CN103421722B

CN103421722B - 一株荔枝内生枯草芽孢杆菌及其生物制剂与应用

Info

Publication number: CN103421722B
Application number: CN201310401270.9A
Authority: CN
Inventors: 姜子德; 徐丹丹; 江立群; 习平根; 李敏慧; 许再元; 陈金红; 黄陆浩; 钟瑾
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103421722A

Abstract

本发明属于生物农药领域，公开了一株荔枝内生枯草芽孢杆菌及其生物制剂与应用。将该荔枝内生株枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NMB-8，于2013年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号CCTCC No：M2013376。该菌株来源于荔枝内生细菌，能很好的在荔枝果实表面定殖；对荔枝霜疫霉病菌具有强烈的抑制作用，具有优异的防治荔枝霜疫霉病的生防作用，而且该生物来源环保无毒性，将其喷施到荔枝表面用于病害的防治，对生态环境影响小，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠；培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

Description

一株荔枝内生枯草芽孢杆菌及其生物制剂与应用

技术领域

本发明属于生物农药领域，特别涉及一株荔枝内生枯草芽孢杆菌及其生物制剂与应用。

背景技术

荔枝（Litchi chinensis Sonn）是重要的亚热带经济作物，果实味佳、色美、营养丰富，素有“中华之珍果”的美称，其经济价值高，是我国在国际市场上最有竞争力的果品之一。荔枝在采摘、运销及贮藏过程中，因腐烂造成了巨大的经济损失，而采后病害是引起腐烂的主要原因。引起果实腐烂变质的主要病害有霜疫霉病、炭疽病、酸腐病等，其中由荔枝霜疫霉病菌（Peronophythoralitchi Chen ex Ko et al.）引起的霜疫霉病是荔枝采后贮藏保鲜中最主要的病害。然而目前，生产上对该病害的控制主要以化学药剂防治为主。

芽孢杆菌属（Bacillus）是一种广谱性的拮抗细菌，有多个芽孢杆菌亚群在植物病害生物防治中具有重要的地位。杨少波等报道了多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）产生的生物活性物质能对尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、黑曲霉（Aspergillus niger）等病原菌有显著地拮抗作用，陈海英等筛选到一株多粘类芽孢杆菌对瓜类炭疽病菌、水稻纹枯病菌等真菌有较好的抑菌作用，袁军等报道了短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）对马铃薯环腐病菌有显著的抑制作用。对于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），范青等报道了该菌对采后柑桔果实青、绿霉病有显著地抑制效果，孔建等报道了该菌对棉枯萎等多种土传镰刀菌和苹果轮纹病等的抑菌活性，王雅平等报道了该菌对小麦赤霉病菌的生防作用，Baker等报道了该菌对豆类植物锈病有显著地生防作用。

因此，枯草芽孢杆菌作为一类重要的自然资源，已引起国内外研究者的广泛关注，具有开发生物农药的潜力。

发明内容

为了克服上述现有技术防治荔枝霜疫霉病的缺点与不足，开发枯草芽孢杆菌的应用，本发明的首要目的在于提供一株以荔枝果实内微生物为筛选对象，分离得到的对荔枝霜疫霉病菌有显著抑制作用的荔枝内生枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NMB-8，为荔枝霜疫霉病的生物防治奠定基础；另外，本发明从荔枝上筛选到的拮抗内生菌，将其用于荔枝病害的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而保持了种群的稳定性，另外由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝表面用于病害的防治，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。

本发明另一目的在于提供一种基于上述荔枝内生枯草芽孢杆菌制备得到的生物制剂。

本发明再一目的在于提供上述荔枝内生枯草芽孢杆菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一株荔枝内生枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NMB-8，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013376，保藏时间为2013年8月19日。

所述的荔枝内生枯草芽孢杆菌在LB培养基上30℃培养24h，菌落表面粗糙不透明，常形成皱醭，污白色或微黄色。

一种生物制剂，基于上述荔枝内生枯草芽孢杆菌制备得到。

所述的生物制剂由荔枝内生枯草芽孢杆菌经液体发酵制备得到，优选包含以下步骤：将荔枝内生枯草芽孢杆菌接种至LB培养液中培养，即可获得生物制剂。

所述LB培养液的pH值为7.0。

所述的培养指在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养24h。

上述生物制剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

上述荔枝内生枯草芽孢杆菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

1、本发明得到的枯草芽孢杆菌来源于荔枝内生细菌，能很好地在荔枝果实表面定殖；另外本发明从荔枝上筛选到的拮抗内生菌，将其用于荔枝病害的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝表面用于病害的防治，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。

2、本发明的枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉病菌具有强烈的抑制作用，具有优异的防治荔枝霜疫霉病的生防作用，而且该生物来源环保无毒性，对生态环境影响小。

3、本发明得到的枯草芽孢杆菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌NMB-8在LB培养基上的单菌落图。

图2为枯草芽孢杆菌NMB-8对荔枝霜疫霉病菌的抑制作用效果图，其中，A为枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉病菌的抑制图，B为荔枝霜疫霉病菌正常生长菌落形态。

图3为枯草芽孢杆菌NMB-8对荔枝霜疫霉病菌菌丝影响的结果图，其中，A为荔枝霜疫霉病菌正常菌丝，B为荔枝霜疫霉病菌畸形菌丝。

图4为分离到的不同枯草芽孢杆菌菌株对荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制效果图。

图5为枯草芽孢杆菌NMB-8及其生物制剂对荔枝霜疫霉的防治效果图，其中，A为LB培养液，B为清水对照，C为枯草芽孢杆菌菌悬液，D为枯草芽孢杆菌菌悬液+荔枝霜疫霉病菌，E为枯草芽孢杆菌滤液+荔枝霜疫霉病菌，F为荔枝霜疫霉病菌。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：荔枝内生枯草芽孢杆菌的分离、纯化和保藏

（1）LB培养基的配置：称取胰蛋白胨（Tryptone，Oxoid LTD LP0042，England）10g，酵母提取物（Yeast extract，Oxoid LTD LP0021，England）5g，氯化钠（NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318）10g，加水1000mL搅拌均匀，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。

（2）荔枝内生枯草芽孢杆菌的分离、纯化：

用于分离的荔枝果实样品分别采自华南农业大学园艺学院荔枝基地、深圳市麒麟山庄荔枝园和深圳市宝安农科果园，所选的荔枝品种为糯米糍、妃子笑和桂味三大主栽品种，分为三组。

内生细菌的分离方法主要参照何红等（何红,蔡学清,关雄,胡方平.辣椒内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-2和BS-1防治辣椒炭疽病研究.植物病理学报,2003,33(2):170-173.）的方法并稍作修改，具体操作如下：将三组健康的果实分别用自来水冲洗干净，晾干水分后称取果实34g，用体积百分数为70%的酒精浸泡2～3min，再用5%次氯酸钠表面消毒2～10min，最后用无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分后将样品转入无菌研钵中，加入10mL无菌水碾碎后，静止放置15min，各取100μL涂LB平板，每个处理3个重复，30℃培养48～72h后，观察结果。

采取漂洗液检验法（Schulz et al,1993.）进行检验组织表面的消毒效果，取0.2mL的最后一次漂洗消毒材料的漂洗液涂布于LB固体平板上进行培养，观察培养有无菌落长出，若无菌落出现，证明材料表面灭菌彻底，否则分离结果不能使用。

分离得到7株菌株，将纯化所得菌株进行ITS序列分析，确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），分别命名为枯草芽孢杆菌NYB-3、枯草芽孢杆菌NFB-35、枯草芽孢杆菌NFB-25、枯草芽孢杆菌NFB-21、枯草芽孢杆菌NMB-8、枯草芽孢杆菌NFB-28、枯草芽孢杆菌NOB-1。所述枯草芽孢杆菌菌株NMB-8分离自深圳市麒麟山庄荔枝园的糯米糍果实，其序列如下所示：与GenBank中登陆号为EU346662.1的Bacillus subtilis同源性达98%，证实其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）NMB-8。序列片段如下：

TGGGAGGGACTTGTTCGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTACTTAGCGTGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTGCCTTACACAGAGCTTTACGATCCGAAAACATCATACTCACGCGTCGTGCTCGTCAGACTTCGTCATTGCGGAAAATACCTAATGGACTGACCCTCGTAAGGATTCTGGACA。

枯草芽孢杆菌NMB-8在LB培养基上30℃培养，培养24小时，菌落表面粗糙不透明，常形成皱醭，污白色或微黄色（见图1）。

（3）枯草芽孢杆菌NMB-8的保藏：将该菌株于2013年8月19日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2013376。

实施例2：对峙培养法测定枯草芽孢杆菌的活性

（1）LB培养基的制备同实施例1；LB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与LB固体培养基的配方相同，将称得的药剂充分溶解后分装于锥形瓶（每瓶100mL培养液），加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

（2）胡萝卜培养基的制备：称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶（每瓶100mL培养液），121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

（3）枯草芽孢杆菌单菌落的制备：将枯草芽孢杆菌划线接种至LB培养基平板上活化培养24h后，挑取单菌落进行划线保存。

（4）枯草芽孢杆菌菌悬液（生物制剂）和滤液的制备：取步骤（3）制备得到的枯草芽孢杆菌单菌落接入步骤（1）制备得到的LB培养液锥形瓶中，置于30℃，摇床速率为200rpm下培养24h，即可得到枯草芽孢杆菌菌悬液；将获得的菌悬液于12,000rpm离心10min，取上清液，再用0.2μm的过滤器滤除菌体，获得枯草芽孢杆菌滤液。

（5）荔枝霜疫霉病菌的培养及其孢子囊悬浮液的制备：接种编号为肇庆10的荔枝霜疫霉病菌至胡萝卜平板上培养7d后，用直径为5mm的打孔器打取菌落边缘的菌丝接种至新鲜的胡萝卜平板上置于25℃下培养7d后，在平板中加入无菌水冲洗孢子囊配制成所需浓度的孢子囊悬浮液。

（6）活性测定：

①枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉病菌生长的抑制作用测定：将步骤（3）制得的枯草芽孢杆菌划线接种到胡萝卜培养基平板的中央，在距该菌饼3cm处接种荔枝霜疫霉病菌的菌饼，实验中以不接种枯草芽孢杆菌为对照，3个重复，置于25℃下恒温培养，当对照菌落直径达到6cm时，测量抑菌带宽度，观察抑菌带边缘和对照的荔枝霜疫霉病菌的菌丝形态，结果如图2和图3所示。

②枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制作用的测定：将实施例1分离得到的不同枯草芽孢杆菌菌株接种至步骤（1）制备得到的LB液体培养基中摇菌，按照步骤（4）配制成浓度为10⁸cfu/mL的枯草芽孢杆菌菌悬液，将菌悬液、滤液分别与步骤（5）制得的孢子囊悬浮液浓度为4×10⁴个/ml的荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液等体积混合，并以无菌水、LB与孢子囊悬浮液等体积混匀作为对照。取混合液100μL滴到无菌的凹面载片上，25℃保湿培养，4h后取出计算孢子囊的萌发率，结果见图4。

抑制率（%）=（对照孢子囊萌发率-处理孢子囊萌发率）/对照孢子囊萌发率×100

结果分析：由图2、图3和图4可知，荔枝内生枯草芽孢杆菌NMB-8对荔枝霜疫霉病菌的生长具有明显的抑制作用，且造成了荔枝霜疫霉病菌菌丝的畸形，另外不同菌株对荔枝霜疫霉病菌的孢子囊萌发率的抑制效果不同，其中本发明得到的菌株NMB-8的菌悬液及其滤液均对荔枝霜疫霉病菌的孢子囊萌发有极显著地抑制作用，抑菌率分别为97.4%和88.6%，高于其他的枯草芽孢杆菌菌株。

实施例3：荔枝内生枯草芽孢杆菌NMB-8防治荔枝霜疫霉病

（1）LB培养基的制备同实施例1。胡萝卜培养基和LB液体培养基的制备同实施例2。

（2）荔枝内生枯草芽孢杆菌NMB-8菌悬液的制备、荔枝霜疫霉病菌培养及其孢子囊悬浮液的制备同实施例2。

（3）挑取成熟度一致、大小均匀的荔枝健康果实，在流水中冲洗干净后，晾干，分别将荔枝果实在步骤（2）配制的枯草芽孢杆菌生物制剂及其过滤液中浸泡大约5min，取出至液滴不再滴下，放入无菌保鲜盒中保湿处理。将上述处理接种1d后，采用喷雾接种荔枝霜疫霉孢子囊的方法（10⁴个/mL），接种后于分别置于室温25℃和4℃（荔枝的储藏温度）培养，定期观察果实的发病情况。以清水处理、LB培养液处理、只接枯草芽孢杆菌生物制剂处理和只接荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液处理作为对照。每个处理各选荔枝果实30颗，设置3个重复。

在平均温度25℃、相对湿度80%的条件下进行的室内接种试验，在接种36h后接有荔枝霜疫霉病菌的对照开始发病，而接种有枯草芽孢杆菌生物制剂和枯草芽孢杆菌滤液的处理暂未发病；接种处理3d后，病菌对照的发病率为97.3%，而枯草芽孢杆菌生物制剂及其滤液处理过的发病率仅为14.4～33.3%，防治效果达到51.6～96%。

在平均温度4℃、相对湿度80%的条件下进行的室内接种试验，在储藏培养20d后的实验结果如表1和图5。

表1枯草芽孢杆菌对荔枝贮藏期霜疫霉病的生防效果（4℃）

注：CK为清水对照；采用Duncan新复极差法进行方差分析，同组数据里相同字母表示差异不显著（P=0.05）。

由表1可见，经过枯草芽孢杆菌生物制剂及其滤液处理过的荔枝果实的发病率和病情指数均明显比只接荔枝霜疫霉病菌的对照低，这表明枯草芽孢杆菌生物制剂及其滤液对荔枝采后霜疫霉病均具有较为明显的防治作用。同时，仅接有生防枯草芽孢杆菌生物制剂或其滤液的处理并不引起荔枝发病，说明该菌株不是荔枝的病原菌，可以作为防治荔枝霜疫霉病的采后施用菌株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株荔枝内生枯草芽孢杆菌，其特征在于，将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NMB-8，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013376，保藏时间为2013年8月19日。

2.一种生物制剂，其特征在于：基于权利要求1所述的荔枝内生枯草芽孢杆菌制备得到。

3.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于：由荔枝内生枯草芽孢杆菌经液体发酵制备得到，具体包含以下步骤：将荔枝内生枯草芽孢杆菌接种至LB培养液中培养，即可获得生物制剂。

4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述LB培养液的pH值为 7.0。

5.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述的培养指在28～30 ℃，摇床震荡速率为180～200 rpm下培养24 h。

6.根据权利要求2～5任一项所述的生物制剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

7.权利要求1所述的荔枝内生枯草芽孢杆菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。