CN114657188A - 一种调控水稻镉积累的基因pk1及其蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控水稻镉积累的基因PK1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；一种调控水稻镉积累的基因PK1编码得到的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了该基因PK1或其编码蛋白在培育镉污染修复农作物、修复土壤镉污染、水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用。本发明采用的水稻PK1基因及其编码蛋白，可以利用稻草特异进行土壤镉的富集去除，而对土壤中其它营养元素的含量没有显著影响，克服了现有技术镉吸收转运与其它必须元素紧密偶联的特点，达到修复土壤镉而不损失土壤肥效的目标。

Description

一种调控水稻镉积累的基因PK1及其蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术和环境领域，具有涉及一种调控水稻镉积累基因PK1及其蛋白和应用。

背景技术

镉是生物毒性最强的重金属之一，其经植物根系吸收后不仅可对植物造成很强的毒害进而严重威胁生态环境，而且可以通过食物链富集后危害人类的健康。镉在我国的地质背景值很低，但是随着工业活动的加剧，氮肥的过度使用以及土壤酸化导致镉污染和迁移性提高。由于我国人均耕地面积相对较少，迫使镉污染土壤仍用来种植粮食作物，导致镉大米事件多发，严重危害人类健康。目前镉污染主要采用物理修复，化学修复的方法。遗憾的是，这些方法均不能有效的去除镉污染。

目前无论国际还是国内，有关植物吸收调控重金属的研究尤其是分子机理方面的研究仍相对有限，取得的结果相对不够***，主要集中在一些转运蛋白和基因突变的研究。这些基因的突变势必会影响植物对其它必须元素的利用，从而抑制植物的生长并降低其产量。因此找到植物必须矿物质营养转运和重金属解偶联的基因，是应对重金属污染的一种较好的策略。但目前的理论基础远不能满足生产实践需求。因此，本领域还需深入研究植物中镉积累机制，为培育具有降低土壤镉的种质提供基因资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种调控水稻镉积累基因PK1及其蛋白和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种调控水稻镉积累的基因PK1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种调控水稻镉积累的基因PK1编码得到的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的调控水稻镉积累的基因PK1或蛋白在培育镉污染修复农作物中的应用。

上述的应用，优选的，所述镉污染修复农作物的作物种类包括水稻、烟草、玉米和小麦中的任意一种或几种。

优选的，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体，即为镉污染修复农作物。

更优选的，将所述基因PK1克隆至目标载体中时采用的靶点sgR-PK1包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种调控水稻镉积累的基因PK1或如上述的蛋白在修复土壤镉污染中的应用，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体农作物，将其种植于镉污染土壤的大田，连续种植多年后即能实现土壤镉污染的修复。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种调控水稻镉积累的基因PK1或如上述的蛋白在水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至水稻中进行过表达，得到水稻纯合突变体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明采用的水稻PK1基因及其编码蛋白，可以利用稻草特异进行土壤镉的富集去除，而对土壤中其它营养元素的含量没有显著影响，克服了现有技术镉吸收转运与其它必须元素紧密偶联的特点，达到修复土壤镉而不损失土壤肥效的目标。

2、本发明的应用方法，通过基因编辑技术，创制了水稻中一个类受体蛋白激酶PK1的突变体，发现PK1主要在叶片表达，在叶鞘受到镉诱导表达，亚细胞定位于细胞膜；其突变体原生质体镉含量显著增加，并发现其突变体地上部和木质部伤流液镉含量显著增加，收获时期突变体稻草和籽粒中的镉含量显著增加，而对其它必须营养元素的积累没有显著影响，这为通过生物技术的手段培育镉修复潜力的农作物提供了优异的基因资源。

3、本发明的应用方法，通过基因编辑的手段，获得了一批可能特异对水稻重金属镉积累存在显著差异的突变体，找到植物调控重金属和必须矿物质营养元素吸收转运解偶联的基因，利用植物修复技术来对重金属污染土壤进行修复是一种较好的策略，这样达到特异修复重金属而不损失土壤肥效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是水稻PK1基因编辑突变体实验结果。

图2是PK1基因在镉处理前(A)和镉处理后(B)的表达模式结果。

图3是PK1基因的亚细胞定位结果。

图4是水稻苗期pk1突变体地上部(A)和木质部伤流液(B)镉含量结果。

图5是水稻苗期pk1突变体原生质体镉含量结果。

图6是水稻成熟时期pk1突变体稻草(A)和籽粒(B)镉积累量结果。

图7是水稻4周水培苗时期pk1突变体和野生型的实物图(A)、株高(B)和主根长(C)结果。

图8是水稻4周水培苗时期pk1突变体和野生型的全氮素含量(A)和氮素生理效率(B)结果。

图9是水稻成熟时期pk1突变体和野生型的单株产量结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种调控水稻镉积累基因PK1，被发现于水稻中，基因号为Os12g0632900，其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由该基因PK1编码得到的蛋白(一个水稻类受体蛋白激酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

1、PK1的突变体pk1的构建

为了研究PK1在水稻中的作用，我们利用基因编辑技术得到了3个纯合的突变体10250-12，10250-15，10250-17(图1)。基因编辑的靶点sgR-PK1的正向引物为GGTGGTGGCGGAGGCGGCAT(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)，反向引物序列为ATGCCGCCTCCGCCACCACC(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，这对引物体外互补形成双链克隆至中间载体上，然后通过酶切的方法克隆至目标载体P1300(获自University ofCalifornia，San Diego，US)中，得到含有PK1基因靶序列的目标载体。目标载体通过热击转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至水稻ZH11进行过表达，组织培养由武汉伯远生物有限公司完成。拿到转基因株系后，提取叶片DNA，利用测序引物M-F(其核苷酸序列如SEQID NO：5所示)和M-R(其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)通过PCR的方法扩增靶序列附近的DNA片段，最终通过测序的方法获得纯合突变体。

2、PK1基因的表达模式

基因的表达部位决定了其功能的发挥，为了研究PK1基因的时空特异性，我们选取了3周水培苗期(根、叶鞘、叶片)和大田开花时期(叶片、旗叶、叶鞘、旗叶鞘、节、节间、小穗)不同组织，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司试剂盒提取RNA，并反转录成CDNA，通过PK1特异引物RT-PK1-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)和RT-PK1-R(其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)，内参基因Actin特异引物RT-Actin-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)和RT-Actin-R(其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)，qRT-PCR检测发现PK1主要在水稻的叶片组织表达(图2A)。水稻水培3周后，用0,10μM Cd处理3天，检测PK1在根、叶鞘和叶片中受Cd诱导表达变化，发现PK1基因在叶鞘组织受到Cd的强烈诱导表达(图2B)。说明该基因参与了Cd逆境响应。

3、PK1基因的亚细胞定位于细胞膜

为了克隆PK1的全长CDS序列，我们设计合成了2对引物：PK1-1F(其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示)、PK1-1R(其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示)、PK1-2F(其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)、PK1-2R(其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示)，以ZH11的CDNA为模板，采用高保真聚合酶，PCR扩增目标片段，电泳回收目标片段切，与载体pBWA(V)HS-GLosgfp进行连接。将10ul连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。目标条带为3031bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100ul送样测序，其余400ul菌液接种到含有5-10ml(卡纳霉素)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒(质粒命名为：pBWA(V)HS-PK1-GLosgfp)。得到pBWA(V)HS-PK1-GLosgfp载体热击转入农杆菌中，注射烟草叶片表皮细胞瞬时表达PK1蛋白，避光24小时，72小时后通过激光共聚焦显微镜观察烟草叶片表皮细胞绿色荧光，得到PK1的亚细胞定位结果为细胞膜(图3)。

4、水稻苗期pk1突变体地上部和木质部伤流液镉含量显著增加

水稻水培3周后，用10μM Cd处理7天，检测发现类受体蛋白激酶RLK1突变体地上部和木质部伤流液重金属Cd积累量显著增加(图4)。

1)植物的地上部分材料用Milli-Q水冲洗后直接收取；

2)80℃烘箱中，24-48h；

3)烘干的植物材料，称取10-20mg，置入14mLFalcon TM管中；

4)加入1mL硝酸(MOS级)，轻轻晃动，使所有材料被浸泡，过夜；

5)99℃，煮30分钟，根据材料的实际情况，可反复煮2-3次；

6)冷却至室温，补充Milli-Q水至14mL，混匀，密封，待测；

7)电感耦合等离子质谱(ICP-MS，ELAN DRC-e，Perkin-Elmer)测定样品金属元素含量。

木质部伤流液收集方法：用锋利的刀片在根茎交界处以上1cm左右将植株切断。为了减少破损细胞质的污染，从第二滴开始收集伤流液，每5株植物收集在一起作为一个重复，收集30-40min左右。在整个收集过程中，培养箱中的湿度保持在100％。将木质部上流液用5％HNO₃(MOS级)稀释到2ml，并用ICP测量其中Cd含量。

结果如图4所示，相比于野生型，水稻PK1突变体10250地上部和木质部伤流液镉积累量显著增加。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’st-test分析*P<0.05，**P<0.01。

5、水稻pk1突变体原生质体镉含量显著增加

为了探究地上部Cd积累的具体部位，水稻水培3周后，用10μM Cd处理7天，取材分离原生质体，发现pk1突变体的原生质体中Cd含量显著增加(图5)。原生质体提取的方法参照文献(Zhang,Y.,Su,J.,Duan,S.,Ao,Y.,Dai,J.,Liu,J.,Wang,P.,Li,Y.,Liu,B.,Feng,D.,Wang,J.,&Wang,H.(2011).Ahighly efficient rice green tissue protoplastsystem for transient gene expression and studying light/chloroplast-relatedprocesses.Plant methods,7(1),30)进行，镉含量定量到原生质体总蛋白量上。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05，**P<0.01。

6、水稻成熟时期pk1突变体稻草和籽粒镉积累量增加

水稻生长至Cd污染大田至种子成熟，我们检测了水稻成熟时期ZH11和pk1突变体籽粒和秸秆中的Cd含量，发现pk1突变体中稻草和籽粒中Cd含量显著高于对照(图6)。这可能为培育地上部具有Cd修复潜力的水稻种质提供了基因资源。Cd的检测定方法同上述第4点。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05，**P<0.01。

实施例2：

一种利用调控水稻镉积累的基因PK1或其编码蛋白在修复土壤镉污染中的应用，即一种修复土壤镉污染的方法，包括如下步骤：

采用实施例1的方法培育镉污染修复水稻(即实施例1的水稻pk1纯合突变体)，种植于土壤镉含量为0.5μg/g干重的污染稻田，成熟后利用适合南方丘陵地区镉污染稻田秸秆、根茬高量离田及收割一体化农机具进行收割，经过连续2年的种植，土壤镉含量下降了30％，稻田土壤镉含量变为0.35μg/g干重，说明pk1突变体材料具有很好的修复效果。

实施例3：

一种利用调控水稻镉积累的基因PK1或其编码蛋白在水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用，包括如下步骤：

采用实施例1的方法培育水稻pk1纯合突变体。经过研究发现，在水稻不同生长时期，PK1对水稻生长发育，单株产量和氮素利用效率也有显著影响。比如4周水培苗时期，相比于野生型ZH11，pk1突变体的根系构型发生显著改变，株高和主根长显著降低(图7)；全氮含量增加，但氮素生理利用效率降低(图8)。成熟时期单株产量显著低于野生型ZH11(图9)。这些结果表明PK1为水稻产量调控，氮素利用，和根系构型遗传改良提供了优异基因资源。具有重大的应用前景。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05。

综上所述，本发明公开了一种调控水稻镉积累的基因PK1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的第1至977位。并公开了由这个基因得到的突变体在水稻苗期地上部、原生质体和木质部伤流液、成熟时期稻草和籽粒中的镉含量均高于对照，说明本发明的基因PK1或其编码蛋白可用于培育具有修复镉污染潜力的农作物，为通过生物技术的手段培育具有修复镉污染潜力的农作物提供了优异的基因资源。进一步的，将这些具有修复镉污染潜力的农作物种植后可用于修复土壤镉污染，修复效果良好。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种调控水稻镉积累的基因PK1及其蛋白和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgatca atctctcttc tcctccaatc ttcttgttgt tcttcttgtg gtgtgttgtc 60

gtcttcttcg tggccggcga tggcggcgcg gtggtggcgg aggcggcatt ggatgctcag 120

gcggcgtacc tgtcccagat gaagcaggag ttcgccgggc cggccatggc gaggtgggac 180

ttctcggcgc cggccgtgga ctactgcaag ttccagggtg tcgggtgcga cgcctccggc 240

aacgtgacgg ccatcgacgt cacgtcgtgg aggctgagcg gtaggctccc cggcggcgtg 300

tgcgaggcgc tcccggcgct ccgggaggtc cggctcgggt acaacgacat ccgcggcggg 360

ttccccggcg ggctggtgaa ctgcacgtcg ctggaggtgc tcaacctcag ctgctccggc 420

gtgtcgggcg ccgtgccgga cctgtcgcgg atgccggcgc tgcgggtgct cgacgtgtcc 480

aacaactact tctccggcgc gttcccgacg tcgatcgcca acgtcaccac gctcgaggtg 540

gccaacttca acgagaaccc cgggttcgac atctggtggc cgccggagtc gctgatggcg 600

ctgcggcgcc tccgcgtgct catcctgtcg acgacgtgca tgcacggcgg cgtcccggcg 660

tggctcggga acatgacgtc gctcaccgac ctggaactca gcggcaacct cctcaccggc 720

cacatcccgc tgtcgctggc gcgcctccca aacctgcagc tgctcgagct ctactacaac 780

ctgcttgagg gcgtcgtccc cgccgagctc ggcaacctca cgcagctcac cgacatcgac 840

ctctccgaga acaacctcac cggcggcatc ccggagtcca tctgcgcgct gcctcgcctc 900

cgcgtgctcc agatgtacac caacaagctc accggcgcca tcccggccgt gctcggcaac 960

tccacgcagc tccgcatcct gtccgtctac cgcaaccagc tcaccggcga gctccccgcc 1020

gacctcggcc gctactccgg cttcaacgtg ctggaggtgt cggagaacca gctcaccggc 1080

ccgctgccgc cgtacgcctg cgccaacggc cagctccagt acatcctcgt gctcagcaac 1140

ctcctcaccg gcgccatccc ggcgtcgtac gccgcgtgcc ggccgctgct ccgcttccgc 1200

gtcagcaaca accacctcga cggcgacgtc cccgcgggca tcttcgcgct cccgcacgcc 1260

tccatcatcg acctctccta caaccacctc accgggccag tgccggccac catcgccggc 1320

gccaccaacc tgacgtcgct gttcgcgtcg aacaaccgca tgtcgggggt cctgccgccg 1380

gagatcgccg gcgcggcgac gctggtcaag atcgacctga gcaacaacca gatcggcggg 1440

gcgatcccgg aggcggtggg gcggctgagc cggctgaacc agctgtcgct gcagggcaac 1500

cggctgaacg gctccatccc ggcgacgctc gccgacctcc acagcctgaa cgtgctgaac 1560

ctgtcgtaca atgcgctcgc cggcgagatc ccggaggcgc tgtgcacgct gctgcccaac 1620

tcgctggact tctccaacaa caacctgtcc gggccggtgc cgctgcagct gatcagggag 1680

gggctcctgg agagcgtcgc cggcaacccg gggctgtgcg tggcgttccg gctgaacctc 1740

accgacccgg cgctgccgct gtgccccaag ccggcgaggc tgcggatgcg ggggctcgcc 1800

gggagcgtgt gggtggtggc ggtgtgcgcg ctggtgtgcg tggtggcgac gctggcgctg 1860

gcgaggcggt gggtgctgcg ggcgcggcag gacggggagc acgacgggct cccgacgtcg 1920

ccggcgtcga gctcgtcgta cgacgtgacg agcttccaca agctgagctt cgaccagcac 1980

gagatcgtgg aggcgctgat cgacaagaac atcgtcggcc acggcggctc cggcacggtg 2040

tacaagatcg agctgagcaa cggcgagctg gtcgccgtga agaagctgtg ggtgtcgcgg 2100

cggtccaagc aggagcacgg ccatggcggc ggcggggggt gcctcgaccg cgagctgcgg 2160

acggaggtgg agacgctggg cagcatccgg cacaagaaca tcgtgaagct ctactgctgc 2220

tactccggcg ccgacagcaa cctgctggtg tacgagtaca tgcccaacgg caacctatgg 2280

gacgcgctcc acggcggcgg cgggtggggc ttcggcttcc tggactggcc gacgcgccac 2340

cgcgtcgcgc tcggcgtcgc ccagggcctc gcctacctcc accacgacct cctcttcccc 2400

atcgtccacc gcgacatcaa gtcctccaac atcctcctcg acgccgactt cgagcccaag 2460

gtcgccgact tcggcatcgc caaggtcctc caggcccgcg gcgatcgcga cgcctccacc 2520

accaccatcg ccggcaccta cggctacctc gctccagagt acgcctactc gtcaaaggcg 2580

acgacaaagt gcgacgtgta cagcttcggg gtggtgctaa tggagctggc gacggggaag 2640

aagccgatcg agccggagtt cggcgacacg agggacatcg tgcagtgggt ctccggcaag 2700

gtggccgccg gcggcgaggg cgaggcgctg gacaagcggc tcgagtggag ccccttcaag 2760

gaggagatgg tgcaggctct ccgcgtcgcc gtccgctgca cctgcagcat ccccggcctc 2820

cgccccacca tggccgacgt cgtgcagatg ctcgccgagg ccggccccgc cgccggccgg 2880

accgccaagg acgccgccaa caagaaggac tcctccggcg agccaaagct gtaa 2934

<210> 2

<211> 977

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Ile Asn Leu Ser Ser Pro Pro Ile Phe Leu Leu Phe Phe Leu

1 5 10 15

Trp Cys Val Val Val Phe Phe Val Ala Gly Asp Gly Gly Ala Val Val

20 25 30

Ala Glu Ala Ala Leu Asp Ala Gln Ala Ala Tyr Leu Ser Gln Met Lys

35 40 45

Gln Glu Phe Ala Gly Pro Ala Met Ala Arg Trp Asp Phe Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Val Asp Tyr Cys Lys Phe Gln Gly Val Gly Cys Asp Ala Ser Gly

65 70 75 80

Asn Val Thr Ala Ile Asp Val Thr Ser Trp Arg Leu Ser Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Gly Val Cys Glu Ala Leu Pro Ala Leu Arg Glu Val Arg Leu

100 105 110

Gly Tyr Asn Asp Ile Arg Gly Gly Phe Pro Gly Gly Leu Val Asn Cys

115 120 125

Thr Ser Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Cys Ser Gly Val Ser Gly Ala

130 135 140

Val Pro Asp Leu Ser Arg Met Pro Ala Leu Arg Val Leu Asp Val Ser

145 150 155 160

Asn Asn Tyr Phe Ser Gly Ala Phe Pro Thr Ser Ile Ala Asn Val Thr

165 170 175

Thr Leu Glu Val Ala Asn Phe Asn Glu Asn Pro Gly Phe Asp Ile Trp

180 185 190

Trp Pro Pro Glu Ser Leu Met Ala Leu Arg Arg Leu Arg Val Leu Ile

195 200 205

Leu Ser Thr Thr Cys Met His Gly Gly Val Pro Ala Trp Leu Gly Asn

210 215 220

Met Thr Ser Leu Thr Asp Leu Glu Leu Ser Gly Asn Leu Leu Thr Gly

225 230 235 240

His Ile Pro Leu Ser Leu Ala Arg Leu Pro Asn Leu Gln Leu Leu Glu

245 250 255

Leu Tyr Tyr Asn Leu Leu Glu Gly Val Val Pro Ala Glu Leu Gly Asn

260 265 270

Leu Thr Gln Leu Thr Asp Ile Asp Leu Ser Glu Asn Asn Leu Thr Gly

275 280 285

Gly Ile Pro Glu Ser Ile Cys Ala Leu Pro Arg Leu Arg Val Leu Gln

290 295 300

Met Tyr Thr Asn Lys Leu Thr Gly Ala Ile Pro Ala Val Leu Gly Asn

305 310 315 320

Ser Thr Gln Leu Arg Ile Leu Ser Val Tyr Arg Asn Gln Leu Thr Gly

325 330 335

Glu Leu Pro Ala Asp Leu Gly Arg Tyr Ser Gly Phe Asn Val Leu Glu

340 345 350

Val Ser Glu Asn Gln Leu Thr Gly Pro Leu Pro Pro Tyr Ala Cys Ala

355 360 365

Asn Gly Gln Leu Gln Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Leu Leu Thr Gly

370 375 380

Ala Ile Pro Ala Ser Tyr Ala Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Phe Arg

385 390 395 400

Val Ser Asn Asn His Leu Asp Gly Asp Val Pro Ala Gly Ile Phe Ala

405 410 415

Leu Pro His Ala Ser Ile Ile Asp Leu Ser Tyr Asn His Leu Thr Gly

420 425 430

Pro Val Pro Ala Thr Ile Ala Gly Ala Thr Asn Leu Thr Ser Leu Phe

435 440 445

Ala Ser Asn Asn Arg Met Ser Gly Val Leu Pro Pro Glu Ile Ala Gly

450 455 460

Ala Ala Thr Leu Val Lys Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile Gly Gly

465 470 475 480

Ala Ile Pro Glu Ala Val Gly Arg Leu Ser Arg Leu Asn Gln Leu Ser

485 490 495

Leu Gln Gly Asn Arg Leu Asn Gly Ser Ile Pro Ala Thr Leu Ala Asp

500 505 510

Leu His Ser Leu Asn Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ala Leu Ala Gly

515 520 525

Glu Ile Pro Glu Ala Leu Cys Thr Leu Leu Pro Asn Ser Leu Asp Phe

530 535 540

Ser Asn Asn Asn Leu Ser Gly Pro Val Pro Leu Gln Leu Ile Arg Glu

545 550 555 560

Gly Leu Leu Glu Ser Val Ala Gly Asn Pro Gly Leu Cys Val Ala Phe

565 570 575

Arg Leu Asn Leu Thr Asp Pro Ala Leu Pro Leu Cys Pro Lys Pro Ala

580 585 590

Arg Leu Arg Met Arg Gly Leu Ala Gly Ser Val Trp Val Val Ala Val

595 600 605

Cys Ala Leu Val Cys Val Val Ala Thr Leu Ala Leu Ala Arg Arg Trp

610 615 620

Val Leu Arg Ala Arg Gln Asp Gly Glu His Asp Gly Leu Pro Thr Ser

625 630 635 640

Pro Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Asp Val Thr Ser Phe His Lys Leu Ser

645 650 655

Phe Asp Gln His Glu Ile Val Glu Ala Leu Ile Asp Lys Asn Ile Val

660 665 670

Gly His Gly Gly Ser Gly Thr Val Tyr Lys Ile Glu Leu Ser Asn Gly

675 680 685

Glu Leu Val Ala Val Lys Lys Leu Trp Val Ser Arg Arg Ser Lys Gln

690 695 700

Glu His Gly His Gly Gly Gly Gly Gly Cys Leu Asp Arg Glu Leu Arg

705 710 715 720

Thr Glu Val Glu Thr Leu Gly Ser Ile Arg His Lys Asn Ile Val Lys

725 730 735

Leu Tyr Cys Cys Tyr Ser Gly Ala Asp Ser Asn Leu Leu Val Tyr Glu

740 745 750

Tyr Met Pro Asn Gly Asn Leu Trp Asp Ala Leu His Gly Gly Gly Gly

755 760 765

Trp Gly Phe Gly Phe Leu Asp Trp Pro Thr Arg His Arg Val Ala Leu

770 775 780

Gly Val Ala Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His His Asp Leu Leu Phe Pro

785 790 795 800

Ile Val His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ala Asp

805 810 815

Phe Glu Pro Lys Val Ala Asp Phe Gly Ile Ala Lys Val Leu Gln Ala

820 825 830

Arg Gly Asp Arg Asp Ala Ser Thr Thr Thr Ile Ala Gly Thr Tyr Gly

835 840 845

Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Ser Ser Lys Ala Thr Thr Lys Cys

850 855 860

Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Ala Thr Gly Lys

865 870 875 880

Lys Pro Ile Glu Pro Glu Phe Gly Asp Thr Arg Asp Ile Val Gln Trp

885 890 895

Val Ser Gly Lys Val Ala Ala Gly Gly Glu Gly Glu Ala Leu Asp Lys

900 905 910

Arg Leu Glu Trp Ser Pro Phe Lys Glu Glu Met Val Gln Ala Leu Arg

915 920 925

Val Ala Val Arg Cys Thr Cys Ser Ile Pro Gly Leu Arg Pro Thr Met

930 935 940

Ala Asp Val Val Gln Met Leu Ala Glu Ala Gly Pro Ala Ala Gly Arg

945 950 955 960

Thr Ala Lys Asp Ala Ala Asn Lys Lys Asp Ser Ser Gly Glu Pro Lys

965 970 975

Leu

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggtggcg gaggcggcat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccgcctc cgccaccacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agccaccatc tgatctgtgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggatgtcgt tgtacccgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgagcaac aaccagatcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggacaggtt gttgttggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccatcttgg catctctcag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtacccgcat caggcatctg 20

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagtggtctc acaacatggt gatcaatctc tcttc 35

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgatggtctc aacccactgc acgatgtccc t 31

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtggtctc agggtctccg gcaaggtggc cgccg 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagtggtctc atacacagct ttggctcgcc ggagg 35

Claims (10)

1.一种调控水稻镉积累的基因PK1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述的调控水稻镉积累的基因PK1编码得到的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述的调控水稻镉积累的基因PK1或如权利要求2所述的蛋白在培育镉污染修复农作物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述镉污染修复农作物的作物种类包括水稻、烟草、玉米和小麦中的任意一种或几种。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体，即为镉污染修复农作物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述基因PK1克隆至目标载体中时采用的靶点sgR-PK1包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.一种如权利要求1所述的调控水稻镉积累的基因PK1或如权利要求2所述的蛋白在修复土壤镉污染中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体农作物，将其种植于镉污染土壤的大田，连续种植多年后即能实现土壤镉污染的修复。

9.一种如权利要求1所述的调控水稻镉积累的基因PK1或如权利要求2所述的蛋白在水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因PK1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至水稻中进行过表达，得到水稻纯合突变体。

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