CN105861397A - 一株辣椒拮抗内生菌p5菌株 - Google Patents

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Abstract

一种拮抗内生菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)P5菌株，于2016年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016131。本菌株P5的发酵液具有广谱抑菌活性，对辣椒炭疽病菌、柑橘青霉病菌、白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒白绢病菌、番茄早疫病菌等植物病原真菌具有明显的抑制作用，其中对辣椒白绢病菌菌丝生长的拮抗能力最强，抑制率达48.57％，对番茄早疫病菌菌丝生长拮抗能力最差，但抑制率仍达到21.74％，为研制新型生物植物杀菌剂提供了依据。

Description

一株辣椒拮抗内生菌P5菌株
技术领域
本发明涉及一种拮抗内生菌，尤其涉及一种对辣椒炭疽病菌(C.gloeosporioides)等多种植物病原真菌具有拮抗作用的内生细菌，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)P5菌株。
技术领域
目前控制果蔬采后病害的主要措施仍是化学杀菌剂，但是，长期使用化学杀菌剂导致病菌产生的抗药性大大降低了其防病效果。同时生产上频繁使用高浓度化学杀菌剂造成其在果蔬果肉中的残留量增加而威胁人类健康，因此，寻求安全、有效的果蔬采后防病技术已成为当前研究的热点。
生物防治具有不污染环境、无农药残毒、不产生抗药性、处理费用低廉等优点。植物内生菌寄生在植物组织内，在长期进化过程中与寄主形成了互利共生关系。植物内生菌通过产生大量具有生物活性的物质来保护寄主植物免受病害的侵染。目前，植物内生菌用于果蔬采后杀菌已有相关报道。例如，百部内生菌EJS的发酵液对油桃采后青霉病具有显著的抑制效果。
芽孢杆菌能产生多种脂肽类抗生素，如伊枯草菌素、表面活性素、fenmgycin等。这些化合物具有很强的抗菌活性，能有效控制果蔬采后病害的发生。作为芽孢杆菌属的一个种，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)广泛存在于自然界中，是植物体内常见的内生细菌，对人体无毒无害，且不污染环境。其在生长代谢过程中能够产生两类抗菌物质，一类是非核糖体合成的脂肽类抗生素(lipopeptide antibiotics)，例如surfactin、iturin、plipastatin等，通常对植物病原真菌具有显著的抑制作用；另一类是由核糖体合成的细菌素(bacteriocin)，例如subtilosin、sublancin、subtilin，能够有效地杀死近缘细菌。目前，国内有关枯草芽孢杆菌对植物病原菌的生物防治研究报道已经很多。例如，何红等发现枯草芽孢杆菌BS-2菌株胞外分泌物对辣椒红色炭疽病病原菌有很强的抑制作用；孔建等发现枯草芽孢杆菌B-903产生的抗菌物质对多种植物病原真菌有抑制作用。
因此，从植物内生菌群中筛选拮抗菌株，并利用其产生的抑菌物质制成新型生物杀菌剂，以此取代化学杀菌剂或降低化学杀菌剂的使用量具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种拮抗内生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P5菌株，其对辣椒炭疽病菌等植物病原菌具有明显拮抗作用。
本发明所述的枯草芽孢杆菌P5(Bacillus subtilis)P5菌株，已于2016年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2016131。
本发明菌株P5的形态特征：
本发明菌株P5于牛肉膏蛋白胨固体培养基中于28℃培养，在高倍显微镜下，菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性(图1)，28℃培养24h后，单个菌落呈圆形，乳白色，不透明，边缘整齐，菌落大小约为2-8mm，见图2。
本发明菌株P5的生理生化特性：好氧性+，V.P实验+，接触酶反应+，淀粉水解实验+，硫化氢实验+，葡萄糖氧化发酵+，明胶液化+，耐7％NaC+，耐50℃温度+。其中，“+”表示阳性或者能生长和利用；“-”表示阴性或者不能生长和利用。
采用CTAB法提取本发明菌株P5的总DNA，应用通用引物16S-27F和16S-1492R进行16S rDNA的PCR扩增，将测得的16S rDNA序列在NCBI上进行BLAST同源性比对，发现该序列与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的30种菌株的16S rDNA的序列同源性达到98％，其中登陆号为KF527194.1的Bacillussubtilis菌株FHGXJ1的16S rDNA的序列与本发明菌株P5的序列大小基本相同，并且二者在进化树上处于同一分支，进化距离最近。结合本发明菌株P5的形态特征及生理生化特征，进一步表本发明菌株P5为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
将本发明菌株P5接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵培养，发酵条件为：接种量3％、转速150-180r/min、温度28-30℃、时间46-52h，能得到本发明菌株P5的发酵液。该发酵液具有广谱抑菌活性，对辣椒炭疽病菌、柑橘青霉病菌、白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒白绢病菌、番茄早疫病菌等植物病原真菌具有明显的抑制作用，其中对辣椒白绢病菌菌丝生长的拮抗能力最强，抑制率达48.57％，对番茄早疫病菌菌丝生长拮抗能力最差，但抑制率仍达到21.74％，为研制新型生物植物杀菌剂提供了依据。
附图说明
图1是本发明菌株P5革兰氏染色(×100)图。
图2是本发明菌株P5的单菌落形态图。
具体实施方式
实施例1
从湖南省长沙市菜园采取新鲜辣椒，用自来水洗干净，在75％质量浓度的乙醇中浸泡3min之后，用5％质量浓度的NaClO擦拭5min，无菌水反复冲洗6次，去皮后用无菌小刀切成小块，置于无菌研钵中研磨成浆液。取5ml研磨液用无菌水稀释10倍，分别取0.1ml稀释液涂布在NA固体培养基上，28℃黑暗培养72h，挑取单菌落在相应的平板上划线分离，重复此操作直至得到纯化菌株，即得本发明菌株P5。
实施例2本发明菌株P5发酵滤液的制备
挑取一环活化好的本发明菌株P5接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180r/min、28℃条件下培养48h得到发酵原液，摇匀，于10000r/min离心10min，取上清液于无菌条件下过0.22μm无菌滤膜得到发酵滤液。
实施例3抑菌活性测定
采用平板对峙法进行拮抗实验，先于直径为90mm的培养皿中倒入约5ml PDA培养基，凝固后加入2ml上述发酵滤液,摇匀后再加入15ml PDA培养基。对照组的PDA培养基中加入2ml无菌水代替发酵滤液，然后在平板上接入直径为3mm的致病菌菌丝块，28℃黑暗培养72h，测量菌落直径，计算抑制率。抑制率＝(DCK－D实验)/DCK×100％，其中D实验为实验组菌块直径，DCK为对照组菌块直径。结果见下表1。
对峙实验结果表明，本发明菌株P5发酵滤液对供试的七种植物病原真菌都具有明显的抑制作用，其中对辣椒白绢病菌菌丝生长的拮抗能力最强，抑制率为48.57％，对番茄早疫病菌菌丝生长拮抗能力最差，但抑制率仍达到21.74％。
表1本发明菌株P5发酵滤液对七种常见植物病原真菌的拮抗作用

Claims (10)

1.一种拮抗内生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P5菌株，于2016年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016131。
2.一种发酵法制备拮抗内生菌发酵液的方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述菌株接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵培养，发酵条件为：接种量3％、转速150-180r/min、温度28-30℃、时间46-52h。
3.权利要求2所述方法制得的发酵液。
4.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制辣椒炭疽病中的应用。
5.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制柑橘青霉病中的应用。
6.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制白菜黑斑病中的应用。
7.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制油菜菌核病中的应用。
8.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制辣椒疫霉病中的应用。
9.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制辣椒白绢病中的应用。
10.权利要求1所述菌株或权利要求3所述发酵液在抑制番茄早疫病中的应用。
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