外-可见光谱检测，以后时间间隔逐渐变大，检测结果如图10 所示，确定探针与含硫氨基酸反应的时间效应，以便在其他紫外测试中保证探针与含硫氨基酸是充分反应后进行测试。
最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims (7)

1.一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下：
2.权利要求1所述用于检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺反应得到N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(2)以铜盐作催化剂，将步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠反应得到N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(3)将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺与浓HBr反应得到N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，其结构式如下：
(4)取步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺，加入4-二甲氨基吡啶、DS和二环己基碳二亚胺，反应后经后处理即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体合成方法如下：将摩尔比为1：1.2-6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，乙醇重结晶后即得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体合成方法如下：取步骤(1)所得N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺溶于甲醇中，然后加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应2-4小时，浓缩后，冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺；N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺与甲醇钠的摩尔比为1：8-12。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体合成方法如下：将步骤(2)所得N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亚胺加入到浓HBr中，回流反应10-20小时，冷却过滤，***洗涤后即得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体合成方法如下：将步骤(3)所得N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶及DS，0-5℃搅匀后，再加入二环己基碳二亚胺，0-5℃搅匀，然后于氮气保护下，室温反应10-24h，冷冻后过滤，真空干燥得粗产品，将所得粗产品采用柱色谱分离即得所述荧光探针；N-正丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、DS与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：0.05：1.2：1.2。
7.权利要求1所述用于检测谷胱甘肽的荧光探针的应用，其特征在于，用于待测样品中谷胱甘肽含量的荧光检测、目视定性检测和细胞成像检测。
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