CN105874070A - 用于固氮的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

提供了可用于增加植物的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率和/或非生物胁迫耐受性，优选地对养分缺乏的耐受性的基因材料和核酸序列。具体地，描述了栽培植物中固氮特性的改善。

Description

用于固氮的转基因植物
技术领域
大体上，本发明涉及基因材料和核酸序列，其可用于增加植物的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率和/或非生物胁迫耐受性，优选地为对养分缺乏的耐受性。具体地，本发明涉及栽培植物中固氮性能的提高。本发明涉及转基因植物、它们的制造方法及这样的植物的用途。另外，本发明涉及可用于制造和评估这样的植物的方法。具体地，本发明属于固氮(氮固定，nitrogen fixation)的领域，并且允许在植物中赋予固氮性能或增强这样的性能。
背景技术
植物养分对植物的生长和发育是必不可少的，因此对植物产品的数量和质量也是必不可少的。全世界都使用大量肥料来支持植物的生长和发育。至关重要的养分中的一种是作为通常是植物生长中的限速元素的氮。氮是在活细胞中发现的许多重要化合物的一部分，如氨基酸、蛋白质、核酸和叶绿素。由于农作物植物高的氮需求，因此施氮是全世界农业的主要投入，其中每年要施用大约8千万公吨的氮肥。氮肥主要通过高能需工艺由天然气制得。除了需要全球总能源供应量的大约1％(SmithB.E.，Science 2002(297)，1654-1655)之外，生产人造氮肥，例如通过哈伯-博斯机制(Haber-Bosch-Mechanism)，还会用尽不可再生的化石燃料。因此，氮肥可能是对全世界农业生产的能源最密集的输入之一。由于温室气体的排放以及淋溶(浸出)损失了三分之一的氮肥，从而造成不良环境影响。例如，N2O是一种强效温室气体，其中相对的全球变暖可能性比CO2高300倍。大概10％的人类引起的温室效应归因于主要由农业管理实践还有工业工艺产生的N2O(Crutzen等人，Chem.Phys.Discuss.2007(7)，11191-11205)。
由于氮肥的高成本和其使用的负面影响，因此期望研发策略以在不降低产量和损害植物健康的情况下减少人工氮肥的消耗。
传统地，使用人工氮肥的替选方案是使用豆科植物作为绿肥的三区轮作制(three-field crop rotation)。然而，能对大气氮(N2，在下文描述中也简称为N)进行生物固定的并非植物本身；只有原核微生物包括固氮酶，即生物固氮所需的酶复合物。豆科植物使用这样的固氮微生物作为内共生体，特别地为根瘤菌属的微生物，例如苜蓿根瘤菌(Rh.meliloti)。其他固氮微生物为弗兰克氏菌(Franckia)属的放线菌，该放线菌例如在沙棘属、美洲茶(Ceanothus)属和木麻黄属的植物，特别是木麻黄中产生根瘤。在例如鱼腥藻属如满江红鱼腥藻(Anabaena azollae)和念珠藻(Nostoc)的蓝藻细菌中也发现了其他固氮微生物。
不幸的是，植物和微生物协作进行生物固氮是一个复杂的过程，其需要协调植物和微生物两者的新陈代谢。植物和微生物之间的关系处于寄生的边缘，因为始终存在微生物正好消耗其宿主而不是仅仅赋予宿主有益的固氮的危险。因此，对于大多数重要的农业植物，植物从生物固氮中获得的利益不会大量出现，特别是禾本科的那些植物；更特别地是稻(Ehrhartoidae)亚科、早熟禾(Pooideae)亚科和黍(Panicoideae)亚科、虎尾草亚科的那些植物；甚至更特别地是稻(Oryzeae)族、小麦(Triticeae)族、黍(Paniceae)族和蜀黍(须芒草，高粱，Andropogoneae)族的那些植物；以及甚至更特别地是稻属(特别是亚洲栽培稻(O.sativa)和非洲栽培稻(O.glaberrima)(栽培稻))、大麦(Hordeum)属(特别是大麦(H.vulgare)(大麦))、黑麦(Secale)属(特别是黑麦(S.cereale)(裸麦))、小麦属(特别是普通小麦(T.aestivum)(面包小麦)和一粒小麦(T.monococcum))、小黑麦(Triticosecale)属(黑小麦)、甘蔗属(特别是秀贵甘蔗(S.officinarum)、大茎野生蔗(新几内亚野生蔗，S.robustum)、竹蔗(中国竹蔗，S.sinense)、细秆甘蔗(S.barberi)、甘蔗食穗种(S.edule)和甘蔗属割手密(S.spontaneum)(甘蔗))、椮(Eleusine)属(特别是穇子(E.coracana))、高粱(Sorghum)属(特别是高粱(S.bicolor)(高粱属))、狼尾草(Pennisetum)属(御谷(P.glaucum)(小米))以及玉蜀黍(Zea)属(特别是玉蜀黍(Z.mays)(玉米))的那些植物。
不幸的是，不是任何时候都可以使用绿肥，例如在稻的栽培中。而且，绿肥不能与其他农作物一起种植，从而降低了每公顷农作物年产量。此外，已发现目前尚不能将固氮有机物转移至尚未适应于用这样的微生物协同培养的物种。或者各植物将遭受这样的微生物的感染，或者它们将不能维持微生物的生长。
因此，本发明的目的是提供用于减少农业以及稻、大麦、裸麦、小麦、黑小麦、甘蔗、高粱和玉米，特别是稻的栽培中对人工氮肥的需求的手段(方法，means)。
发明内容
本发明大体上涉及增加植物的产量、生物量、生长速率、对低养分土壤的耐受性、活力和/或氮利用效率的方法，包括向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻(Oryza longistaminata)的分离基因材料。为此，本发明涉及用于生产转基因植物细胞和转基因植物的方法，包括下述步骤：将长雄野生稻的基因材料引入到不同物种的植物细胞中，以分别获得植物细胞或植物，从而为固氮微生物提供栖息地，或者从而改良或增加分别包括植物细胞或植物的群落以及固氮微生物的生物固氮作用。可通过若干种手段将分离物质引入到目标植物或植物细胞中，如下文进一步详述的，其中，目标植物或植物细胞选自禾本科。本发明还扩展至包括分离基因材料的多核苷酸和载体以及其中已引入所述基因材料的栽培植物、其植物细胞或种子。本发明还涉及所述基因材料在用于改变植物的根与固氮微生物之间的结合以减少植物的施氮需求和/或提高谷类的氮保持度(nitrogen sustainability)中的用途。
详细地说，本发明涉及：
[1]一种增加植物的产量、生物量、生长速率、活力、来源于生物固氮的氮增量、氮利用效率、非生物胁迫耐受性和/或优选地增加对养分缺乏的耐受性的方法，包括向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的分离基因材料。
[2]根据[1]所述的方法，其中分离基因材料选自由表1中所列的核酸序列或编码与由表1中所列的核酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同的多肽的核酸序列组成的组。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中目标植物或植物细胞分别选自下述的植物或植物细胞的组：
-禾本科，
-稻亚科、早熟禾亚科、黍亚科或虎尾草亚科，
-稻族、小麦族、黍族或高粱族，
-稻属、大麦属、黑麦属、小麦属、小黑麦属、甘蔗属、椮属、高粱属、狼尾草属或玉蜀黍属；以及
-亚洲栽培稻、非洲栽培稻(栽培稻)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)、黑麦(Secale cereale)(裸麦)、普通小麦(面包小麦)、一粒小麦、秀贵甘蔗、大茎野生蔗、竹蔗、细秆甘蔗、甘蔗食穗种、甘蔗属割手密(甘蔗)、穇子、高粱(高粱属)、御谷(稷)、玉蜀黍(玉米)，或其杂交种。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中通过双倍体化、单染色体添加/替换、着丝粒易位和/或同源重组来引入基因材料。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中通过下述方式向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的分离基因材料。
-远缘杂交，
-化学方法，
-显微注入，
-电穿孔，
-粒子加速和/或粒子轰击，
-一种或多种病毒载体或细菌载体，优选地为土壤杆菌属，
-受体介导的机制，
-将基因材料注入到目标植物的生殖器官中，
-原生质体转化，和/或
-注入到目标植物的未成熟胚中。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，还包括下述步骤：
(i)使通过[1]至[5]中任一项所述的方法获得的接种了固氮微生物或未接种的植物的根和/或芽或植物细胞在土壤中生长；
(ii)确定植物根中固氮酶mRNA的表达水平；
(iii)选取具有比亲本栽培植物高的固氮酶mRNA的根结合表达水平的植物；和/或
(iv)通过同位素的基于15N的方法确定通过固氮获得的植物氮水平。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中固氮微生物为细菌，优选地为红环菌科的细菌。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的方法，其中向目标植物或植物细胞中引入分离的基因材料会赋予、增加或改良植物与固氮微生物的根结合，和/或减少植物或植物细胞的施氮需求。
[9]一种多核苷酸，包括[1]或[2]所述的分离基因材料。
[10]一种载体，包括[9]所述的多核苷酸。
[11]根据[10]所述的载体，其中如[2]中所限定的核酸序列与异源控制序列可操作地连接，该异源控制序列能够引导核酸序列在宿主细胞(优选地为植物细胞)中的转录以及优选表达。
[12]一种栽培植物、其植物细胞或种子，包括如[1]或[2]中所限定的基因材料、[9]所述的多核苷酸、[10]或[11]所述的载体，和/或能通过根据[1]至[8]中任一项所述的方法(优选地通过外源地表达基因材料)得到。
[13]长雄野生稻的基因材料在用于赋予、增加或改良植物与固氮微生物的根结合以减少植物的施氮需求和/或提高谷类的氮保持度中的用途。
通过随后的描述、附图和实施例，本发明的其他实施方式将是明显的。
附图说明
图1：聚合酶链反应(PCR)分析的结果，表明在来自长雄野生稻的根样本中检测到固氮细菌，但在芽样本中未检测到。示出了从5个植物获得的典型结果。在生长室中植物种植在来自法国卡马格(Carmague)的未施肥休耕地的土壤中。固氮弧菌属(Azoarcus)物种BH72的基因组DNA用于对植物样品的示踪。
图2：野生和栽培物种的稻的根中nifH转录物(转录，transcript)片段的水平。亚洲栽培稻(Oryza sativa)根显示出显著低于野生稻根(长雄野生稻)的转录水平。在种间杂交种(F1)中，保留了高转录水平(多重t试验与多重比较效果试验(multiple comparison post test)；*，P<0.05)。值为来自至少3次重复的具有SD(标准偏差)的平均值。将来自稻栽培种的所有值与来自野生稻的那些值进行比较。由实时RT-PCR量化NifH转录。使用肌动蛋白基因来标准化nifH表达的量化。
图3：通过与野生稻远缘杂交增加亚洲栽培稻的BNF能力。将15N2示踪物并入到野生稻物种长雄野生稻、F1杂交种、亚洲栽培稻(Oryzasativa)的再生芽中以及与亚洲栽培稻回交。植物种植在气密性人工气候室中，并在0.41±0.15原子％15N过量的顶部空间下生长后，在第2次连续修剪后取样。与经试验的亚洲栽培稻栽培种和回交相比，两种不同的F1杂交种保留了与野生稻类似的高N2增量潜力(单向ANOVA以及Bonferroni多重比较效果试验*，P<0.05)。
具体实施方式
基础植物生化学和生理学提供了更好地理解农作物生产***关于氮(N)供应方面的手段。二氧化碳(CO2)和硝酸根(NO3 -)同化之间的相互作用及它们的动力学对农作物生产是非常重要的。NO3 -的充足供应，其同化为氨基酸(这需要通过光合作用产生的碳化合物)及其用于蛋白质合成的可用性对于新陈代谢是必不可少的。NO3 -的充足供应刺激叶生长和光合作用，前者通过细胞生长和***进行，后者通过光反应的较大含量的成分以及CO2同化和相关过程的那些成分进行。在充足的N的情况下，在植物的完整遗传潜力下，每单位N更多的C同化将增加生物量。如上所述，施氮在农业中广泛使用，以达到充足的N供应，也具有如上所述的负面影响。替选方案将例如通过增加植物细胞或植物中的N同化或利用来表示，这转而将表现出提高的氮含量、改变的氨基酸或蛋白质组成、旺盛的生长特征，增加的营养体产量或更好的种子产量和质量。
根据上述背景，本发明大体上涉及一种增加植物的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率(NUE)和/或非生物胁迫耐受性(优选地为对养分缺乏的耐受性)的方法，包括向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的分离基因材料。
一种用于识别被工程处理成具备这样的改善的农艺性状的这类植物、植物细胞和植物系的方式可以例如在于任意下述参数的检验：1)生长速率，其是根据鲜重或干重的增加速率测量的；2)根据鲜重或干重的成熟植物的营养体产量；3)种子或果实产量；4)种子或果实重量；5)植物的总氮含量；6)果实或种子的总氮含量；7)植物的游离氨基酸含量；8)果实或种子的游离氨基酸含量；9)植物的总蛋白含量；以及10)果实或种子的总蛋白含量。用于检验这些参数的程序和方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
如本文中使用的，术语“增加”是指相比于原生植物[即，未通过引入本发明的基因材料或同等生物分子(即可通过基因材料的表达获得的多核苷酸或多肽)改良的植物，例如种植在相同生长条件下的相同物种的未转化植物]，植物的至少一个参数增加至少约1％、2％、3％、4％、5％，优选地至少约10％、15％、20％，更优选地至少约25％、30％、35％、40％、45％，以及最优选地至少50％、60％、70％或80％。
如上所述，在根据本发明的方法中，所需植物是通过一个或多个上述参数的增加呈现出优于对照植物(即，原植物(祖先植物，progenitorplant))的改善的植物。
一般来说，本发明涉及通过将具有有效利用氮的高能力的长雄野生稻的基因材料引入到目标植物或植物细胞中来生成转基因植物或转基因植物细胞。引入所述基因材料优选地通过赋予、增加或改良植物与固氮微生物的根结合，和/或增加植物或植物细胞的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率、非生物胁迫耐受性和/或优选地为对养分缺乏的耐受性，来减少植物或植物细胞对施氮的需求。另外地或可替选地，在一个实施方式中，基因材料优选地为菌株长雄野生稻Xa21，又称为长雄野生稻IRGC 110404或CRRI 12156-1。
在一个实施方式中，本发明涉及如上限定的方法，其中分离的基因材料选自由在下表1中所列的核酸序列，或编码与由表1中所列核酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同，优选地65％、70％或75％相同，更优选地80％相同，仍更优选地90％相同，以及特别优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽的核酸序列组成的组。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，向目标植物中引入表1中所列的核酸序列中的一种或多种，或编码基本上相同或等同的多肽的多核苷酸。如图2和图3中所示，通过技术如远缘杂交引入一种或多种这些序列会导致根中NifH转录复制数增加以及15N2示踪物进入再生根中的并入增加，表明在改良植物中较高的固氮(图2和图3中的F1杂交种)。
根据本发明的一些实施方式，分离的基因材料包括核酸序列，该核酸序列与表1中所示的核酸序列至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，例如100％相同，并选自由表1中所示的序列组成的组。
当然，待改良的植物不是长雄野生稻物种。在一个优选的实施方式中，待改良的植物为栽培植物，和/或包括表1中所列的序列中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种。在一个实施方式中，对象植物包括野生型物种的一个或多个染色体或其一个或多个部分，优选地包括表1中所示的序列中的一种或多种。
在一个实施方式中，本发明涉及如上限定的方法，其中目标植物或植物细胞分别选自下述的植物或植物细胞的组：
-禾本科，
-优选地为稻亚科、早熟禾亚科、黍亚科或虎尾草亚科，
-更优选地为稻族、小麦族、黍族或高粱族，
-仍更优选地为稻属、大麦属、黑麦属、小麦属、小黑麦属、甘蔗属、椮属、高粱属、狼尾草属或玉蜀黍属；以及
-特别优选地为亚洲栽培稻、非洲栽培稻(栽培稻)、大麦(大麦)、黑麦(裸麦)、普通小麦(面包小麦)、一粒小麦、秀贵甘蔗、新几内亚野生蔗、中国竹蔗、细秆甘蔗、甘蔗食穗种、甘蔗属割手密(甘蔗)、穇子、高粱(高粱属)、御谷(小米)、玉蜀黍(玉米)，或其杂交种，其优选地具有上述种、属、族、亚科或科的至少一种亲本。优选地，目标植物或植物细胞选自亚洲栽培稻、非洲栽培稻或其杂交种。
如上限定的基因材料可以以若干形式通过本领域已知的许多方法引入到目标细胞或植物中。在一个实施方式中，本发明涉及如上限定的方法，其中基因材料通过双倍体化、单染色体添加/替换、着丝粒易位和/或同源重组引入。这些技术是本领域中熟知的；参见例如Cox等人，PlantSciences(植物科学)21(2002)，59-61的评论性综述以及其中引用的参考文献。此外，构建和转染人工染色体(染色体添加)的方法是本领域中熟知的，并且在例如Houben A.，The Plant Cell(植物细胞)，January20(2008)，8-10以及Phan等人,Transgenic Res.(转基因研究)，16(2007)，341-51中评论或描述。染色体替换描述在例如Wan等人，Theor ApplGenet(理论与应用遗传学)110(2004)，71-79以及Yano M，Curr Opin PlantBiol(植物生物学新见)4(2001)，130-135中。
在已经制备包括如上限定的基因材料的适当构建体后，可使用本领域中熟知的转化方法来生成感兴趣的转基因植物。一般而言，根据本发明的构建体可以是包括或基本由如上述限定的基因材料(例如，质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或染色体)组成的多核苷酸。可以使用各种转化方法将外源性核酸分子引入到单子叶植物中用于异位表达，该转化方法包括农杆菌介导的转化(Hiei等人，The Plant Journal(植物杂志)，6(1994年)，271-282)和直接基因转移法，如电穿孔和微粒介导的转化(一般参见Wang等人(编辑)，Transformation of Plants and SoilMicroorganisms(植物转化和土壤微生物)，Cambridge,UK:UniversityPress(英国剑桥大学出版社)，1995，其通过引用并入到本文中)。
基于土壤细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化方法对于将外源性核酸分子引入到种子植物中是特别有用的。野生形式的农杆菌含有引导在宿主植物上产生致瘤冠瘿生长的Ti(肿瘤诱发)质粒。向植物基因组转移Ti质粒的肿瘤诱发T-DNA区需要Ti质粒编码的致病基因以及T-DNA边界，该边界是一组界定待转移区域的直接DNA重复序列。基于农杆菌的载体为Ti质粒的修饰形式，其中肿瘤诱发功能由待引入到普通宿主中的感兴趣核酸序列代替。
农杆菌介导的转化一般采用共整合载体或优选地双元载体***，其中Ti质粒的组分被分为永久存在于农杆菌宿主中并携带致病基因的辅助载体，和含有如上限定的特定基因材料如以T-DNA序列为边界的感兴趣分离基因的穿梭载体。各种双元载体在本领域中是熟知的，并且可以在市场上获得，例如，从Clontech公司(加利福尼亚帕罗奥图(Palo Alto))购买。例如，共培养农杆菌与培养植物细胞或损伤组织如根外植体、下胚轴(hypocotyledon)、茎段或块茎的方法也是本领域中熟知的(Glick和Thompson，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(植物分子生物学与生物技术中的方法)，CRC Press，Boca Raton,Fla.(佛罗里达州波卡拉顿)，pp 179-20519，1993)。当在适当的条件下培养时，植物组织中经农杆菌感染的损伤细胞可重新发育成器官；所产生的转基因芽最终生成包括如上所限定的基因材料和/或在其中由其处异位地表达例如多核苷酸和/或多肽/蛋白质的转基因植物。农杆菌还可以用于完整种子的转化，如在Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris.Life Sci.(法国科学院报告，巴黎，生命科学)314(1993),1194-1199，(其通过引用并入到本申请中)中所描述的。农杆菌介导的转化对于产生多种转基因种子植物是有用的(Wang等人，同上，1995年)。Methods Mol Biol.(分子生物学方法)，2012；847:51-7。doi：10.1007/978-1-61779-558-9_5。
Ozawa在Methods Mol Biol.847(2012)，51-57中描述了若干种稻(亚洲栽培稻优良粳稻(L.elite japonica))和许多籼稻变种的高效农杆菌介导的转化***。
微粒介导的转化也可用于产生包括和/或异位地表达如上限定的基因材料的转基因植物。该方法最初由Klein等人(Nature 327(1987)，70-73)(其通过引用并入本申请中)描述，该方法依靠微粒，如通过用氯化钙、亚精胺或PEG沉淀用所需核酸分子包覆的金或钨。使用设备如BIOLISTIC PD-1000(Biorad，Hercules，加利福尼亚)使微粒以高速加速进入到植物组织中。
微粒介导的递送，也称为“粒子加速”和“粒子轰击”，对于转化使用其他方法难以转化或再生的植物尤其有用。微粒介导的转化已用于例如生成多种转基因植物种，包括棉花、烟草、玉米、杂交杨树和木瓜(参见Glick和Thompson，同上，1993年)，以及禾谷类作物，如小麦、燕麦、大麦、高粱和稻(Duan等人，Nature Biotech.，14:494-498，1996；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.(生物技术当前述评)，5:158-162，1994；均通过引用并入到本文中)。鉴于上述内容，本领域技术人员将认识到如本文中公开的农杆菌介导的或微粒介导的转化或本领域中已知的其他方法可以用于产生本发明的转基因种子植物。
本发明中有用的替选基因转移和转化方法包括但不限于脂质体(Caboche M.，Physiol.Plant.(植物生理学)，79(1990)，173-176)；电穿孔(Riggs等人(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，83:5602-5606)；化学介导的方法(Zatloukal等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院纪事)，660(1992)，136-153)；磷酸钙共沉淀技术；微量注入或巨量注入(Crossway等人(1986)，Biotechniques，4:320-334)；直接DNA转化，并且可以涉及Ti质粒、Ri质粒或植物病毒载体；受体介导的机制(Curiel等人，Hum.Gen.Ther.，3(2):147-154，1992；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992)，基因材料注入到目标植物的生殖器官中(Zhou等人，Methods in Enzymology(酶学方法)，101:433，1983；Hess，Intern Rev.Cytol.(细胞学国际评论)，107:367，1987；Luo等人，Plant Mol.Biol.Reporter(植物分子生物学导报)，6:165，1988；Pena等人，Nature，325:274，1987)；原生质体转化(美国专利号：5508184)；注入到目标植物的未成熟胚中(Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(理论与应用遗传学)，75(1987)，30-36)以及远缘杂交(Kumari等人，Annuals of the Sri Lanka Department of Agriculture(斯里兰卡农业部年报)7(2005)，157-164)。这些以及另外的植物转化方法对本领域技术人员来说是已知的，上述参考文献仅为示例性的。在专利申请US 2010/0275332 A1第16-17页第[0129-0145]段的“转化”部分中也详细地描述了这样的方法，将其全部公开内容通过引用并入到本文中。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中通过以下方式向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的基因材料：
-远缘杂交，
-化学方法，
-显微注入，
-电穿孔，
-粒子加速和/或粒子轰击，
-一种或多种病毒载体或细菌载体，优选地为土壤杆菌属，
-受体介导的机制，
-将基因材料注入到目标植物的生殖器官中，
-细胞质融合
-原生质体转化，和/或
-注入到目标植物的未成熟胚中。
使用直接基因转移或农杆菌介导的转移形式的方法通常但并不一定是用可提供对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)或除草剂(例如草丁膦)的抗性的可选标记物来进行。然而，对用于植物转化的可选标记物的选择对本发明并不是至关重要的。
对某些植物种而言，不同的抗生素或除草剂选择标记物可能是优选的。转化中常规使用的选择标记物包括赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性的nptII基因(Messing和Vierra，Gene，19:259-268(1982)；Bevan等人，Nature，304:184-187(1983))、赋予对除草剂草丁膦的抗性的bar基因(White等人，Nucl Acids Res(核酸研究)，18:1062(1990)，Spencer等人，Theor Appl Genet，79:625-631(1990))、赋予对抗生素潮霉素的抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol，4:2929-2931)，以及赋予对氨甲蝶呤的抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2:1099-1104(1983))。
如上文中所限定的基因材料可以是分离的，和/或以若干形式(例如以多核苷酸的形式)引入到植物和/或植物细胞中。本发明的多核苷酸可以包括或基本由如上文中所限定的基因材料组成。该基因材料可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成生产的DNA或RNA或单独地或组合地包括那些多核苷酸中任一种的重组产生的嵌合核酸分子。因此，在一个实施方式中，本发明涉及包括本发明的分离基因材料或如上文中所限定的至少一种核酸序列的多核苷酸，即，所述至少一种核酸序列选自由下面的表1中所列的核酸序列或编码与由表1中所列的核酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同，优选地65％、70％或75％相同，更优选地80％相同，仍更优选地90％相同，以及特别优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽的核酸序列组成的组。
此外，在优选的实施方式中，本发明还涉及包括如上所限定的多核苷酸的载体。优选地，本发明的多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，从而允许在原核细胞或真核细胞中的表达。相应地，在一个实施方式中，提供了如上文中所限定的载体，其中表1中所列的核酸序列或编码与由表1中所列的核酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同的多肽的核酸序列可操作地连接至异源控制序列，该异源控制序列能够引导核酸序列在宿主细胞(优选地为植物细胞)中的转录以及优选表达。
所述多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录到可翻译的mRNA中。确保在真核细胞(优选哺乳动物细胞)中的表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。它们通常包括确保转录起始的调控序列以及可选地确保转录终止和转录稳定的多聚腺苷酸(poly-A)信号。其他调控元件可以包括转录和翻译增强子，和/或天然关联的(结合的)或异源的启动子区。
对于在植物中的表达，必须为受体表达盒和目标表达盒选择适合的启动子。除非另有特别说明，否则下文所讨论的启动子可以用于引导在受体多肽或目标多肽的植物中的表达。这些启动子包括但不限于：组成型启动子、诱导型启动子、时间调控(temporally regulated)启动子、发育调控启动子、化学调控启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。
优选的组成型启动子包括但不限于CaMV 35S和19S启动子(美国专利号：5,352,605)。其他优选的启动子包括但不限于已知在大多数细胞类型中表达的若干肌动蛋白基因中的一种。McElroy等人，Mol.Gen.Genet.231(1991)，150-160中描述的启动子可容易地并入到本发明的受体表达盒中，并且特别适合用于单子叶植物宿主中。此外另一优选的组成型启动子来源于泛素，其是已知在许多细胞类型中累积的另一种基因产物。已从若干物种中克隆泛素启动子，用于转基因植物(例如，向日葵-Binet等人，Plant Science(植物科学)，79(1991)，87-94；玉米-Christensen等人，Plant Molec.Biol.(植物分子生物学)，12(1989)，619-632)。已在转基因单子叶植物***中开发出玉米泛素启动子，并且在专利公开号EP 0 342 926中公开了构建用于单子叶植物转化的玉米泛素启动子的序列和载体。本发明中泛素启动子适合用于转基因植物，尤其是单子叶植物。其他有用的启动子是来自玉米的U2和U5 snRNA启动子(Brown等人，Nucleic Acids Res.17:8991(1989))和来自乙醇脱氢酶的启动子(Dennis等人，Nucleic Acids Res.12:3983(1984))。
本发明中用于植物特别是玉米的组织特异性或组织优选启动子是引导在根、髓心(pith)、叶或花粉中的表达的那些启动子。美国专利号5,625,136公开了这样的启动子，将该专利的全部内容通过引用并入到本发明中。有用的还有赋予种子特异性表达的启动子，如Schernthaner等人,EMBO J.,7(1988)1249-1255中公开的那些；在美国专利号5477002中公开的花药特异性启动子ant32和ant43D，将该专利的全部内容通过引用并入到本文中；花药(绒毡层)特异性启动子B6(Huffman等人,J.Cell.Biochem.17B：摘要#D209(1993))；雌蕊特异性启动子，如修饰的S13启动子(Dzelkalns等人,Plant Cell，5(1993)，855)。
可用于本发明的还有化学诱导的启动子。该类别中用于引导植物中受体多肽或目标多肽的表达的特定启动子公开在例如美国专利号5,614,395中，将该专利的全部内容通过引用并入到本发明中。
受体表达盒或目标表达盒的5′调控区还可包括其他增强序列。已发现许多序列能增强转基因植物中的基因表达。例如，已知来源于病毒的许多非翻译前导序列能增强表达。具体地，来自烟草花叶病毒(TMV，“Ω序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示出能有效增强表达(例如，Gallie等人，Nucl.Acids Res.,15(1987)，8693-8711；Skuzeski等人，Plant Molec.Biol.,15(1990)，65-79)。
多种内含子序列已显示出当添加到特别是单子叶植物细胞中的5′调控区中时能增强表达。例如，已发现玉米Adh1基因的内含子在被引入到玉米细胞中时能显著增强其同源启动子(cognate promoter)下的野生型基因的表达(Callis等人，Genes Develop.,1(1987)，1183-1200)。
除了启动子之外，多种3′转录终止子也可用于本发明中。转录终止子负责终止转录和校正mRNA聚腺苷酸化。适当的转录终止子以及已知在植物中起作用的那些终止子包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子和本领域中已知的其他终止子。这些终止子可用于单子叶植物和双子叶植物中。
除了将上述元件中的一个或多个并入到目标表达盒的5′调控区中之外，还可并入目标表达盒特有的其他元件。这样的元件包括但不限于最小启动子。通过最小启动子，预期在没有上游激活的情况下，基本启动子元件是无活性的或近似无活性的。当没有反式激活因子存在时或当不存在增强子或反应元件结合位点时，这样的启动子在植物中具有低背景活性。对于植物中的目标基因特别有用的一种最小启动子是从玉米的bronzel基因中获得的Bz1最小启动子。
本发明的量化方法的另一优势在于可用于选择具有低人工施氮要求的植物。相应地，在一个实施方式中，本发明还涉及如上文中所限定的本发明的方法，该方法还包括下述步骤：
-将接种了固氮微生物或未接种的植物的根和/或芽或植物细胞种入土壤中；
-确定一个或多个植物根中的固氮酶mRNA的表达水平；
-选取具有比亲本栽培植物高的固氮酶mRNA根结合表达水平的植物；和/或
-通过同位素的基于15N的方法来确定通过固氮得到的植物氮的水平。
如上所述，能对大气氮(N2，在下文描述中也简称为N)进行生物固定的并非植物本身；只有原核微生物包括固氮酶，即生物固氮所需的酶复合物。因此，设想了通过本发明的方法来改良和优选地增加植物的根结合，其中已与这种生物共生有机体(biosymbiontic organism)一起引入如上文中所限定的基因材料。
在希望不受理论约束的情况下，在本发明范围内进行的实验表明，长雄野生稻特别能支持能够进行生物固氮的根结合微生物，由此长雄野生稻表现出了高的有效利用氮(NUE)的能力。发明人还发现可以将来自长雄野生稻的基因材料转移至其他物种，优选地转移至亚洲栽培稻，以赋予、增强或以其他方式改良其他物种的这种植物保持根结合固氮微生物的能力，以及利用由这种根结合微生物提供的氮的能力。该发现是特别出人意料的，因为很明显的是不能将固氮微生物从豆科植物转移至其他物种的那些植物并使固氮微生物保持向其他物种提供生物固氮的稳定结合。此外，惊讶地发现仅通过将长雄野生稻的基因材料转移至其他物种，就可以建立固氮微生物与该植物的稳定结合，而无需对固氮微生物本身进行基因修饰。
根据本发明，植物与固氮微生物的根结合是指一种或多种种类的固氮微生物移生于植物的根内部或根瘤或其他组织，使得在植物接种了一种或多种所述微生物且所述植物在未进一步添加一种或多种所述微生物的情况下生长至少1个月后，仍可以在植物组织中检测到一种或多种所述微生物的活细胞。优选地，一种或多种固氮微生物为内生植物的。
相应地，在一个实施方式中，本发明涉及如上文中所限定的本发明的方法，其中向目标植物或植物细胞中引入分离基因材料可赋予、增加或改良植物与至少一种固氮微生物的根结合，和/或减少植物或植物细胞的施氮需求。在该方面，在一个实施方式中，一种或多种固氮微生物为固氮生物，优选地为(固氮)细菌，更优选地为红环菌科，仍更优选地为固氮弓菌属、固氮螺菌属、固氮弧菌属或固氮捲菌属(Azonexus)，以及最优选地为固氮弓菌属。优选地，这种微生物的特征还在于带有本领域已知的用于固氮的基因，如ninHDK、anfHDK和/或vnfHDK。
长雄野生稻属于稻类植物组，并且传统地通过其具有24条染色体的AA基因组分型来识别(参考Liakat等人，Rice，2010(3)：218-234)。物种长雄野生稻并且特别地菌株Xa21，此前仅因其对白叶枯病和细菌性条斑病及其他害虫和病原体的抗性而引起了注意。更惊讶的是这种深入分析的物种包括一种至今都被忽视但却很重要的生理特性，即保持与固氮微生物的稳定根结合，并且这种特性可以转移至其他物种的植物。特别地，发明人已发现甚至在没有用固氮微生物接种的情况下，长雄野生稻仍具有每年每公顷80kg的N(推测)的进入植物生物量的生物固氮的高的已证明的输入。此外，发明人发现，通过亚洲栽培稻×长雄野生稻的远缘杂交获得的F1代植物可以获得与长雄野生稻类似的固氮量，而亚洲栽培稻栽培种表现出显著较低的氮输入，如通过15N摄取测量的。
此外，在一个实施方式中，本发明的方法优选地包括下述步骤：将根据前述权利要求中任一项获得的植物与目标植物种的野生型植物杂交繁育。优选地，这通过将长雄野生稻×目标物种的F1代的植物与目标物种的野生型回交实现。优选地，甚至在F2代中，可以维持固氮微生物与F2代的植物根的稳定结合。这是特别有利的，因为远缘杂交的F1后代是不育的，并且可以包括所需转基因植物或植物细胞不需要的长雄野生稻的性状。
此外，发明人观察到很难量化植物中的生物固氮。为了筛选优选地通过远缘杂交进行的本发明的氮转移的结果，因此提供用于快速分析与固氮相关的生化性状的方法是有利的。
因此，在一个实施方式中，本发明还涉及一种用于量化植物根中固氮酶基因表达的方法，包括下述步骤：
(i)提取包括固氮微生物的植物芽根的mRNA，
(ii)通过标准化下述各项来量化固氮酶mRNA
a)植物核糖体RNA水平，优选地为肌动蛋白水平，
b)体外扩增的和定量的固氮酶mRNA水平。
本发明所述方法的特别优势在于，其允许在一天内量化固氮酶的表达，而通过15N摄取量化需要将植物栽培约两个月。因此，本发明的分析方法允许根据通过本发明的转移方法获得的后代的预期固氮和摄取率快速表征所述后代。
此外，在一个实施方式中，本发明还涉及一种包括如上文中所限定的基因材料、多核苷酸和载体和/或能通过如本文中所描述的方法(优选地通过外源地表达基因材料)获得的栽培植物、其植物细胞或种子。
本发明还涉及长雄野生稻的基因材料用于赋予、增加或改良植物与固氮微生物的根结合以减少植物的施氮需求和/或提高谷类的氮保持度的用途。
对固氮酶mRNA表达水平的取得优选地通过RT-PCR用nifH特异性引物来执行，并且使用定量的实时RT-PCR进行量化。RNA提取和引物对(引物集，prime set)此前已有描述(T.Hurek、L.L.Handley、B.Reinhold-Hurek和Y.Piché,MPMI(分子植物与微生物相互作用)15，233(2002)，以及Burbano、C.S.、Y.Liu、K.L.V.M.Reis、J.Caballero-Mellado、B.Reinhold-Hurek、T.Hurek.Microbiol.Rep.(微生物学通报)，3，383(2011)，为了描述nifH转录水平的确定，两份文件均通过引用并入到本文中。
定义和实施方式：
需要注意的是，术语“一个”或“一种”实体指的是一种或多种该实体；例如，“一种植物细胞”理解为代表一种或多种植物细胞。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。
栽培种和栽培植物分别是***的栽培植物组，栽培植物组的特征非常明显、统一且稳定，而且当通过适当手段繁殖时，会保留这些特征。栽培种组是基于一种或多种标准的一组恰当命名的栽培种。栽培植物是其起源或选择主要归因于人类的目的性活动的植物。这种植物可通过栽培种的有意或在栽培中无意杂交，或者通过从现有栽培原种中选择而产生，或这种植物可以是来自野生种群中的少数变体的选择，并且仅通过有意的连续繁殖即可维持为可辨认的实体，参见例如Trehane等人，Int.code of nomenclature of cultivated plants(国际栽培植物命名法规)，Regnum Veg.133(1995)1-175。
因此，虽然长雄野生稻可以被视为野生型非栽培植物，而亚洲栽培稻和优质稻变种如粳稻被视为栽培植物。如前所述，待根据本发明改良的植物为栽培植物。
多肽：
如本文中所用的，术语“多肽”意为包含单数的“一种多肽”和复数的“多肽”，并且是指由酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两种或多种氨基酸的任一条链或多条链，并不指产物的具体长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两种或多种氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语均包含在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用这些术语中的任一个替代或互换使用。
术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化，溶蛋白性裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可来源于自然生物源或可通过重组技术产生，但并不一定是由指定的核酸序列翻译的。可以以任何方式包括通过化学合成来生成多肽。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意为不处于自然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可从其原生或自然环境中移出。为了本发明，重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白质被视为是分离的，如与通过任何适合的技术分离、分开(分馏，fractionated)或部分地或大体上纯化的原生或重组多肽一样。
“重组肽、多肽或蛋白质”是指通过重组DNA技术产生的(即由通过编码包括所需肽的融合蛋白的外源性重组DNA表达构建体转化的细胞、微生物或植物细胞产生的)肽、多肽或蛋白质。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽通常将不含聚糖。在酵母中表达的蛋白质或多肽可具有与在哺乳动物细胞中表达的不同的糖基化模式。
还包括作为本发明的多肽的是前述多肽的片段、衍生物、类似物和变体以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与天然肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够相似”是指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够或最低数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，本文中将包括有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列定义为足够相似。优选地，变体将与本发明的优选多肽的氨基酸序列足够相似。这样的变体一般保持了本发明的多肽的功能活性。变体包括通过一种或多种氨基酸缺失、添加和/或替换而在氨基酸序列方面分别与原生和wt多肽不同的肽。这些变体可以是天然存在的变体和人工设计的变体。
分子的相似性和/或同一性的确定
通过比较一种多肽的氨基酸序列与第二种多肽的序列来确定两种多肽之间的“相似性”。如果是相同或保守氨基酸替换，则一种多肽的氨基酸与第二种多肽的对应氨基酸相似。保守替换包括在Dayhoff,M.O.，ed.,，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5(蛋白质序列和结构图册5)，National Biomedical Research Foundation(国家生物医学研究基金会)，Washington,D.C.(1978)中和Argos，EMBO J.8(1989)，779-785中描述的那些。例如，属于下述组中的一种的氨基酸表示保守改变或替换：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；以及-Asp、Glu。对于核酸如RNA和DNA，两种分子之间的相似性或同一性主要只需通过区分两种序列之间的匹配(其中两种残基相同)和错配来确定。
优选地，使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法来完成两种序列之间的百分比同一性或相似性的确定。将这样的算法并入到可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)上获得的Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中。
使用BLASTn和BLASTp程序的标准参数来执行百分比同一性或相似性的确定。
使用BLASTn程序来执行BLAST多核苷酸搜索。对于一般参数，“最大目标序列”框可设置为100，可勾选“短查询串”框，“期望阈值”框可设置为10，并且“字体大小”框可设置为28。对于评分参数，“匹配/错配得分”可设置为1、-2，并且“空位罚分”框可设置为线性。对于过滤和掩码参数，“低复杂度区域”框可不勾选，“物种特异性重复序列”框可不勾选，“仅用于查找表的掩码”框可勾选，并且“掩码小写字体”框可不勾选。
使用BLASTp程序来执行BLAST蛋白质搜索。对于一般参数，“最大目标序列”框可设置为100，“短查询串”框可勾选，“期望阈值”框可设置为10，并且“字体大小”框可设置为“3”。对于评分参数，“矩阵(Matrix)”框可设置为“BLOSUM62”，“空位罚分”框可设置为“存在：11延伸：1”，“构成调整”框可设置为“条件构成得分矩阵调整”。对于过滤和掩码参数，“低复杂度区域”框可不勾选，“仅用于查找表的掩码”框可不勾选，并且“掩码小写字体”可不勾选。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在包含单数的核酸和复数的核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指在多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其原生环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在溶液中(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文中所用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但其仍可以被视为编码区的一部分，但任何旁侧序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，存在于单个载体上，或存在于单独的多核苷酸构建体中，例如，存在于单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包括两个或多个编码区，例如，单个载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，该异源编码区融合或不融合至编码例如来自如上文中所限定的分离基因材料的基因、或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于：特化元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括与一个或多个编码区可操作地关联的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作关联是此时基因产物(例如多肽)的编码区与一个或多个调控序列关联，以使得基因产物的表达受到一个或多个调控序列的影响或控制。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段(如多肽编码区和与其关联的启动子)之间的连接性质并不干扰表达调控序列引导基因产物的表达或干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段是“可操作地关联的”或“可操作地连接的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区将与该核酸可操作性地关联。启动子可以是仅在预定的细胞中引导大量DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号也可以与多核苷酸可操作地关联，以引导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。
杂交过程
当选择的物种是雌雄异体的或自交不亲和的，具有短幼龄期，并且服从分别用于根尖和胚珠的细胞遗传学和胚胎学分析的高效程序时，会促进杂交和双倍体化过程。如果植物不是雌雄异体的或自交不亲和的，则需要使用雄性不育系或去雄程序。在光周期反应和雌性发育量表中显示出适当分化程度的有性变种或品系之间会产生杂交种。
使用如植物育种文章(例如，Poehlman，Breeding Field Crops(大田作物育种)(1987))教导的标准技术进行种内杂交。成功产生种间或属间杂交种可能需要如在涉及远缘杂交的最近参考文献(例如Z.W.Liu等人,Hybrids and Backcross Progenies between Wheat(Triticum aestivumL.)and Apomict Australian Wheatgrass[Elymus rectisetus(Nees in Lehm.)A.Love&Connor]:Karyotypic and Genomic Analyses(小麦和无融合生殖澳大利亚麦草[披碱草(Nees in Lehm.)A.Love&Connor]之间的杂交种和回交子代),89Theor.Appl.Genet.599-605(1994)(通过引用并入本文中))中教导的对小花进行激素处理以及胚胎拯救程序。通过杂交种中间表型来验证该杂交种。
双倍体化过程
使用标准秋水仙素技术(例如J.Torabinejad等人,Morphology andGenome Analyses of Interspecific Hybrids of Elymus scabrus(Elymusscabrus种间杂交种的形态分析和基因组分析),Genome 29(1987),150-155(通过引用并入本文中))使杂交种的染色体数目翻倍。可替换地，可以使用最近研发的组织培养技术，如例如在Leblanc等人，Chromosome Doubling in Tripsacum:the Production of Artificial,SexualTetraploid Plants(摩擦禾属中染色体加倍：人工有性四倍体植物的产生),Plant Breed.114(1995),226-30(通过引用并入本文中)；Salon和Earle,Determination of Mode of Reproduction of Synthetic Tetraploids of EasternGamagrass(鸭茅状摩擦禾合成四倍体繁殖方式的确定),Agron.Abs.Pg114(1994)(通过引用并入本文中)；Cohen和Yao,In Vitro ChromosomeDoubling of Nine Zantedeschia Cultivars(九种马蹄莲属栽培种的体外染色体加倍),Plant Cell,Tiss.Org.Cult.47(1996),43-49(通过引用并入本文中)；以及Chalak和Legave,Oryzalin Combined with AdventitiousRegeneration for an Efficient Chromosome Doubling of Trihaploid Kiwifruit(黄草消结合偶生再生使三倍体奇异果染色体有效加倍),Plant Cell Rep.16(1996),97-100(通过引用并入本文中)中所描述的。当使种间F1回交时，通常以低的频率(0.5％至3％)产生部分双倍体2n+n Bnr杂交种，例如Z.W.Liu等人，Theor.Appl.Genet.89(1994),599-605，并且如果在上述杂交种中存在单性生殖(不降低的卵子形成)的倾向，则该频率可能高得多，如在O.Leblanc等人，Reproductive Behavior in MaizeTripsacum Polyhaploid Plants:Implications for the Transfer of Apomixis intoMaize(玉米摩擦禾属多元单倍体植物的繁殖行为：单性生殖转移入玉米的启示),J.Hered.87(1996),108-111(通过引用并入本文中)所教导的。因此，一种用于使种内ic和种间ic杂交种的染色体加倍的优选方法是使用一种或多种上述秋水仙素(或其他已知的纺锤体抑制剂化学品)处理方法。同样，一种用于使种间杂交种的染色体加倍的优选方法涉及与有性亲本之一回交，并计数根尖中的染色体，以确定部分双倍体性(通常为三倍体性)。
在这之后，与另一亲本回交，以获得完整的双倍体，或与同一亲本回交，以获得部分双倍体性(三个基因组来自一个亲本，并且一个基因组来自另一个亲本)。双倍体化可以在杂交之前或之后进行。
如本文中所用的，词组“植物产量”是指每株植物或每个生长季节产生的组织或器官的量(例如，如由重量或大小确定的)或数量(数目)。因此，增加的产量会影响在一定种植面积和/或种植时间内可从植物中获得的经济效益。
应注意的是，植物产量会受到各种参数的影响，包括但不限于：植物生物量；植物活力；生长速率；种子产量；种子或籽粒数量；种子或籽粒质量；油产量；收割的器官(例如，植物的种子或茎叶部分)中的油含量、淀粉含量和/或蛋白质含量；每穗的花(小花)的数量(表示为饱满种子的数量与主穗数目的比率)；收成指数；单位面积种植的植物的数目；每株植物和单位面积内收割器官的数目和大小；单位种植面积内植物的数目(密度)；大田中收割器官的数目；总叶面积；碳同化和碳分配(植物中碳的分布/分配)；耐阴性；可收割器官(例如，种子)的数目；每荚(pod)种子；每粒种子重量；以及改良的结构[诸如，增加茎直径、厚度，或改善物理特性(例如，弹性)]。如上所述，在一个实施方式中，本发明的方法引起选自上述清单的参数组中的至少一组的增加，所述参数组包括植物的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率和/或非生物胁迫耐受性，优选地为对养分缺乏的耐受性。
如本文中所使用的，词组“种子产量”是指每株植物的种子、每荚或单位种植面积内的种子的数目或重量，或单粒种子的重量，或每粒种子提取的油。因此，种子产量会受到种子尺寸(例如，长、宽、周长、面积和/或体积)、(饱满)种子的数目和种子灌浆速率以及种子含油量的影响。因此，增加每株植物的种子产量会影响在一定种植面积和/或种植时间内从植物中获得的经济效益；并且可以通过增加每株植物的种子产量和/或通过增加同一给定面积内种植的植物数目来实现单位种植面积内种子产量的增加。因此，对于上述内容，另外或可替选地，在一个实施方式中，本发明的方法引起关于选自上述清单的种子或籽粒的参数组中的至少一组的增加，所述参数组包括植物种子或籽粒的产量和/或质量，优选地为每株植物的种子/籽粒、每荚或单位种植面积的种子/籽粒的数目或重量，或单粒种子/籽粒的重量，或每粒种子/籽粒提取的油的量和/或质量。
如本文中所用的术语“种子”(也称为“籽粒”或“核(子粒，kernel)”)是指包裹在称为种皮(通常带有一些储藏食物)的覆盖物里的小胚植物，即在施肥并在母本植物中经过一段时间的生长之后出现的裸子植物和被子植物的成熟胚珠的产物。
如本文中所用的，词组“植物生物量”是指由在生长季节的植物产生的组织的量(例如，以风干组织的克数g测量的)，其也可以确定或影响植物产量或单位种植面积的产量。植物生物量的增加可以是整株植物或植物的部分的增加，诸如地上(可收割)部分、植被生物量、根和种子。
如本文中所用的，词组“生长速率”是指单位时间内植物器官/组织大小的增加(测量单位可为cm2/天)。
如本文中所用的，词组“植物活力”是指在给定时间内由植物产生的组织的量(以重量测量)。因此，增加的活力可决定或影响植物产量或单位种植时间或种植面积内的产量。另外，早期活力(种子和/或幼苗)造成改善的大田群体(农用地，field stand)。
提高早期活力是现代育种计划在温度和热带稻栽培种方面的重要目标。长根对于水中播种的稻进行适当土壤锚固是重要的。在稻直接播种到淹地中的情况下，并且在植物必须从水面快速出苗的情况下，较长的根与活力有关。在实践条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好的幼苗出苗是重要的。将早期活力设计进入植物的能力在农业中是非常重要的。例如，不良的早期活力已限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mays L.)杂交种在欧洲大西洋部的引入。
如本文中所用的，词组“非胁迫条件”是指未显著超出植物可能遭遇的并允许植物在其生命周期(例如，农作物植物从种子到成熟植物再回到种子)的任意阶段最佳生长、新陈代谢、繁殖和/或生存的日常气候条件和其他非生物条件的生长条件(例如，水、温度、光暗循环、湿度、盐浓度、土壤中的肥料浓度、养分供给，如氮、磷和/或钾)。本领域技术人员知道用于给定地理位置中的给定植物的正常土壤条件和气候条件。应注意的是，虽然非胁迫条件可以包括不同于最佳条件的一些野生条件(植物的一种类型/物种不同于另一种的)，但是在没有恢复生长的能力的情况下，这样的不同不会造成植物停止生长。
如本文中所用的词组“非生物胁迫”是指对植物的新陈代谢、生长、繁殖和/或生存的任何不利影响。相应地，非生物胁迫可以由次最佳环境生长条件(如例如，盐度、水剥夺、淹水、冻害、低温或高温、重金属毒性、乏氧生活、养分缺乏、大气污染或UV照射)诱导。
如本文中所用的词组“非生物胁迫耐受性”是指在不遭受新陈代谢、生长、生产率和/或生存能力的实质改变的情况下植物忍受非生物胁迫的能力。
如本文中所用的词组“肥料利用效率”是指导致每施肥单位内植物的产量、生物量、活力和生长速率增加的一种或多种代谢过程。该代谢过程可以是被植物吸收的矿物和有机部分(如氮、磷和/或钾，然而优选是指氮)中的一种或多种的摄取、扩散、吸收、积累、迁移(植物内)以及使用。
如本文中所用的词组“氮利用效率(NUE)”是指导致每施氮单位内植物产量、生物量、活力、非生物胁迫耐受性、生长速率、来源于生物固氮的氮增量和/或优选地对植物的养分缺乏的耐受性增加的一种或多种代谢过程。该代谢过程可以是被植物吸收的氮的摄取/来源于生物固氮的增加的氮增量、扩散、吸收、积累、迁移(植物内)和/或使用。
如本文中所用的词组“氮限制条件”是指包括低于正常植物新陈代谢、生长、繁殖和/或生存所需水平的施氮(例如，氨或硝酸盐)的水平(例如，浓度)的生长条件。
改善的植物NUE在大田中体现为实施更少的肥料的同时收割相似数量的产量，或通过实施相同水平的肥料得到增加的产量。因此，提高的NUE对大田中植物产量具有直接影响。因此，本发明的一些实施方式的多核苷酸和多肽会积极影响植物产量、种子产量和/或植物生物量。另外，提高的植物NUE的益处肯定会改善农作物质量和种子的生化组成，诸如蛋白质产量和油产量。
应注意的是，改善的非生物胁迫耐受性还将在非胁迫条件下为植物赋予提高的活力，从而导致具有提高的生物量和/或产量的农作物，例如，用于棉花产业的细长纤维，较高的油含量。
术语“分离的”是指至少部分地从自然环境中(例如，从植物细胞中)分离的实体，如多核苷酸、多肽、基因等。
本发明的说明书和实施例公开并涵盖这些和其他实施方式。可使用例如电子装置在公共图书馆和数据库中检索有关根据本发明待采用的材料、方法、用途和化合物中的任一种的其他文献。例如，可利用公共数据库“Medline(医学文献分析和检索***)”，该数据库由国立卫生研究院的国家生物技术信息中心和/或国家医学图书馆主办。其他数据库和网址，如作为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(EBI)的那些数据库和网址是本领域技术人员已知的，并且还可以使用网络搜索引擎获得。在Berks，TIBTECH，12(1994)，352-364中给出了用于回溯检索和用于近期通报的生物技术的专利信息综述和专利信息的相关来源概览。
上述公开内容大体上描述了本发明。除非另有说明，否则如本文所用的术语给出如在牛津生物化学与分子生物学词典(牛津大学出版社，1997年，2000年修订，2003年再版，ISBN 0 19 850673 2)中提供的定义。在整个本说明书中引用了若干文献。可在权利要求之前的说明书末尾查看完整的文献引文。所有引用的参考文献(包括如在本申请书全文引用的参考文献书目、已发布专利、已公布专利申请和制造商的说明书和使用说明等)的内容通过引用清楚地并入到本文中；然而，并非承认所引用的任何文献实际是关于本发明的现有技术。
通过参考下述具体实施例可获得更全面的理解，本文提供的实施例仅用于说明的目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例
下文的实施例和附图进一步对本发明进行说明，但不应视为以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用常规细胞生物学技术、细胞培养技术、分子生物学技术、转基因生物学技术、微生物学技术和重组DNA技术，这些均在本领域的技术内。
在现行版本的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，(Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，(1989)、DNA Cloning(DNA克隆),Volumes I and II(Glover编辑,1985)、Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(Gait编辑，1984)、Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(Hames和Higgins编辑，1984)、转录和翻译(Hames和Higgins编辑，1984)中概括地描述了分子遗传学和遗传工程的方法。
如何评估植物(特别是谷类)的产量、生物量、生长速率、活力、氮利用效率和非生物胁迫耐受性(特别是对养分的耐受性，即，缺氮)的详细方法、产生基因工程植物(包括适当的载体和转化方案)、确定植物芽根中固氮酶mRNA的表达水平和植物与固氮微生物的根结合，和/或减少植物的施氮需求的方法是本领域技术人员已知的，并且描述在例如国际申请WO2010/049897和WO2013/066805中，将上述申请的公开内容通过引用并入到本文中。
实施例1：基因挖掘
以下描述总结了如何定义涉及长雄野生稻中的高固氮潜力的推定植物候选基因的过程。
缩写：BNF—生物固氮；EST—已表达序列标签；
nifH—编码固氮酶即用于固氮的关键细菌酶的结构基因之一。
第一RNA分析：
由于目前没有可用于基因挖掘的长雄野生稻基因组序列，因此对在没有氮肥的土壤中适应高BNF速率的植物进行了长雄野生稻根转录组的深度测序。总计，早期下一代测序(焦磷酸测序)显示60155个可与粳稻或籼稻基因组序列比对的EST，其中显著地9.993是尚未检测到在稻中表达的基因。约11000个EST是仅在我们的长雄野生稻转录集中发现的潜在新序列标签。
然而，当土壤***不贫瘠时，它们也可部分来源于其他生物体。对于涉及支持高固氮速率的基因识别和研发用于转录组分析和基因挖掘的长雄野生稻微阵列芯片用于转录组分析和基因挖掘的基因的识别，这些序列数据是宝贵的资源，这些数据已被公开(Yang等人，BMC Genomics，11(2010)，705)。
减少候选基因的数目
对长雄野生稻中与高BNF能力相关的差异基因表达的研究
前述实验已表明长雄野生稻根中的固氮生物种群在施用氮肥后不久就急剧改变，而且细菌固氮酶基因(nifH)表达迅速停止。因此，本文中鉴定了长雄野生稻的与缺乏BNF的施氮条件相比在高固氮速率的外部氮耗尽情况下差异地表达的基因。
用单剂量硝酸铵(对应100kg N/ha)作为氮肥进行盆栽实验，且植物经若干周适应这些条件。细菌nifH基因的表达低于这些施肥植物中的检测水平。从由固氮支持的这些植物根和植物中提取RNA，并且使用PCR-Select cDNA Subtraction Kit(PCR-选择cDNA消减试剂盒)(Clontech公司)构建SSH-(抑制消减杂交)。从按照桑格测序法测序的1358个克隆体中，检测到412个不同的EST，推定这些EST在BNF条件下上调。该方法提供了用于支持高固氮潜力和微阵列开发的新序列资源和推定候选基因。
通过微阵列分析研究差异基因表达：
在与上述类似的生物设置(set-up)中，在土壤中设置了分别适应BNF或施氮的长雄野生稻植物。来自这些根的RNA用于比较表达谱。对于转录组微阵列，已用SSH方法中检测到的其他基因升级设计用于亚洲栽培稻转录组分析的微阵列(Agilent公司)。该芯片的应用表明发现55个后面的(latter)基因在BNF期间上调，如预期的。
作为第二阵列，已开发探针用于在长雄野生稻根中检测到的EST。在该40K-阵列(Agilent公司)中，在BNF条件对施氮条件下，差异地调节约770个基因/EST。其中，用至少2倍的因素上调375个EST。它们被视为有希望的候选基因。
基因组分析：
然而，来自下一代测序(NGS)的EST相对较短，使得较难进行微阵列构建和完整基因注释以及生物信息学分析。特别地，许多EST可包括相同目标基因的不同区。为了获得较大量的对于新EST或低同一性EST尤其重要的全长序列，已由本文描述的长雄野生稻品种(accession)生成草图基因组序列。通过下一代测序进行了自定义测序。首先，已选择非饱和低成本方法，包括两个454-焦磷酸测序板(一个包含8kb的库)和一个配对末端Illumina HighSeq测序的通道的组合。因此，将EST从NGS映射到草图基因组使得能将候选基因清单再次减少至下表1中示出的基因。
表1：本发明的涉及长雄野生稻高固氮潜力的实验中识别的基因。示出预测的编码序列(CDS)和预测的氨基酸/蛋白质序列。Annot.＝亚洲栽培稻中的同源/相似基因注释。在基因序号一栏中用星号(*)标记的序列4、61和66在F1杂交种中比在亚洲栽培稻亲本植物中表达得更强。
实施例2：nifH转录本丰度的估算
按以前公布(Hurek等人，2002)以及改进(Burbano等人，2011年，同上)从来自植物根的总RNA提取物评估与植物根结合的NifH转录本水平。图1中，按Hurek等人，2002中的用相似的引物对nifH片段进行DNA扩增。对于图2，通过巢式反转录(RT)-PCR方法(Burbano等人，2011，同上)中的通用引物集来获得nifH片段的扩增：使用了巢式RT-PCR方案。在42℃下使用引物nifH3进行RT步骤。使用退火55℃用引物nifH3和nifH4进行PCR扩增。用1μl第一轮产物和引物ZehrF和ZehrR执行第二轮巢式PCR扩增。对于该第二轮，应用定量实时PCR进行定量(Bio-Rad CFX 96)。使用肌动蛋白基因来标准化nifH表达的量化。
为了产生体外转录的nifH mRNA作为对照，将对应于固氮弧菌属物种BH72(基因登录号AF200742)的钼固氮酶操纵子的碱基262-1433的来自质粒pBGvN322的1172-bp PvuII-EcoRI片段亚克隆入pBluescriptKS(Stratagene公司)，以产生质粒pBTH2。在用EcoRI截短之后，从T3启动子中转录出1.2kb的有义转录本。如B.Reinhold-Hurek、D.A.Shub，Nature，357，173(1992)中所描述的进行转录反应。
在图2中，示出了根中nifH转录的水平。亚洲栽培稻(Oryza sativa)根显示出显著低于野生稻根(长雄野生稻)的转录水平。在种间杂交种(F1)中，保留高转录水平(多重t试验与多重比较效果试验；*，P<0.05)。值为至少3次重复的有SD的平均值。将来自稻栽培种的所有值与来自野生稻的那些值进行比较。由实时RT-PCR量化NifH转录。使用肌动蛋白基因来标准化nifH表达的量化。
实施例3：通过15N测量确定氮并入。
长雄野生稻和其他植物在30℃的生长室中种植在盆栽内的来自法国卡马格的10年未施氮肥的饱水土壤中，16h日/8h夜循环，如L.Miché、F.Battistoni、S.Gemmer、M.Belghazi、B.Reinhold-Hurek，Mol.PlantMicrobe Interact(植物微生物分子互作)，19，502(2006)中所描述的。对于15N2示踪实验，将盆栽放入Conviron人工气候室内的气密室中，光、湿度和CO2浓度受控。紧接着使用前，连续用碱性高锰酸盐和稀硫酸处理15N2气体(99.30原子％15N；Euriso-top公司，伊维特河畔吉夫(Gif-Sur-Yvette)，法国)，以去除可能的杂质(如氧化氮和NH3)，如R.H.Burris，见A.Quispel(版本)，固氮生物学(The biology of nitrogenfixation)，(北荷兰出版公司，阿姆斯特丹，1974年)，页码：9-23中所描述的。在用15N标记N2温育的开始和结束时用Finnigan MAT 8200质谱仪(Finnigan MAT GmbH公司)测量室顶部空间的15N％丰度。
在0.41±0.15原子％15N过量的顶部空间下生长后，在第二次连续修剪后对植物进行取样。试验了将15N2示踪物并入野生稻种、F1杂交种的再生芽中以及与亚洲栽培稻回交。与经试验的亚洲栽培稻栽培种和回交相比，两种不同的F1杂交种保留了与野生稻类似的高N2增量潜力(单向ANOVA以及Bonferroni多重比较效果试验*，P<0.05)。

Claims (13)

1.一种增加植物的产量、生物量、生长速率、活力、来源于生物固氮的氮增量、氮利用效率、非生物胁迫耐受性和/或优选地增加植物对养分缺乏的耐受性的方法，包括向目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的分离基因材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离基因材料选自由表1中所列的核酸序列或编码与由表1中所列的核酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同的多肽的核酸序列组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标植物或植物细胞分别选自下述的植物或植物细胞的组：
-禾本科，
-稻亚科、早熟禾亚科、黍亚科或虎尾草亚科，
-稻族、小麦族、黍族或蜀黍族，
-稻属、大麦属、黑麦属、小麦属、小黑麦属、甘蔗属、椮属、高粱属、狼尾草属或玉蜀黍属；以及
-亚洲栽培稻、非洲栽培稻(栽培稻)、大麦(大麦)、黑麦(裸麦)、普通小麦(面包小麦)、一粒小麦、秀贵甘蔗、大茎野生蔗、竹蔗、细秆甘蔗、甘蔗食穗种、甘蔗割手密(甘蔗)、穇子、高粱(高粱属)、御谷(稷)、玉蜀黍(玉米)、或它们的杂交种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，通过双倍体化、单染色体添加/替换、着丝粒易位和/或同源重组来引入所述基因材料。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，通过以下方式向所述目标植物或植物细胞中引入长雄野生稻的基因材料：
-远缘杂交，
-化学方法，
-显微注入，
-电穿孔，
-粒子加速和/或粒子轰击，
-一种或多种病毒载体或细菌载体，优选地为土壤杆菌属，
-受体介导的机制，
-将基因材料注入到所述目标植物的生殖器官中，
-原生质体转化，和/或
-注入到所述目标植物的未成熟胚中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(i)使通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的接种了固氮微生物或未接种的所述植物的根和/或芽或植物细胞在土壤中生长；
(ii)确定所述植物的根中固氮酶mRNA的表达水平；
(iii)选择具有比亲本栽培植物高的固氮酶mRNA的根结合表达水平的植物；和/或
(iv)通过同位素的基于15N的方法确定通过固氮得到的植物氮的水平。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述固氮微生物为细菌，优选地为红环菌科的细菌。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，向所述目标植物或植物细胞中引入所述分离基因材料赋予、增加或改良所述植物与固氮微生物的根结合，和/或减少所述植物或所述植物细胞的施氮需求。
9.一种多核苷酸，包含根据权利要求1或2所述的分离基因材料。
10.一种载体，包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的载体，其中，根据权利要求2所限定的核酸序列与异源控制序列可操作地连接，所述异源控制序列能够引导核酸序列在宿主细胞，优选植物细胞中的转录以及优选表达。
12.一种栽培植物、其植物细胞或种子，包括根据权利要求1或2所限定的基因材料、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10或11所述的载体和/或能够通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法，优选地外源地表达所述基因材料获得。
13.长雄野生稻的基因材料在用于赋予、增加或改良植物与固氮微生物的根结合，减少植物的施氮需求，和/或提高谷类的氮保持度中的用途。
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