CN102690759A - 加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。该方法包括以下操作步骤：1.采集加拿大一枝黄花的茎和叶，2.茎和叶的固体培养与无菌检测，3.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养，得到加拿大一枝黄花内生真菌；所述菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。本发明明确了具有广谱抗菌活性的球毛壳菌yt03（Chaetomiumglobosumyt03）菌株的微生物学地位，通过对球毛壳菌yt03抗菌发酵液的抗菌试验发现该菌对供试六种植物病原真菌具有较为明显的抑制菌丝生长作用。

Description

加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种其发酵物具有抑制植物病原真菌的活性的微生物的分离纯化方法，即加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。 

背景技术

在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草危害，保证粮食丰产丰收，起到积极的作用。但是由于自然界生物之间相互依存、相互制约，过分依赖化学农药的毒杀作用，产生一些地区发生盲目滥施农药的现象，特别是一些残效期长和毒性大的农药使用，导致一系列食品安全、人类健康和生存环境问题。目前化学防治的危害逐步被人们所认识，研制安全、高效、环保的新型农药已成为发展的方向和研究的主题。生物农药因对人、畜低危险性，使用安全，对环境友好，不易产生抗性等优点，成为新农药产业发展的热点和重点。 

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物组织内或生活史中的某一阶段生活在植物组织内，对植物组织不引起明显变化的真菌，包括那些生活史中某一阶段能营造表生生活的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(Latent pathogens) 和菌根菌(Mycorhiza fungi) 。植物内生真菌具有明显的多样性和普遍性。在目前所有研究过内生真菌的植物中，都有其存在，少则十几种，多则近百种。植物内生真菌与宿主植物长期的共生过程中，构建了内生真菌特殊的生长环境，使得内生真菌能够产生许多与结构新颖、生理活性独特的天然化合物。具有安全、无残留、不在人畜体内积累、防治效果专一等优点，为农药先导化合物和新型生物农药的研究和应用开拓了美好前景。当前利用植物中分离的内生真菌获得生理活性物质已成为研究热点，已有多项研究表明植物内生真菌能产生新型的抑菌活性的物质。如White等从禾本科植物中分离的内生真菌枝顶孢（Acremonium coenophilum）对多种体外培养的农作物病原真菌有抑制作用。Findlay从黑云杉(Picea mariana)中分离到内生真菌(Conoplea elegantala)的液体发酵产物中分离出两个新的苯并吡咯类活性成分，对由丝核菌(Rhizoctonia spp.)和镰刀菌(Fusarium spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、恶苗病等病害有良好的防治作用。顾爱国从苦皮藤内生真菌(Fusarium proliferatum)中分离到恩镰孢菌素(eniatinns)类化合物，其对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用。 

加拿大一枝黄花（Solidgo canadensis）作为一种外来物种，繁殖力极强，传播速度快，生长优势明显，生态适应性广阔，与周围植物争阳光、争肥料，直至其它植物死亡，从而对生物多样性构成严重威胁。加拿大一枝黄花可做观赏切花、饲料、蜜源，同时可用于天然色素的生产和提炼精油。目前, 已经发现加拿大一枝黄花体内具有较强的抗氧化、自由基消除活性和多种抑菌活性的黄酮类成分。此外还有报道加拿大一枝黄花的植物浸提液对许多杂草（如光头稗和大狗尾草）及多种蔬菜（紫花苜蓿、红苋菜、小麦、大豆和棉花 ）的种子萌发及幼苗生长具有显著的化感作用。根据植物内生真菌内共生理论，加拿大一枝黄花很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的具有抗菌活性的次生代谢产物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种从中国安徽省合肥市加拿大一枝黄花 (Solidgo canadensis) 植物活体中，分离其发酵产物具有较强的抑制植物病原真菌活性的微生物，即加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。 

本发明所述加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088； 

加拿大一枝黄花内生真菌具体的分离纯化操作步骤如下：

（1）.采集加拿大一枝黄花的茎和叶；

（2）.所述茎和叶的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的茎和叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的茎和叶；将消毒后的茎和叶分别切成 0.5 cm×0.5 cm大小的茎块和叶块；接着将一部分茎块和叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；

将另一部分茎块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将茎块和叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，接着移去茎块和叶块，在温度28℃恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的茎块表面和叶块表面无菌；

（3）.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养：当步骤（2）的第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上加拿大一枝黄花的茎块和叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～10天，长出完整菌落，即为加拿大一枝黄花内生真菌；加拿大一枝黄花内生真菌的菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；

所述第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方、第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方和第三块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方均为：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min；

所述加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因系列如下：

1        TCCTCCGGCC TTATTGATAT GCTTAAGTTC AGCGGGTCTT CCTACCTGAT

51       CCGAGGTCAA CCTTGGGTTA AAAGGTGGTT TAACGGCCGG AACCCGCGGC

101      GCGACCAGAG CGAGATGTAT GCTACTACGC TCGGTGCGAC AGCGAGCCCG

151      CCACTGCTTT TCAGGGCCTG CGGCAGCCGC AGGTCCCCAA CACAAGCCCG

201      GGGGCTTGAT GGTTGAAATG ACGCTCGAAC AGGCATGCCC GCCAGAATGC

251      TGGCGGGCGC AATGTGCGTT CAAAGATTCG ATGATTCACT GAATTCTGCA

301      ATTCACATTA CTTATCGCAT TTCGCTGCGT TCTTCATCGA TGCCAGAACC

351      AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGACTTA TTCAGTACAG AAGACTCAGA

401      GAGGCCATAA ATTATCAAGA GTTTGGTGAC CTCCGGCGGG CGCCCGCGGT

451      GGGGCCCAGG GGCGCCCGGG GGGTAAACCC CGGGGCCGCC CGCCGAAGCA

501      ACGGTATAGG TAACGTTCAC AATGGTTTAG GGAGTTTTGC AACTCTGTAA

551      TGATCCCTCC GCTGGTTCAC CAACGGAGAC CTTGTTACGA CTTTTTACTT

601      CC

加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。

以ITS基因序列同源性为基础构建形成包括球毛壳yt03菌株在内的相关真菌的***发育树，结果看出，Chaetomium globosum yt03与Chaetomium globosum ATCC 6205的ITS序列同源达到100%。没有碱基的差别。 

加拿大一枝黄花内生真菌菌落培养特征 

加拿大一枝黄花内生真菌在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上温度25℃培养7天，菌落直径达到6.6cm，质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色。见图1。

加拿大一枝黄花内生真菌形态特征 

加拿大一枝黄花内生真菌的子囊壳散生或群生，球形或近球形，大小差异较大，大者直径可达400 μm，小者70 μm，呈黑褐色；顶毛无隔膜，黑褐色，直或螺旋状弯曲，直径3-4μm，表面有细刺，见图2。子囊早期破裂释放出大量子囊孢子，子囊孢子通常呈亚球形或柠檬形，6-10×4-7μm，壁光滑。见图3。

加拿大一枝黄花内生真菌的分子生物学特征 

采用分子生物学PCR技术，DNA测序分析，内生真菌的ITS基因由602个碱基组成。

加拿大一枝黄花内生真菌的DNA序列与Genbank中的相关序列比对了602个碱基，同源性为100%。以ITS序列为基础构建的***发育树，球毛壳菌yt03与Chaetomium globosum ATCC 6205（EF524036）的进化距离最近。见图4，采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示球毛壳菌yt03与相关种的ITS rDNA***发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值。 

加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的抗菌试验：

1.    植物病原真菌：

辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），番茄枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica)，苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），枣炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum)，小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）。

2.    内生真菌的培养： 

将加拿大一枝黄花内生真菌接入250毫升三角瓶中（装有50毫升液体培养基），置于（28±2）℃摇床上（160转/分钟）旋转培养7天，无菌条件下过滤除去菌丝体，发酵液样品备用。

3.    病原微生物的培养 

取病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在（28±2）℃恒温箱中培养5天。

4.    抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性 

在100毫升的无菌三角瓶中加入6毫升抗菌发酵液样品和54 毫升马铃薯葡萄糖琼脂无菌融化的培养基，摇匀，分别各取10毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入1个供试病原菌菌饼（直径为6毫米），菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养96小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：   

表1：本发明所述的球毛壳菌yt03对六种植物病原微生物的抗菌结果

本发明对加拿大一枝黄花内生真菌进行分离，并明确了具有广谱抗菌活性的球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03）菌株的微生物学地位，通过对球毛壳菌yt03抗菌发酵液的抗菌试验发现该菌对供试六种植物病原真菌（即辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），番茄枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica)，苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），枣炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum)，小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum））具有较为明显的抑制菌丝生长作用，见表1。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害新型农用抗生素类天然成分。

附图说明

图1为本发明所述的球毛壳菌yt03的菌落图片（在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上）。 

图2为本发明所述的球毛壳菌yt03的显微图（子囊壳）。 

图3为本发明所述的球毛壳菌yt03的显微图（子囊孢子）。 

图4为本发明所述的球毛壳菌yt03同源性的***发育树图。 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。 

实施例： 

本发明所述加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088；

加拿大一枝黄花内生真菌的具体分离纯化操作步骤如下：

（1）.采集加拿大一枝黄花的茎和叶；

（2）.茎和叶的固体培养与无菌检测：将步骤（1）采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的茎和叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的茎和叶；用消毒手术刀将消毒后的茎和叶分别切成 0.5 cm×0.5 cm大小的茎块和叶块；接着将一部分茎块和叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；

将另一部分茎块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将茎块和叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，接着移去茎块和叶块，在温度28℃恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的茎块表面和叶块表面无菌；

（3）.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养：当步骤（2）的第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上加拿大一枝黄花的茎块和叶块周围长出菌丝时，见图1，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～10天，长出完整菌落，即为加拿大一枝黄花内生真菌；加拿大一枝黄花内生真菌的菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；

所述第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方、第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方和第三块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方均为：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min；

加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因序列如下：

1        TCCTCCGGCC TTATTGATAT GCTTAAGTTC AGCGGGTCTT CCTACCTGAT

51       CCGAGGTCAA CCTTGGGTTA AAAGGTGGTT TAACGGCCGG AACCCGCGGC

101      GCGACCAGAG CGAGATGTAT GCTACTACGC TCGGTGCGAC AGCGAGCCCG

151      CCACTGCTTT TCAGGGCCTG CGGCAGCCGC AGGTCCCCAA CACAAGCCCG

201      GGGGCTTGAT GGTTGAAATG ACGCTCGAAC AGGCATGCCC GCCAGAATGC

251      TGGCGGGCGC AATGTGCGTT CAAAGATTCG ATGATTCACT GAATTCTGCA

301      ATTCACATTA CTTATCGCAT TTCGCTGCGT TCTTCATCGA TGCCAGAACC

351      AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGACTTA TTCAGTACAG AAGACTCAGA

401      GAGGCCATAA ATTATCAAGA GTTTGGTGAC CTCCGGCGGG CGCCCGCGGT

451      GGGGCCCAGG GGCGCCCGGG GGGTAAACCC CGGGGCCGCC CGCCGAAGCA

501      ACGGTATAGG TAACGTTCAC AATGGTTTAG GGAGTTTTGC AACTCTGTAA

551      TGATCCCTCC GCTGGTTCAC CAACGGAGAC CTTGTTACGA CTTTTTACTT

601      CC

加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。

Claims (1)

1.加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法，其特征在于：所述加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088；

具体的分离纯化操作步骤如下：

（1）.采集加拿大一枝黄花的茎和叶；

（2）.所述茎和叶的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的茎和叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的茎和叶；将消毒后的茎和叶分别切成 0.5 cm×0.5 cm大小的茎块和叶块；接着将一部分茎块和叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；

将另一部分茎块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将茎块和叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，接着移去茎块和叶块，在温度28℃恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的茎块表面和叶块表面无菌；

（3）.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养：当步骤（2）的第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上加拿大一枝黄花的茎块和叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～10天，长出完整菌落，即为加拿大一枝黄花内生真菌；加拿大一枝黄花内生真菌的菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；

所述第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方、第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方和第三块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方均为：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min；

所述加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因系列如下：

1        TCCTCCGGCC TTATTGATAT GCTTAAGTTC AGCGGGTCTT CCTACCTGAT

51       CCGAGGTCAA CCTTGGGTTA AAAGGTGGTT TAACGGCCGG AACCCGCGGC

101      GCGACCAGAG CGAGATGTAT GCTACTACGC TCGGTGCGAC AGCGAGCCCG

151      CCACTGCTTT TCAGGGCCTG CGGCAGCCGC AGGTCCCCAA CACAAGCCCG

201      GGGGCTTGAT GGTTGAAATG ACGCTCGAAC AGGCATGCCC GCCAGAATGC

251      TGGCGGGCGC AATGTGCGTT CAAAGATTCG ATGATTCACT GAATTCTGCA

301      ATTCACATTA CTTATCGCAT TTCGCTGCGT TCTTCATCGA TGCCAGAACC

351      AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGACTTA TTCAGTACAG AAGACTCAGA

401      GAGGCCATAA ATTATCAAGA GTTTGGTGAC CTCCGGCGGG CGCCCGCGGT

451      GGGGCCCAGG GGCGCCCGGG GGGTAAACCC CGGGGCCGCC CGCCGAAGCA

501      ACGGTATAGG TAACGTTCAC AATGGTTTAG GGAGTTTTGC AACTCTGTAA

551      TGATCCCTCC GCTGGTTCAC CAACGGAGAC CTTGTTACGA CTTTTTACTT

601      CC

加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。

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