CN103808846B - 尿液中35种毒药物的串联四级杆气相色谱质谱检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种<b>尿液中</b><b>35</b><b>种毒药物的串联四级杆气相色谱质谱检测法</b>，首先用35种毒（药）的标准品在串联四级杆气相色谱质谱联用仪上建立多重反应检测方法，确定2~3对特征母离子和子离子对及每种毒（药）物的保留时间。待测尿样用***萃取，经超声、离心、吹干和溶解后，用串联质谱MRM定性、定量分析毒（药）物。本发明采用串联四级杆气相色谱质谱联用法（GC-MS/MS）同时快速筛检人体尿液中35中常见毒（药）物，检验结果准确、灵敏、快速，毒（药）物回收率达80.82%至118.56%，检出限达到0.0014~1.8μg/ml。

Description

尿液中35种毒药物的串联四级杆气相色谱质谱检测法

技术领域

本发明属于一种尿液中35种毒物的串联四级杆气相色谱质谱检测法。

背景技术

吸毒、贩毒已成为全球性的社会公害。人一旦沾染毒品就会经常沉湎于毒品所幻想出的畸形“快感”之中，无心工作和学习。吸毒还会引发一系列的家庭社会问题。鉴于吸食毒品对家庭，特别是对社会的严重危害，国外一些国家除对本国吸毒者采取相应的管理措施外，对入境者也要求提供申请人不吸毒的证明，如俄罗斯、比利时、香港等。随着全球经济一体化进程加快，其他国家对入境者不可避免的将陆续出台类似的规定。为积极应对国外一些国家对我人员入境签证时涉及健康状况方面提出加做毒品检测的要求，检验检疫部门要按照国家局的要求，一方面积极进行物质和技术上的准备以应对国外对我入境人员健康检查的要求；另一方面从保护我国人民身体健康和维护社会稳定目的出发，也应采取对等的原则，对来华人员增加毒品检测的要求。

目前国内外最广泛使用的人体内毒品成分检验的测试技术是免疫测试技术以及气相色谱法(GC)，国外也有使用气质联用检测的(GC/MS)。检索中国标准网发现，在标准中仅有公安部的关于***、***、***等几类毒品的行业标准，主要是直接对毒品的检测，而并不是针对临床样本方面的检测方法。目前检验检疫部门对出入境人员尿液进行毒品检测的方法主要采用胶体金技术快速检测***和***，假阳性率极高，而且只能检测2种毒品。因此建立一种快速、灵敏、准确的多种毒（药）物同时检测方法变得尤为重要。

中国专利号为201110075177.4公开了一种尿液中33种毒品的液相色谱串联质谱检测方法，其步骤如下：

样品处理：称取2g待检尿样，精确到0.01g，置于50mL具塞离心管中，加入10ml乙酸乙酯，在液体混匀器上充分混匀1min，以4000r/min离心10min，吸取上层乙酸乙酯于试管中，再加入1mL0.1mol/L NaOH溶液，在液体混匀器上充分混匀后，加入10ml乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液；提取液用氮气吹干仪在40℃吹干，加入1mL体积比为30∶70的甲醇∶水涡旋后，过0.25μm滤膜，得待测样品；

测定：待测样品用液相色谱串联四极杆质谱仪进行测定；在33种毒品的液相色谱串联质谱分析法中，除了巴比妥类药物使用负离子模式分析之外，其余化合物都使用正离子模式分析；

其中正离子模式的质谱条件为：电离源：ESI源；扫描模式：正离子选择扫描模式SRM；电喷雾电压：2.5kV；干燥气温度：400℃；气帘气压力：45arb；辅助气压力：7arb；毛细管温度：350℃；碰撞气：高纯氩气；

负离子模式的质谱条件为：电离源：ESI源；扫描模式：负离子选择扫描模式SRM；电喷雾电压：2.5kV；干燥气温度：400℃；气帘气压力：50arb；辅助气压力：7arb；毛细管温度：320℃；碰撞气：高纯氩气；

色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Gemini C18100×2.0，3μm；柱温：室温；流速：250μL/min；进样体积：25μL。

中国专利号为201110075177.4的对比文件其尿液采用经典的液液萃取法进行样品前处理,采用乙酸乙酯作为萃取溶剂，萃取剂共用量20ml，而且只能检测33种毒品。本方法且采用液相色谱串联质谱检测,其方法的不足之处为，由于检测物质有些用正离子扫描而有些为负离子扫描。所以检测时要分成两次进行检测不能达到真正的一次性检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用串联四级杆气相色谱质谱联用法（GC-MS/MS）同时快速筛检人体尿液中35中常见毒（药）物的新方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的尿液中35种毒（药）物的串联四级杆气相色谱质谱联用检测法，其特征在于：首先用35种毒（药）的标准品在串联四级杆气相色谱质谱联用仪上建立多重反应检测方法，确定2～3对特征母离子和子离子对及每种毒（药）物的保留时间；待测尿样用***萃取，经超声、离心、吹干和溶解后，用串联质谱MRM定性、定量分析毒（药）物；

色谱条件是：仪器，Agilent7890GC/7000QQB；GC条件：DB-1MS（30m×0.25mm×0.25μm）石英毛细管柱，进样口温度：250℃，不分流；程序升温：起始温度50℃，以12℃/min升温到290℃保持10min，流速：1ml/min，进样量：0.5μL；MS条件：EI离子源，电子能源70eV，离子源温度230℃，接口温度：280℃，四级杆温度：150℃，电子倍增器电压：1381eV。

所述的串联四级杆气相色谱质谱联用检测法，具体包括：1）标准溶液配制：所加入35种毒（药）物混合标准品的甲醇溶液中敌敌畏，乐果，甲基对硫磷，马拉硫磷，对硫磷、毒鼠强浓度均为22.73μg/ml；巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、利多卡因、***、阿托品、阿米替林、氯丙嗪、咪达***、硝西泮、氯硝西泮、氯氮平、艾司***、阿普***、***仑浓度均为16.67μg/ml；MDMA、扑热息痛、哌替啶、氨基比林、曲马多、扑尔敏、***、多虑平、卡马西平、***浓度均为20.83μg/ml；

甲基***、麻黄碱、***、可待因浓度均为25μg/ml；

2）检测方法

2.1）样品处理

取待检尿液1ml，加入***6ml分三次萃取，每次2ml；在40℃超声萃取10min，然后以10000r/min离心3min，三次萃取有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用100μL甲醇溶解，取1μL进GC/MS/MS分析；

2.2）GC条件

GC条件：DB-1(30m×0.25mm×0.25m)石英毛细管柱，进样口温度：250℃，不分流；程序升温：起始温度50℃，以12℃/min升温到290℃保持10min，流速：1ml/min，进样量：0.5μL；

2.3）MS条件

MS条件：EI离子源，电子能源70eV，离子源温度230℃，接口温度：280℃，四级杆温度：150℃，电子倍增器电压：1381eV；

35种毒药物的最优母离子子离子对见下表1：

表135种毒（药）物色谱保留时间及质谱特征离子对

表中的*为定量离子对；

3）定性定量方法：以各毒品的相对保留时间和各毒品的监测母离子/子离子对的丰度比为定性依据，各毒品的保留时间见上表1；用外标法定量，以各毒品的峰面积计算其在样品中的残留量；

4）基质效应

在空白尿样按上述的“2.1”步骤处理后，加入35种毒（药）物的标准溶液，进行GC-MS/MS分析，得标准品峰面积A；同样对35种毒（药）物的标准溶液进行分析，得到相应的峰面积B；基质效应=A/B×100%，结果表明除了硝西泮和氯硝西泮是基质抑制其它33种毒药物都是基质增强，其中阿托品的基质增强效应最明显，具体见下表2；

表235种毒药物基质效应列表

5）标准曲线及检测限

取空白尿样，加入35种毒（药）物标准溶液混合，配成尿液中扑热息痛质量浓度分别为3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、15.0μg/mL；尿液中敌敌畏质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0μg/mL；尿液中毒鼠强、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷和对硫磷质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、9.1μg/mL；尿液中甲基***、麻黄碱、***和可待因质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5μg/mL；尿液中其余24种毒药物质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.5μg/mL的标准溶液；按2.1步骤方法前处理后进行GC-MS/MS分析；以毒药物峰面积（A）对毒药物质量浓度（C，μg/mL）绘制标准曲线，并求得直线回归方程和相关系数；最低检出限为按2.1步骤方法处理样品所能检测到的尿液中毒药物浓度（以3倍信噪比计算），结果可见该方法中35种毒药物的线性方程相关系数r均为0.98以上，具体见表3；

表335种毒（药）物的标准曲线方程、相关系数和检出限

本发明的检测方法的主要技术内容及基本原理：

1）萃取溶剂对比环己烷，乙酸乙酯，三氯甲烷和***四种，发现***提取率高，且***沸点低，较易浓缩，因此选用***作为萃取溶剂。

2）本发明通过对样品前处理方法的摸索及GC-MS/MS分析条件的优化，用***萃取，分段多重反应监测法（MRM）鉴定，并用提取离子对进一步验证，可以同时检测甲胺磷、毒鼠强、***、尼可刹米、利多卡因、***、阿托品等7大类共35中常见毒（药）物，回收率达80.82%至118.56%，检出限达到0.0014～1.8μg/ml。本法用色谱保留时间、质谱特征母离子/子离子对同时定性，以各毒药物的峰面积计算其在样品中的残留量。该方法最大限度消除了尿液中复杂基体的干扰，能快速准确对35种毒（药）物进行定性定量分析，适用面广、操作简单、检测针对性强。可用于出入境检验检疫、疾病预防与控制中心，公安部门快速检测及阳性结果的确证。

同国标法对比，该法具有灵敏、准确、简便、快速等特点。

本发明优点为：1）尿液中常见毒药物的常规技术前处理采用液液萃取法，本发明发现***提取率高，共用6mL***就可对尿液中35中毒（药）物进行完全萃取。且***沸点低，较易浓缩，因此选用***作为萃取溶剂；2）常规技术如专利号为201110075177.4的对比文件采用高效液相色谱-串联质谱技术，其只能检测到33种毒（药）物，本发明采用串联四级杆气相色谱质谱联用法（GC-MS/MS）同时快速筛检人体尿液中35中常见毒（药）物，检验结果准确、灵敏、快速，毒（药）物回收率达80.82%至118.56%，检出限达到0.0014～1.8μg/ml。

附图说明

图1为35种毒药物标准样品GC-MS/MS多反应监测谱图。从图中可看到35种毒药物的保留时间和出峰位置。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明

1仪器

仪器：Agilent7890GC/7000QQQB。

2试剂

2.1药品：测定范围内的35种毒（药）物的标准品中***和MDMA为500μg/ml的甲醇溶液，毒鼠强为250μg/ml乙酸乙酯溶液，其它均为1mg/mL甲醇溶液。购自司法部司法鉴定科学技术研究所。

2.2试剂：环己烷、乙酸乙酯，三氯甲烷、***、磷酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸等均为分析纯；甲醇为色谱纯。

2.3标准溶液配制：所加入35种毒（药）物混合标准品的甲醇溶液中敌敌畏，乐果，甲基对硫磷，马拉硫磷，对硫磷、毒鼠强浓度均为22.73μg/ml；巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、利多卡因、***、阿托品、阿米替林、氯丙嗪、咪达***、硝西泮、氯硝西泮、氯氮平、艾司***、阿普***、***仑浓度均为16.67μg/ml；MDMA、扑热息痛、哌替啶、氨基比林、曲马多、扑尔敏、***、多虑平、卡马西平、***浓度均为20.83μg/ml；甲基***、麻黄碱、***、可待因浓度均为25μg/ml。

3分析方法

3.1样品处理

取待检尿液1ml，加入***6ml分三次萃取，每次2ml。在40℃超声萃取10min，然后以10000r/min离心3min，三次萃取有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用100μL甲醇溶解，取1μL进GC/MS/MS分析。

3.2GC条件

GC条件：DB-1(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱，进样口温度：250℃，不分流。程序升温：起始温度50℃，以12℃/min升温到290℃保持10min，流速：1ml/min，进样量：0.5μL。

3.3MS条件

MS条件：EI离子源，电子能源70eV，离子源温度230℃，接口温度：280℃，四级杆温度：150℃，电子倍增器电压：1381eV。

4方法优化与方法验证

4.1样品前处理优化

4.1.1萃取溶剂的优化

萃取溶剂对比环己烷，乙酸乙酯，三氯甲烷和***四种，发现***提取率高，且***沸点低，较易浓缩，因此选用***作为萃取溶剂。

4.1.2萃取pH值的优化

调节体系的pH值分别为1.5、3.5、5、7、9、12。结果根据各个毒（药）物的峰面积，回收率总体最高时的pH为7。

4.2GC条件的优化

对比色谱柱DB-1MS、HP-5MS、DB-17MS。BD-1MS可以使35种毒（药）物成分得到很好的分离。

4.3MS条件的优化

4.3.1确定待检化合物的特征母离子子离子对

首先用35种毒（药）物的标准品在GC/MS/MS上建立多重反应监测（MRM）方法，确定待检化合物的特征三对母离子和子离子对。

4.3.2分段检测方法的开发

用该MRM方法检测35种毒（药）物的混合标准品，适当优化色谱条件使得35种毒（药）物基本能达到分别基线分离，由于各待检物基本可达到基线分离因此采用每个物质划分成一个分析时段，选择在该段出峰的毒药物成分的特征MRM方法进行检测。最终用保留时间和特征母离子和子离子对定性。当两个物质在同一保留时间出峰或者出峰时间相差很小时，可采用提取母离子子离子对色谱图进行化合物定性及定量分离分析。

5结果分析

5.135种毒药物的最优母离子子离子对列表如下：

表135种毒（药）物色谱保留时间及质谱特征离子对

注：*为定量离子对。

5.235种毒药物在最优MRM方法和分段检测方法时的谱图见图1，图135种毒药物标准样品GC-MS/MS多反应监测谱图，从图中可看到35种毒药物的保留时间和出峰位置。5.3定性定量方法：以各毒品的相对保留时间和各毒品的监测母离子/子离子对的丰度比为定性依据，各毒品的保留时间见上表；用外标法定量，以各毒品的峰面积计算其在样品中的残留量。

5.4特异性

由于GC-MS/MS方法的先进性，采用目标分析物的特征母离子子离子对进行定性定量分析，可最大程度的排除基质干扰提高对目标物检测的特异性。

5.5基质效应

在空白尿样按“3.1”项处理后，加入35种毒（药）物的标准溶液，进行GC-MS/MS分析，得标准品峰面积A；同样对35种毒（药）物的标准溶液进行分析，得到相应的峰面积B；基质效应=A/B×100%。结果表明除了硝西泮和氯硝西泮是基质抑制其它33种毒药物都是基质增强，其中阿托品的基质增强效应最明显，具体见下表2。

表235种毒药物基质效应列表

5.6标准曲线及检测限

取空白尿样，加入35种毒（药）物标准溶液混合，配成尿液中扑热息痛质量浓度分别为3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、15.0μg/mL；尿液中敌敌畏质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0μg/mL；尿液中毒鼠强、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷和对硫磷质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、9.1μg/mL；尿液中甲基***、麻黄碱、***和可待因质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5μg/mL；尿液中其余24种毒药物质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.5μg/mL的标准溶液。按3.1方法前处理后进行GC-MS/MS分析。以毒药物峰面积（A）对毒药物质量浓度（C，μg/mL）绘制标准曲线，并求得直线回归方程和相关系数。最低检出限为按3.1方法处理样品所能检测到的尿液中毒药物浓度（以3倍信噪比计算），结果可见该方法中35种毒药物的线性方程相关系数r均为0.98以上，具体见表3。

表335种毒（药）物的标准曲线方程、相关系数和检出限

5.7准确度和精密度

按步骤“4.5标准曲线的制备”项下操作,制备35种毒（药）物低、中、高三个浓度的质量控制（QC）样品，每一浓度进行5次分析，连续测定五天，根据当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，结果见表4。

表435种毒（药）物的日内和日间回收率和精密度

6实样测定

取实际样品，其中已知含有敌敌畏、毒鼠强、异戊巴比妥、***、多虑平和氯氮平6种毒（药）物，并且已知六种毒物的浓度均为5μg/mL。该实际样品按照步骤“3.1”样品前处理方法进行处理，进行GC-MS/MS分析，测定结果见表5。从表5可知，采用本发明的检测方法实际样品中6种毒（药）物均准确定性，通过定量曲线获得的含量与实际样品量的相对偏差均小于5%，证明该检测方法可靠实用。

表5人尿中实际样品测定毒（药）物含量的结果表

7讨论

本发明利用GC-MS/MS具有很高的特异性、灵敏性、准确性等优点，建立了一次性同时检测35种常见毒药物的新方法，对提取溶剂、体系pH值、色谱柱等样品前处理及检测条件进行了***考察和优化，确定了35种毒药的最优母离子/子离子对（具体见表1）。在选定的条件下，进一步给出了35种毒药物在GC-MS/MS上的线性范围、线性方程（所有线性相关系数r均大于0.98）、每种物质的检测限（具体见表3）等，35种毒药物所建立方法的日内和日间回收率均在80%～120%之间，精密度RSD值均小于10%。

总之本发明运用GC-MS/MS方法，可一次性同时对35种毒药物进行定性定量分析，用色谱保留时间与质谱同时定性，消除尿液中其它成分干扰，结果准确可靠，选择性和重复性好，实际样品定性定量检测均获得满意结果，表明建立的GC-MS/MS方法准确可靠能满足人体尿液中毒品检测的要求。

Claims (1)

1.一种尿液中35种毒药物的串联四级杆气相色谱质谱联用检测法，其特征在于：首先用35种毒药的标准品在串联四级杆气相色谱质谱联用仪上建立多重反应检测方法，确定2～3对特征母离子和子离子对及每种毒药物的保留时间；待测尿样用***萃取，经超声、离心、吹干和溶解后，用串联质谱MRM定性、定量分析毒药物；

色谱条件是：仪器，Agilent 7890GC/7000QQB；GC条件：DB-1MS 30m×0.25mm×0.25μm石英毛细管柱，进样口温度：250℃，不分流；程序升温：起始温度50℃，以12℃/min升温到290℃保持10min，流速：1ml/min，进样量：0.5μL；MS条件：EI离子源，电子能源70eV，离子源温度230℃，接口温度：280℃，四级杆温度：150℃，电子倍增器电压：1381eV；

具体检测步骤为：

1)标准溶液配制：所加入35种毒药物混合标准品的甲醇溶液中敌敌畏，乐果，甲基对硫磷，马拉硫磷，对硫磷、毒鼠强浓度均为22.73μg/ml；巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、利多卡因、***、阿托品、阿米替林、氯丙嗪、咪达***、硝西泮、氯硝西泮、氯氮平、艾司***、阿普***、***仑浓度均为16.67μg/ml；MDMA、扑热息痛、哌替啶、氨基比林、曲马多、扑尔敏、***、多虑平、卡马西平、***浓度均为20.83μg/ml；甲基***、麻黄碱、***、可待因浓度均为25μg/ml；

2)检测方法

2.1)样品处理

取待检尿液1ml，加入***6ml分三次萃取，每次2ml；在40℃超声萃取10min，然后以10000r/min离心3min，三次萃取有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用100μL甲醇溶解，取1μL进GC/MS/MS分析；

2.2)GC条件

GC条件：DB-130m×0.25mm×0.25m石英毛细管柱，进样口温度：250℃，不分流；程序升温：起始温度50℃，以12℃/min升温到290℃保持10min，流速：1ml/min，进样量：0.5μL；

2.3)MS条件

MS条件：EI离子源，电子能源70eV，离子源温度230℃，接口温度：280℃，四级杆温度：150℃，电子倍增器电压：1381eV；

35种毒药物的最优母离子子离子对见下表1：

表1 35种毒药物色谱保留时间及质谱特征离子对

上表中的*为定量离子对；

3)定性定量方法：以各毒品的相对保留时间和各毒品的监测母离子/子离子对的丰度比为定性依据，各毒品的保留时间见上表1；用外标法定量，以各毒品的峰面积计算其在样品中的残留量；

4)基质效应

在空白尿样按上述的2.1)步骤处理后，加入35种毒药物的标准溶液，进行GC-MS/MS分析，得标准品峰面积A；同样对35种毒药物的标准溶液进行分析，得到相应的峰面积B；基质效应＝A/B×100％，结果表明除了硝西泮和氯硝西泮是基质抑制其它33种毒药物都是基质增强，其中阿托品的基质增强效应最明显，具体见下表2；

表2 35种毒药物基质效应列表

5)标准曲线及检测限

取空白尿样，加入35种毒药物标准溶液混合，配成尿液中扑热息痛质量浓度分别为3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、15.0μg/mL；尿液中敌敌畏质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0μg/mL；尿液中毒鼠强、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷和对硫磷质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、9.1μg/mL；尿液中甲基***、麻黄碱、***和可待因质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5μg/mL；尿液中其余24种毒药物质量浓度分别为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.5μg/mL的标准溶液；按2.1步骤方法前处理后进行GC-MS/MS分析；以毒药物峰面积A对毒药物质量浓度C，μg/mL绘制标准曲线，并求得直线回归方程和相关系数；最低检出限为按2.1步骤方法处理样品所能检测到的尿液中毒药物浓度以3倍信噪比计算，结果可见该方法中35种毒药物的线性方程相关系数r均为0.98以上，具体见表3；

表3 35种毒药物的标准曲线方程、相关系数和检出限