CN105837699A

CN105837699A - 一种植物乳杆菌胞外多糖及其用于拮抗蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的用途

Info

Publication number: CN105837699A
Application number: CN201610202595.8A
Authority: CN
Inventors: 魏华; 张志鸿; 许恒毅; 何丽华; 陶雪莹; 徐锋; 江美玲
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Ningxia Wodidi Water And Fertilizer Technology Co ltd; Shanghai Ruishenglian Information Technology Co ltd
Priority date: 2016-04-05
Filing date: 2016-04-05
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2036-04-05
Also published as: CN105837699B

Abstract

本发明提供了一种植物乳杆菌胞外多糖及其用于拮抗蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的用途。该多糖以制备方法表征，由于匹配了温和的纯化条件，因此其分子结构得到有效保留，所得产物结构成分单一、结构明确，同时具有较高的纯度和收率。此外，本发明通过实验手段意外发现，在该植物乳杆菌胞外多糖存在条件下，蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞的毒性受到明显抑制，具体表现为小肠上皮细胞活力得到有效保持，而且这种保护作用具有一定的广谱性。基于该植物乳杆菌胞外多糖的以上新性质，本发明确定了其作为蜡样芽孢杆菌肠毒素拮抗剂、乃至蜡样芽孢杆菌肠毒素中毒治疗药物的新用途，其疗效确切，起效快速，具有广阔的应用前景。

Description

一种植物乳杆菌胞外多糖及其用于拮抗蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，进一步涉及微生物代谢产物的分离纯化及其医药用途，具体涉及一种植物乳杆菌胞外多糖及其用于拮抗蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的用途。

背景技术

乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，泛指乳酸菌代谢过程中分泌到细胞外的糖类化合物。由于乳酸菌胞外多糖具有良好的流变性、而且能赋予发酵食品良好的口感和风味，因此可作为食品工业的胶凝剂、稳定剂、保鲜剂和乳化剂等，目前已广泛用于乳制品、饮料、糕点、糖果、冰激凌等食品的生产。此外，有研究表明EPS具有抗肿瘤、降低胆固醇、延缓衰老、调节肠道菌群平衡等作用，因此EPS可能是乳酸菌益生作用的物质基础之一。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属同型发酵乳酸菌，革兰氏阳性，兼性好氧。该菌株被证明具有耐酸、耐胆盐、抗致病菌、调节肠道菌群平衡的作用，同时有研究表明上述耐酸能力及益生作用可能与其胞外多糖有关。植物乳杆菌胞外多糖呈混杂形式存在，并非性质均一的单一化合物；而多糖作为分子结构复杂且庞大的糖类物质，无论由糖单位种类和次序所决定的一级结构变化，还是由氢键及其他非共价作用所决定的次级结构变化，均可造成其理化性质的差异，因此为研究植物乳杆菌多糖的性质，首先应当明确其物质分型、获得不同类别植物乳杆菌胞外多糖的纯品，从而明确其物质基础，进而探讨不同植物乳杆菌胞外多糖的性质。

蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见致病菌，能够引起的食物中毒类型主要分为腹泻和呕吐症状，其中腹泻主要与菌株分泌的肠毒素相关，而呕吐主要由菌株产生呕吐毒素引起，有文献报道，蜡样芽孢杆菌肠毒素能导致真核细胞死亡。现有技术中对蜡样芽孢杆菌肠毒素中毒病例的治疗主要分为多通过抗生素疗法和对症治疗，其中对症治疗主要在于缓解症状、维持机体电解质平衡；而抗生素疗法尽管可以直接杀灭微生物，但由于该疾病的直接抗原物质是蜡样芽孢杆菌的代谢产物(肠毒素)而非蜡样芽孢杆菌本身，因此该疗法起效较慢，治疗效果不理想。现有技术中，直接降低蜡样芽孢杆菌肠毒素致病力的疗法或药物未见报道。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种植物乳杆菌胞外多糖，以解决现有技术中缺乏上述植物乳杆菌胞外多糖的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中，植物乳杆菌胞外多糖作为一种多糖混合物，其中成分不明确。

本发明要解决的再一技术问题是该植物乳杆菌胞外多糖难以制备。

本发明要解决的又一技术问题是常规方法所制备的该植物乳杆菌胞外多糖，其纯度较低。

本发明同时提供了上述植物乳杆菌胞外多糖用于拮抗蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的用途，以解决现有技术中难以直接降低蜡样芽孢杆菌肠毒素致病力的技术问题。

本发明要解决的又一技术问题是该植物乳杆菌胞外多糖的用途较为局限。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种植物乳杆菌胞外多糖，所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8～14KDa截留分子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；

3)以含有40～60mM Tris-HCl、5～15mM MgSO₄·7H₂O的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2～3μg/mL，水解；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40～60μg/mL，酶解；

5)而后加入三氯乙酸至终浓度10～15％(w/v)，20～40min后固液分离取上清，透析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。

作为优选，步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵22～26h时的发酵液；更优的，发酵时间是24h。

作为优选，步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5～2.5倍；更优的，乙醇加入量是所述上清液体积的2倍.

作为优选，步骤3)中粗多糖的终浓度为4～6mg/L；更优的，是5mg/L。

作为优选，步骤3)所述水解是在35～39℃条件下持续4～8h；更优的，是在 37℃条件下持续6h。

作为优选，步骤4)所述酶解是在35～39℃条件下持续16～20h；更优的，是在37℃条件下持续18h。

作为优选，步骤5)透析前，先调节上清液pH至4～5，再透析；更优的，调节pH至4.5；最优的，所述调节是利用10mol/L的NaOH溶液实现的。

在以上任一技术方案基础上优选的，步骤1)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。此时该多糖用于人体具有确切的安全保证

在以上任一技术方案基础上优选的，所述的固液分离，是以10000～14000rpm的转速离心15～25min。

在以上任一技术方案基础上优选的，透析的持续时间是60～84h；更优的，透析的持续时间是72h。在此基础上进一步优选的，透析的过程中每天更换透析袋外的超纯水2次。

作为优选，步骤1)所述的发酵液，是以MRS培养基发酵获得的。

作为优选，步骤1)所述的发酵液，是在35～39℃条件下发酵获得的；更优的发酵温度为37℃。

作为优选，步骤2)所述的干燥是冷冻干燥。

作为优选，步骤3)所述粗多糖溶解液的pH值为7.2～7.8；更优的，其pH为7.5。

作为优选，步骤5)中三氯乙酸加入后的终浓度为12％(w/v)，加入三氯乙酸后持续30min再进行固液分离。

本发明同时提供了上述植物乳杆菌胞外多糖用于抑制蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞毒性的应用。

在该应用基础上优选的，所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是细胞毒素K。所述细胞毒素K是指由蜡样芽胞杆菌产生的、通常称之为CytK的毒素。

在该应用基础上优选的，所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是溶血性肠毒素HBL。

在该应用基础上优选的，所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是非溶血性肠毒素Nhe。

在该应用基础上优选的，所述抑制蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞毒性是缓解在蜡样芽孢杆菌肠毒素存在条件下小肠上皮细胞活力降低趋势。

在该应用基础上优选的，所述应用是将植物乳杆菌胞外多糖溶液在蜡样芽孢杆菌肠毒素存在条件下与小肠上皮细胞直接接触；更优的，所述植物乳杆菌胞外多糖溶液的浓度是0.5～1.5mg/mL；最优的，所述植物乳杆菌胞外多糖溶液的浓度是1mg/mL。

本发明同时提供了上述植物乳杆菌胞外多糖用于制备蜡样芽孢杆菌肠毒素中毒治疗药物的应用。

作为优选，所述药物的剂型是口服剂。

在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC M 2014170的生物材料的保藏单位是“中国典型培养物保藏中心”，其地址为“湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内”，该生物材料的保藏日期为2014年4月28日，其分类命名是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

在以上技术方案中，抑制蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞毒性，可以是蜡样芽孢杆菌肠毒素与本发明植物乳杆菌胞外多糖共孵育小肠上皮细胞；当然亦可以是在蜡样芽孢杆菌肠毒素存在条件下向其中加入本发明植物乳杆菌胞外多糖，从而抑制其对小肠上皮细胞的毒性。在以上技术方案中，所述细胞活力是指存活细胞的数量水平，并不一定以活细胞的具体数目或细胞密度进行表征，而是可以通过本技术领域中用于反应细胞活力的任一参数进行评价；本发明中，用于评价细胞活力的指标可以选择MTT法。

本发明所提供的植物乳杆菌胞外多糖，以乙醇沉淀法直接于植物乳杆菌发酵液中沉淀多糖，而后经透析去除小分子杂质，并先后利用酶解方法去除核酸及蛋白杂质，再利用三氯乙酸沉淀杂蛋白，固液分离取上清后执行透析，从而获得纯化的目标多糖。通过以上制备方法所表征的多糖，由于匹配了温和的纯化条件因此其分子结构得到有效保留，所得产物结构成分单一、结构明确，同时具有较高的纯度和收率。

此外，本发明通过实验手段意外发现，在该植物乳杆菌胞外多糖存在条件下，蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞的毒性受到明显抑制，具体表现为小肠上皮细胞活力得到有效保持，而且这种保护作用具有一定的广谱性。基于该植物乳杆菌胞外多糖的以上新性质，本发明确定了其作为蜡样芽孢杆菌肠毒素拮抗剂、乃至蜡样芽孢杆菌肠毒素中毒治疗药物的新用途，其疗效确切，起效快速，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中，在孔板上以MTT法检测三种蜡样芽孢杆菌上清液孵育后的小肠上皮细胞的显色图。

图2是本发明实施例1中，胞外多糖不存在条件下，三株蜡样芽孢杆菌上清液分别孵育小肠上皮细胞后，细胞活力的MTT法检测结果。

图3是本发明实施例1中，胞外多糖存在条件下，三株蜡样芽孢杆菌上清液分别孵育小肠上皮细胞后，细胞活力的MTT法检测结果。

在以上图1～图3中：Nhe/HBL/CytK部分是同时产Nhe、HBL、CytK三种毒素的菌株ATCC14579；HBL/CytK部分是同时产HBL、CytK两种毒素的菌株ATCC10987；Nhe部分是产Nhe毒素的一株蜡样芽孢杆菌，其内部编号为JX0061LY。

图4是本发明实施例1中，以不同浓度的蜡样芽孢杆菌ATCC14579上清液孵育小肠上皮细胞后，细胞活力的MTT法检测结果。其中实验组是蜡样芽孢杆菌ATCC14579上清液、本发明植物乳杆菌胞外多糖二者共孵育小肠上皮细胞的实验结果；对照组是蜡样芽孢杆菌ATCC14579上清液单独孵育小肠上皮细胞的实验结果。

图5是本发明实施例1中，以不同浓度的蜡样芽孢杆菌ATCC10987上清液孵育小肠上皮细胞后，细胞活力的MTT法检测结果。其中实验组是蜡样芽孢杆菌ATCC10987上清液、本发明植物乳杆菌胞外多糖二者共孵育小肠上皮细胞的实验结果；对照组是蜡样芽孢杆菌ATCC10987上清液单独孵育小肠上皮细胞的实验结果。

图6是本发明实施例1中，以不同浓度的蜡样芽孢杆菌JX0061LY上清液孵育小肠上皮细胞后，细胞活力的MTT法检测结果。其中实验组是蜡样芽孢杆菌JX0061LY上清液、本发明植物乳杆菌胞外多糖二者共孵育小肠上皮细胞的实验结果；对照组是蜡样芽孢杆菌JX0061LY上清液单独孵育小肠上皮细胞的实验结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

1.1植物乳杆菌胞外多糖的提取、纯化

植物乳杆菌在MRS培养基中37℃厌氧培养24h，12000×g离心20min，弃沉淀，上清用截留分子量为8000～14000Da的透析袋透析3天，每天换超纯水2次。冷冻干燥后，用50mM Tris-HCl、10mM MgSO₄·7H₂O(pH7.5)对粗多糖进行溶解(终浓度为5mg/mL)，采用终浓度为2.5μg/mL的核酸酶DNAse type-I(D5025，Sigma)在37℃对核酸进行水解6h。水解后的粗多糖采用终浓度为50μg/mL的蛋白酶Pronase E(165921，Roche)在37℃对蛋白质进行酶解18h。蛋白酶处理后，用终浓度为12％的三氯乙酸处理30min，12000×g离心20min获得的上清需调节pH至4.0～5.0，继续透析3天，每天换水2次。

1.2不同蜡样芽孢杆菌所产肠毒素对Caco-2细胞活力的影响

取100μL Caco-2细胞(104个)至96孔细胞培养板，5％CO₂条件下37℃培养至形成单层贴壁细胞(约12h)。对三株蜡样芽孢杆菌的肠毒素进行2倍七个梯度稀释(用培养基DMEM稀释)，用三株菌的同一浓度的肠毒素分别对单层细胞进行处理，每个浓度重复三次。其中实验组再继续添加20μL胞外多糖溶液(终浓度为1mg/mL)。5％CO₂条件下37℃孵育6h。添加终浓度为1mg/mL的MTT(0.5％)，在5％CO₂条件下37℃孵育4h，轻轻吸掉上清，接着每孔加入150μL二甲基亚砜，慢速振荡10min，用酶标仪测定三株蜡样芽孢杆菌的肠毒素处理细胞后在490nm的吸光值，结果如图2、图3所示。

由图2、3均可以发现，随着毒素浓度的降低，细胞活力升高，说明细胞活力和毒素的浓度有关，而且图3升高趋势更为明显，体现出以上植物乳杆菌胞外多糖对蜡样芽孢杆菌肠毒素毒性的拮抗作用。

1.3以上制备的植物乳杆菌胞外多糖对Caco-2细胞活力保护作用

取100μL Caco-2细胞(104个)至96孔细胞培养板，5％CO₂条件下37℃培养至形成单层贴壁细胞(约12h)。实验分成对照组和实验组，对照组分别用不同梯度稀释的肠毒素对细胞进行诱导处理，实验组分别用不同梯度稀释的肠毒素处理的同时添加20μL终浓度为1mg/mL胞外多糖溶液。5％CO₂条件下37℃孵育6h。添加终浓度为1mg/mL的MTT(0.5％)，在5％CO₂条件下37℃孵育4h，轻轻吸掉上清，接着每孔加入150μL二甲基亚砜，慢速振荡10min，用酶标仪测定细胞在不同浓度毒素的处理下490nm的吸光值变化，结果如图4～6所示。

由图4～6均可以发现，存在胞外多糖的实验组的细胞活力显著高于不存在胞外多糖的对照组。这表明本发明植物乳杆菌胞外多糖对蜡样芽孢杆菌肠毒素的毒性具有确切的抑制作用，而且这种抑制作用具有一定的广谱性。

实施例2

一种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8KDa截留分子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；

3)以含有40mM Tris-HCl、5mM MgSO₄·7H₂O的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2μg/mL，水解；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40μg/mL，酶解；

5)而后加入三氯乙酸至终浓度10％(w/v)，20min后固液分离取上清，透析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵22h时的发酵液。步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5倍。步骤3)中粗多糖的终浓度为4mg/L。步骤3)所述水解是在35℃条件下持续4h。步骤4)所述酶解是在35℃条件下持续16h。步骤5)透析前，先调节上清液pH至4，再透析。

实施例3

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以14KDa截留分子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；

3)以含有60mM Tris-HCl、15mM MgSO₄·7H₂O的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度3μg/mL，水解；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度60μg/mL，酶解；

5)而后加入三氯乙酸至终浓度15％(w/v)，40min后固液分离取上清，透析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵26h时的发酵液。步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的2.5倍。步骤3)中粗多糖的终浓度为6mg/L。步骤3)所述水解是在39℃条件下持续8h。步骤4)所述酶解是在39℃条件下持续20h。步骤5)透析前，先调节上清液pH至5，再透析。

实施例4

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以10～12KDa截留分子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；

3)以含有45mM Tris-HCl、8mM MgSO₄·7H₂O的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2.5μg/mL，水解；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度45μg/mL，酶解；

5)而后加入三氯乙酸至终浓度13％(w/v)，25min后固液分离取上清，透析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的2.2倍。步骤3)所述水解是在38℃条件下持续5h。步骤5)透析前，先调节上清液pH至4.7，再透析。步骤1)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。

实施例5

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以10KDa截留分子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；

3)以含有55mM Tris-HCl、13mM MgSO₄·7H₂O的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2.8μg/mL，水解；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度55μg/mL，酶解；

5)而后加入三氯乙酸至终浓度14％(w/v)，35min后固液分离取上清，透析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种植物乳杆菌胞外多糖，其特征在于所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：

1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；

4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40～60μg/mL，酶解；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5～2.5倍。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中粗多糖的终浓度为4～6mg/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤5)透析前，先调节上清液pH至4～5，再透析。

5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。

6.权利要求1所述植物乳杆菌胞外多糖用于抑制蜡样芽孢杆菌肠毒素对小肠上皮细胞毒性的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是细胞毒素K。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是溶血性肠毒素HBL。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述蜡样芽孢杆菌肠毒素是非溶血性肠毒素Nhe。

10.权利要求1所述植物乳杆菌胞外多糖用于制备蜡样芽孢杆菌肠毒素中毒治疗药物的应用。