CN105829527A - 用于制备视网膜色素上皮细胞的方法 - Google Patents

用于制备视网膜色素上皮细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于制备视网膜色素上皮细胞的方法，其包括(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，和(3)第三步，将步骤(2)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体。

Description

用于制备视网膜色素上皮细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于制备视网膜色素上皮细胞的方法等。
背景技术
已知关于使用多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞的报道(非专利文献1)。显示通过以下方式获得视网膜色素上皮细胞的方法：在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中形成多能干细胞的均匀团聚体，将它们在基底膜制剂存在下进行悬浮培养，然后在含血清培养基中进行悬浮培养，并且在含有作用于Wnt信号途径的物质并且不含作用于Sonichedgehog信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养(非专利文献2和专利文献1)。
[文献列表]
专利文献
专利文献1:WO2013/077425
非专利文献
非专利文献1:CellStemCell，5，396-408(2009)
非专利文献2:CellStemCell，10(6)，771-785(2012)
发明概述
发明解决的问题
希望开发出用于由多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法。
解决问题的方法
本发明提供由多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片的方法等。
即，本发明提供:
[1]用于制备视网膜色素上皮细胞的方法，其包括
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，和
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体(在下文中有时称为本发明的制备方法1)；
[2]用于制备视网膜色素上皮细胞片(sheet)的方法，其包括
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体，和
(4)第四步，将步骤(3)中获得的团聚体分散并且将得到的细胞进行粘附培养(在下文中有时称为本发明的制备方法2)；
[3]前述[2]所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在血清代替物(serumreplacement)存在下进行；
[4]前述[2]或[3]所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在ROCK抑制物质存在下进行；
[5]前述[2]至[4]中任一项所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在还包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行：作用于Wnt信号途径的物质、抑制FGF信号途径的物质、作用于激活素(Activin)信号途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质；
[6]前述[2]至[5]中任一项所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在具有用培养基质(culturesubstrate)处理的表面的培养容器材料上进行；
[7]前述[6]所述的制备方法，其中所述培养基质是合成的培养基质；
[8]前述[6]所述的制备方法，其中所述培养基质是层粘连蛋白；
[9]前述[1]至[8]中任一项所述的制备方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物多能干细胞；
[10]前述[1]至[9]中任一项所述的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞；
[11]前述[1]至[10]中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)和步骤(2)在血清代替物存在下进行；
[12]前述[1]至[11]中任一项所述的方法，其中所述悬浮培养在不存在基底膜制剂的情况下进行；
[13]前述[1]至[12]中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质是一种或多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：BMP2、BMP4、BMP7和GDF7；
[14]前述[1]至[13]中任一项所述的方法，其中步骤(2)中的所述各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基还包含抑制FGF信号途径的物质；
[15]用于评价毒性或药效的试剂，其包含通过前述[1]至[14]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片；
[16]评价测试物质的毒性或药效的方法，其包括将通过前述[1]至[14]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片与测试物质接触，并且检查所述物质对所述细胞或细胞片的影响；
[17]用于由视网膜组织病症所致的疾病的治疗剂，其包含通过前述[1]至[14]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片；
[18]治疗由视网膜组织病症所致的疾病的方法，其包括将有效量的通过前述[1]至[14]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片移植到需要移植的受试者；以及
[19]通过前述[1]至[14]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片，其用于治疗由视网膜组织病症所致的疾病；等。
发明效果
根据本发明的制备方法，可以非常高效地制备视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片。在本发明的制备方法中，因为视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片可以通过在不向培养基中加入基底膜制剂的情况下(即，在不存在基底膜制剂的情况下)悬浮培养团聚体来获得，获得的细胞或细胞片被源自异源物种的成分污染的风险降低。根据本发明的制备方法，可以有效地提供视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片以用于化学物质等的毒性或效力评价、移植治疗等。
附图简述
图1显示源自人胚胎干细胞的、在悬浮培养的第3天补充以BMP4的培养基中悬浮培养的团聚体在悬浮培养的第18天的明场图像(A)，和源自人胚胎干细胞的、在悬浮培养的第3天补充以BMP4的培养基中悬浮培养的并且自悬浮培养的第18天起在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中悬浮培养的团聚体在悬浮培养的第20天的明场图像(B)。
图2显示自悬浮培养开始第3天-第18天在含有BMP4的培养基中悬浮培养的来源于人胚胎干细胞的团聚体的(A)自悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中并且之后在不含BMP4和CHIR99021的培养基中的悬浮培养的第27天的明场图像，(B)自悬浮培养的第18天至第27天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中的悬浮培养的第27天的明场图像，和(C)自悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中，自悬浮培养的第21天至第27天在不含BMP4而含有CHIR99021和SU-5402的培养基中的悬浮培养的第27天的明场图像。
图3显示在含有CHIR99021的培养基中的粘附培养的细胞的都在自悬浮培养开始的第27天的(A)明场图像，(B)视网膜色素上皮标志物Mitf的荧光免疫染色图像，和(C)紧密连接标志物ZO-1的荧光免疫染色图像，其中所述细胞通过自悬浮培养的第3天至第18天在含有BMP4的培养基中，自悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中悬浮培养来源于人胚胎干细胞的团聚体，并且在培养的第21天使所述团聚体瓦解来获得。
图4显示在含有Y27632的培养基中的粘附培养的细胞的都在自悬浮培养开始的第40天的(A)视网膜色素上皮细胞片的图像和(B)放大的光场图像，其中所述细胞通过从悬浮培养的第3天至第18天在含有BMP4的培养基中，从悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中悬浮培养来源于人胚胎干细胞的团聚体，在悬浮培养的第21天分散，并且将得到的细胞接种在表面用SynthemaxTM处理的Boyden小室(Boydenchamber)中来获得。
图5显示在自悬浮培养开始的第40天的视网膜色素上皮细胞片的放大的光场图像。将来源于人胚胎干细胞的团聚体从悬浮培养的第3天至第18天在含有BMP4的培养基中，从悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中进行悬浮培养，在培养的第21天分散，将得到的细胞接种在表面用SynthemaxTM处理的Boyden小室中并对其进行粘附培养。继续粘附培养直到自悬浮培养开始的第40天，在自开始悬浮培养的第24天或自开始粘附培养的第3天(A)不加入成分，或加入(B)3μMCHIR99021，(C)10μMSU-5402，(D)3μMCHIR99021和10μMSU-5402，(E)1nM人BMP4蛋白，或(F)50ng/ml人激活素。
图6显示接种在表面用(A)MatrigelTM或(B)SynthemaxTM处理的Boyden小室中的粘附培养的细胞在自开始悬浮培养的第26天的视网膜色素上皮片的图像，其中所述细胞通过自悬浮培养的第3天至第18天在含有BMP4的培养基中，自悬浮培养的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培养基中悬浮培养来源于人胚胎干细胞的团聚体，并且在悬浮培养的第21天分散来获得。
实施方案描述
以下详细说明实施本发明的方式。
本发明中的“悬浮培养”表示在阻止细胞或细胞团块粘附到细胞培养容器材料等的条件下进行培养。
用于悬浮培养的培养容器不受特别限制只要其能够进行“悬浮培养”即可，并且本领域技术人员能够适当地确定细胞培养容器。此种培养容器的实例包括烧瓶，组织培养烧瓶，盘，培养皿，组织培养盘，多皿(multidish)，微板，微孔板，微孔(micropore)，多板(multiplate)，多孔板，室载玻片(chamberslide)，碗(schale)，试管，浅盘，培养袋，和转瓶。由于这些培养容器用于悬浮培养，其优选是不粘附细胞的。作为不粘附细胞的容器，可以使用的是表面未进行人工处理以提高细胞粘附性(例如，利用胞外基质的涂覆处理等)的容器等。
通常用于本发明的培养基可以制备自作为基础培养基的用于培养动物细胞的培养基。基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的那些培养基，如BME培养基，BGJb培养基，CMRL1066培养基，GlasgowMEM培养基，ImprovedMEMZincOption培养基，IMDM培养基，Medium199培养基，EagleMEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，F-12培养基，Ham’s培养基，RPMI1640培养基，Fischer’s培养基，及其混合培养基。
本发明中的“无血清培养基”表示不含未调节的或未纯化的血清的培养基。在本发明中，含有纯化的血液来源的组分和动物组织来源的组分(例如，生长因子)的培养基被认为是无血清培养基，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。
无血清培养基可以含有血清代替物。血清代替物的实例包括适当地含有例如以下物质的那些：清蛋白，运铁蛋白，脂肪酸，胶原蛋白前体，痕量元素，2-巯基乙醇或3’硫醇甘油，其等效物等。此种血清代替物可以通过例如WO98/30679中所述的方法制备。此外，血清代替物可以是市售的产品。此种市售血清代替物的实例包括KnockoutTMSerumReplacement(由Invitrogen生产：下文中有时被称为KSR)，Chemicallydefinedlipidconcentrate(化学成分确定的脂质浓缩物，由Gibco生产)，和GlutamaxTM(由Gibco生产)。
用于悬浮培养的无血清培养基可以含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
为避免复杂的制备，补充有适当量(例如，约1-约20％)的市售的KSR的无血清培养基可以用作无血清培养基(例如，通过向F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物添加10％KSR和450μM1-一硫代甘油获得的培养基)。
本发明中的“含血清培养基”表示含有未调节的或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，1-一硫代甘油，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
本发明中的“基底膜制剂”是指这样的制剂，其含有基底膜构成成分，所述基底膜构成成分具有这样的功能，即在能够形成基底膜的目标细胞被置于其上并培养时，控制与上皮细胞类似的细胞形态，分化，生长，运动，功能表达等。此处，“基底膜构成成分”是指以薄膜形式存在于动物组织中的上皮细胞层和***层之间等的胞外基质分子。基底膜制剂可以通过例如以下方式制备：利用能够溶解细胞脂质的溶液(碱溶液等)去除能够形成基底膜的细胞(所述细胞经由基底膜粘附到支持物上)。优选的基底膜制剂的实例包括作为基底膜产品可商购的产品((例如，MatrigelTM(由BecktonDickinson生产：下文中有时被称为Matrigel))，和已知为基底膜成分的胞外基质分子(例如，层粘连蛋白(laminin)，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycan)，巢蛋白(entactin)等)。
MatrigelTM是提取自EngelbrethHolmSwarn(EHS)小鼠肉瘤的基底膜产品。MatrigelTM的主要成分是IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除了这些以外，还含有TGF-β，成纤维细胞生长因子(FGF)，组织纤溶酶原激活物和由EHS肿瘤天然产生的生长因子。MatrigelTM的“生长因子减少的产品”具有比普通的MatrigelTM更低的生长因子浓度，并且其标准的EGF浓度为<0.5ng/ml，标准的NGF浓度为<0.2ng/ml，标准的PDGF浓度为<5pg/ml，标准的IGF-1浓度为5ng/ml，并且标准的TGF-β浓度为1.7ng/ml。
本发明中的“含有物质X的培养基”表示补充有外源物质X的培养基或含有外源物质X的培养基，并且“不含物质X的培养基”表示没有补充外源物质X的培养基或不含外源物质X的培养基。此处，“外源物质X”表示对要在培养基中培养的细胞或组织来说是外源的物质X，并且由细胞或组织产生的内源物质X不包括在其中。
例如，“含有作用于BMP信号转导途径的物质的培养基”是补充有外源性的作用于BMP信号转导途径的物质的培养基或含有外源性的作用于BMP信号转导途径的物质的培养基。“不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的培养基”是没有补充外源性的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的培养基或不含外源性的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的培养基。
本发明中的“灵长类动物”表示属于灵长类动物的哺乳动物。灵长类动物的实例包括原猴亚目(Strepsirrhini)如狐猴，懒猴和Tsubai，以及类人猿亚目(Haplorhini)如猴，类人猿和人。
在本发明中，“干细胞”是指在细胞***后仍能够保持相同的分化能力的细胞，所述细胞可以在其组织受损时有助于组织的再生。此处，干细胞可以是胚胎干细胞(下文中有时被称为ES细胞)或组织干细胞(也称为组织的干细胞，组织特异性干细胞或体干细胞)，或人工多能干细胞(iPS细胞：诱导的多能干细胞)。如由上述干细胞来源的组织细胞可以再生组织的事实所理解的，已知干细胞可以分化为与活体内的细胞接近的正常细胞。
干细胞可以获得自指定的机构，或者也可以购买市售的产品。例如，人胚胎干细胞，KhES-1，KhES-2和KhES-3，可获得自KyotoUniversity的InstituteforFrontierMedicalSciences。EB5细胞可获得自RIKEN，而D3细胞系可获得自ATCC，所述每种都是小鼠胚胎干细胞。
干细胞可以通过本身已知的方法进行培养来维持。例如，人干细胞可以通过在补充有KnockoutTMSerumReplacement(Invitrogen)的培养基中进行培养来维持。小鼠干细胞可以通过添加胎牛血清(FCS)和LeukemiaInhibitoryFactor(LIF)并且在没有饲养细胞的情况下培养来维持。
在本发明中，“多能干细胞”是指这样的干细胞，其能够在体外培养并且有能力分化为构成活体(除了胎盘以外)的任何细胞(三胚层(外胚层，中胚层，内胚层)-来源的组织)(多能性)，并且胚胎干细胞(ES细胞)包括在多能干细胞中。“多能干细胞”获得自受精卵，克隆胚胎，再生性干细胞，和组织中的干细胞。在将若干种基因引入体细胞后具有与胚胎干细胞的分化多能性类似的人工分化多能性的细胞(也称为人工多能干细胞)也包括在多能干细胞中。多能干细胞可以通过本身已知的方法制备。制备方法的实例包括Cell,2007,131(5)pp.861-872和Cell,2006,126(4)pp.663-676中所述的方法。
在本发明中，“胚胎干细胞(ES细胞)”是指具有自身复制能力和多能性(multipotency)(特别地，“多能性”)的细胞，其是来源于早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞首先于1981年被创建，并且自1989年起也已被应用于敲除小鼠的产生。在1998年，创建了人胚胎干细胞，其也被用于再生医学。
在本发明中，“人工多能干细胞”是指通过表达若干种基因如Oct3/4，Sox2，Klf4和Myc直接重编程分化的细胞如成纤维细胞等而被诱导成具有多能性的细胞，其由Yamanaka等在2006年在小鼠细胞中创建(Cell.2006,126(4),pp.663-676)。在2007年，在人成纤维细胞中也建立了诱导的多能干细胞，并且其具有与胚胎干细胞类似的多能性(Cell,2007,131(5)pp.861-872；Science,2007,318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.,2008,26(1)pp.101-106)。
遗传修饰的多能干细胞可以例如使用同源重组技术来制备。染色体上要被修饰的基因的实例包括细胞标记基因，组织相容性抗原基因，与由神经***细胞的紊乱所致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因可以通过ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994)；GeneTargeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993)；BioManualseries8,genetargeting,ProductionofmutantmouseusingEScells,YODOSHACo.,LTD.(1995)等中所述的方法修饰。
具体地，例如，分离要被修饰的靶基因(例如，细胞标记基因，组织相容性抗原基因，疾病相关基因等)的基因组基因，并且使用分离的基因组基因制备用于靶基因的同源重组的靶载体。将制备的靶载体引入到干细胞中，并且选择显示靶基因和靶载体之间的同源重组的细胞，由此可以制备在染色体上具有修饰的基因的干细胞。
作为用于分离靶基因的基因组基因的方法，可以提及MolecularMolecularCloning,ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1987-1997)等中所述的已知方法。此外，靶基因的基因组基因可以使用基因组DNA文库筛选***(由GenomeSystems生产)，UniversalGenomeWalkerKits(由CLONTECH生产)等来分离。
根据GeneTargeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993)；BioManualseries8,genetargeting,ProductionofmutantmouseusingEScells,YODOSHACo.,LTD.(1995)等中所述的方法，可以制备用于靶基因的同源重组的靶载体，并且可以有效选择同源重组体。靶载体可以是任何替换类型和***类型的，并且选择方法可以是阳性选择，启动子选择，阴性选择，polyA选择等。
作为从选择的细胞系选择目标同源重组体的方法，可以提及用于基因组DNA的DNA杂交法，PCR法等。
本发明中的“团聚体”是指分散在培养基中但是聚集从而形成团聚体的细胞团块。本发明中的“团聚体”包括由悬浮培养开始时分散的细胞形成的团聚体和在悬浮培养开始时已经形成的团聚体。
当细胞聚集而形成细胞团聚体并且对团聚体进行悬浮培养时，“形成团聚体”表示“快速地聚集一定数目的分散的细胞”从而形成均质的细胞团聚体。
在本发明中，优选的是快速地聚集多能干细胞以允许形成多能干细胞的团聚体。通过以此方式形成多能干细胞的团聚体，在来自形成的团聚体的、被诱导分化的细胞中可以形成具有良好再生性的上皮样结构。
形成团聚体的实验操作的实例包括涉及使用具有小孔的板(96孔板)、微孔等将细胞保持在小空间中的方法，涉及通过使用小离心管进行短时间离心来聚集细胞的方法。
多能干细胞的团聚体是否已经形成以及在形成团聚体的细胞中是否已经形成上皮样结构可以基于团聚体的大小和细胞数，宏观形态学，通过组织染色分析的微观形态学及其均匀性，分化和未分化标记物的表达及其均匀性，分化标记物表达的控制及其同步性，团聚体之间的分化效率的再现性等来确定。
在本发明中，“组织”是指细胞群结构，其具有这样的构造，其中在形状和性质上不同的超过一种类型的细胞在空间上以特定模式被配置。
在本发明中，“视网膜组织”表示这样的视网膜组织，其中构成活体视网膜中的各个视网膜层的至少两种类型以上的细胞如光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，其先祖细胞或其视网膜先祖细胞，在空间上被布置在多个层中。关于每种细胞，哪种细胞构成哪个视网膜层可以通过已知方法确认，例如，通过是否存在细胞标记物的表达或细胞标记物的表达水平等来确认。
本发明中的“视网膜层”表示构成视网膜的每个层。其具体实例包括视网膜色素上皮层，光感受器层，外界膜，外核层，外网织层，内核层，内网织层，神经节细胞层，神经纤维层和内界膜。
本发明中的“视网膜层特异的神经细胞”表示构成视网膜层并且为视网膜层所专有的神经细胞。视网膜层特异的神经细胞的实例包括双极细胞，神经节细胞，无长突细胞，水平细胞，光感受器，色素上皮细胞，视杆细胞和视锥细胞。
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”表示生物视网膜中的神经视网膜组织的外侧上存在的上皮细胞。细胞是否是视网膜色素上皮细胞可以由本领域技术人员基于，例如，细胞标志物(RPE65(色素上皮细胞)、Mitf(色素上皮细胞)等)的表达、黑色素粒的存在、多边形的特征细胞形式等确认。
本发明中的“视网膜先祖细胞”是指能够分化成任何成熟的视网膜细胞(光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞)的先祖细胞。
光感受器先祖细胞，水平先祖细胞，双极先祖细胞，无长突先祖细胞，视网膜神经节先祖细胞和视网膜色素上皮先祖细胞分别是确定分化成光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞的先祖细胞。
视网膜细胞标记物的实例包括表达于视网膜先祖细胞中的Rax和PAX6，表达于下丘脑神经元的先祖细胞而不表达于视网膜先祖细胞的Nkx2.1，表达于下丘脑神经上皮而不表达于视网膜中的Sox1，表达于光感受器的先祖细胞中的Crx等。视网膜层特异的神经细胞标记物的实例包括表达于双极细胞中的Chx10和L7，表达于神经节细胞中的Tuj1和Brn3，表达于无长突细胞中的钙视网膜蛋白，表达于水平细胞中的钙结合蛋白，表达于光感受器中的视紫红质(Rhodopsin)和恢复蛋白，表达于色素上皮细胞中的RPE65和Mitf，表达于视杆细胞中的Nrl，表达于视锥细胞中的Rxr-γ等。
本发明的制备方法1是用于制备视网膜色素上皮细胞的方法，其包括以下步骤(1)、(2)和(3):
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，和
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体。
说明用于在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体的步骤(1)。
用于步骤(1)的无血清培养基不受特别限制只要其如上所述即可。例如，可以使用未补充任何作用于BMP信号转导途径的物质和抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基。为避免复杂的配制过程，优选使用补充有适当量的血清代替物如市售的KSR的无血清培养基(例如，通过向IMDM和F-12的1:1混合物添加10％KSR，450μM1-一硫代甘油和1x化学成分明确的脂质浓缩物(ChemicallyDefinedLipidConcentrate)获得的培养基)。在例如人ES细胞的情况中，向无血清培养基添加的KSR的量通常为约1％至约20％，优选地约2％至约20％。
步骤(1)中的培养条件如培养温度、CO2浓度可以被适当地确定。培养温度例如是，约30℃至约40℃，优选地约37℃。CO2浓度例如是，约1％至约10％，优选地约5％。
步骤(1)中多能干细胞的浓度可以根据需要确定以更均匀且有效地形成多能干细胞的团聚体。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行悬浮培养时，将被制备成每孔约1×103至约5×105个细胞，优选地约3×103至约5×104个细胞，更优选地约5×103至约3×104个细胞，最优选地约1.2×104个细胞的液体添加到孔中，并且将板静置以形成团聚体。
形成团聚体所需的悬浮培养的时间可以根据所使用的多能干细胞合适地确定，以允许细胞的均匀聚集。为了形成均匀的团聚体，理想地，所述时间要尽可能短。例如，在人ES细胞的情况中，团聚体优选地在约24hr内，更优选地在约12hr内形成。团聚体形成所需的时间可以通过控制用于聚集细胞的工具、浓度条件等适当地调整。
是否已经形成多能干细胞的团聚体可以基于团聚体的大小和细胞数，宏观形态学，通过组织染色分析的微观形态学及其均匀性，分化和未分化标记物的表达及其均匀性，分化标记物表达的控制及其同步性，团聚体之间的分化效率的再现性等来确定。
说明步骤(2)，步骤(2)包括在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体。
作为用于步骤(2)的培养基，使用例如未补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而补充有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基，并且添加基底膜制剂是不必要的。
用作此种培养基的无血清培养基或含血清培养基不受特别限制只要其如上所述即可。为避免复杂的配制过程，优选使用补充有适当量的血清代替物如市售的KSR的无血清培养基(例如，通过向IMDM和F-12的1:1混合物添加10％KSR，450μM1-一硫代甘油和1x化学成分明确的脂质浓缩物获得的培养基)。在例如人ES细胞的情况中，向无血清培养基添加的KSR的量通常为约1％至约20％，优选地约2％至约20％。
作为用于步骤(2)的无血清培养基，步骤(1)中使用的无血清培养基可以被原样使用，只要其不含有作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质即可，或者可以被替换以新鲜的无血清培养基。当将步骤(1)中使用的无血清培养基直接用于步骤(2)时，仅需要向培养基中添加作用于BMP信号转导途径的物质。
作用于Sonichedgehog(下文中有时被称为Shh)信号转导途径的物质是能够增强由Shh介导的信号转导的物质。作用于Shh信号转导途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白质(例如，Shh)，Shh受体，Shh受体激动剂，Purmorphamine，SAG等。
“不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质”的培养基还包括基本上不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的培养基，如含有的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的浓度不会对向视网膜先祖细胞和视网膜组织的选择性分化产生不利影响的培养基。
“没有补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质”的培养基还包括基本上没有补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的培养基，如补充的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质的浓度不会对向视网膜先祖细胞和视网膜组织的选择性分化产生不利影响的培养基。
作用于BMP信号转导途径的物质是能够增强由BMP介导的信号转导途径的物质。作用于BMP信号转导途径的物质的实例包括BMP蛋白如BMP2，BMP4或BMP7，GDF蛋白如GDF7，抗-BMP受体抗体，BMP部分肽等。BMP2蛋白，BMP4蛋白和BMP7蛋白可获得自，例如，R&DSystems，而GDF7蛋白可获得自，例如，WakoPureChemicalIndustries,Ltd。
作用于BMP信号转导途径的物质的浓度仅需要是能够诱导形成多能干细胞团聚体的细胞向视网膜细胞分化的浓度。在BMP4的情况中，例如，其以约0.01nM至约1μM，优选地约0.1nM至约100nM，更优选地约1.5nM的浓度被添加到培养基中。
作用于BMP信号转导途径的物质仅需要在步骤(1)中的悬浮培养开始起的约24小时后被添加，并且可以在自悬浮培养开始起的若干天内(例如，在15天内)被添加到培养基。优选地，作用于BMP信号转导途径的物质在自悬浮培养开始起的第1天至第15天，更优选地第1天至第9天，最优选地第3天被添加到培养基中。
在作用于BMP信号转导途径的物质被添加到培养基中并且形成多能干细胞团聚体的细胞向视网膜细胞的诱导分化开始后，不需要向培养基添加作用于BMP信号转导途径的物质，并且培养基可以被替换成无血清培养基或含血清培养基，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于BMP信号转导途径的物质，由此降低培养基的成本。可以例如通过检测Rax基因在细胞中的表达来确定已经开始向视网膜细胞分化诱导的细胞。还可能的是，通过在存在向视网膜细胞分化诱导所需的浓度的作用于BMP信号转导途径的物质的情况下，对步骤(1)中使用在Rax基因座已经敲入有荧光报告蛋白基因如GFP的多能干细胞形成的团聚体进行悬浮培养，并且检测由表达的荧光报告蛋白发出的荧光来确认开始向视网膜细胞分化诱导的时间。步骤(2)的实施方案之一是这样的步骤，其包括在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养直至表达Rax基因的细胞出现，所述无血清培养基或含血清培养基各自含有为向视网膜细胞分化诱导所需的浓度的作用于BMP信号转导途径的物质而不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质，从而获得包含视网膜先祖细胞的团聚体。
步骤(2)中的培养条件如培养温度、CO2浓度可以被适当地确定。培养温度例如是，约30℃至约40℃，优选地约37℃。CO2浓度例如是，约1％至约10％，优选地约5％。
已经获得含有视网膜先祖细胞的团聚体可以通过例如在团聚体中检测表达视网膜先祖细胞标志物Rax或PAX6的细胞的存在来确认。
说明步骤(3)，步骤(3)包括将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体。
步骤(3)中使用的培养基是，例如，没有补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质中的任一种而补充以作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基。
“不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质”的培养基还包括基本上不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质的培养基，例如，含有的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质的浓度不会对向视网膜组织的选择性分化产生不利影响的培养基。
“没有补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质中的任一种”的培养基还包括基本上没有补充作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质的培养基，例如，补充的作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质的浓度不会对向视网膜组织的选择性分化产生不利影响的培养基。
用作此种培养基的无血清培养基或含血清培养基的实例包括上文提及的培养基。优选的是这样的无血清培养基，其是补充以神经营养因子如N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)的混合物而没有补充KSR的基础培养基如DMEM-F12培养基。
作用于Wnt信号途径的物质是可以增强由Wnt介导的信号转导的物质。作用于Wnt信号途径的物质的实例包括属于Wnt家族的蛋白(例如，Wnt1、Wnt3a、Wnt7a)，Wnt受体激动剂，GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime)(BIO)，CHIR99021，Kenpaullone)等。
作用于Wnt信号途径的物质的浓度可以是任意的，只要可以诱导形成多能干细胞团聚体的细胞分化为视网膜细胞即可。例如，在CHIR99021的情形中，将其以约0.1μM至约100μM，优选约1μM至约30μM，更优选约3μM的浓度加入。
当使用人ES细胞时，例如，不早于自步骤(1)中的悬浮培养开始的第12天，优选在第18天，加入作用于Wnt信号途径的物质。
在步骤(3)中，更优选在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质，而含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养团聚体。
抑制FGF信号途径的物质是能够抑制由FGF介导的信号的物质。抑制FGF信号途径的物质的实例包括FGF受体，FGF受体抑制剂(例如，SU-5402、AZD4547、BGJ398)，MAP激酶级联抑制物质(例如，MEK抑制剂、MAPK抑制剂、ERK抑制剂)，PI3激酶抑制剂，Akt抑制剂等。
用于步骤(3)的抑制FGF信号途径的物质的浓度可以是任意的，只要能够诱导形成多能干细胞团聚体的细胞分化为视网膜细胞即可。例如，在SU-5402的情形中，将其以约0.1μM至约100μM，优选约1μM至约30μM，更优选约10μM的浓度加入。
因为这样产生的视网膜色素上皮细胞存在于团聚体的表面，它们可以通过显微观察等确认。还可能通过将含有视网膜色素上皮细胞的团聚体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理)，并且通过使用FACS选择得到的细胞获得高度纯的视网膜色素上皮细胞。还可能以物理方式通过使用镊子等从团聚体上取下视网膜色素上皮细胞并培养所述细胞。由此分散或取下的视网膜色素上皮细胞可以在粘附条件下培养。还可能通过使用微量移液器等进行移液操作来使含有视网膜色素上皮细胞的团聚体瓦解，并且在粘附条件下进一步培养得到的细胞。在粘附培养的情形中，优选使用细胞粘附培养容器，例如，用细胞外基质等(例如，聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin))涂敷处理后的培养容器。粘附培养的培养条件如培养温度、CO2浓度和O2浓度可以酌情确定。在该情况下，可以在血清、已知的生长因子和促进生长的添加剂和化学物质存在下培养细胞。已知的生长因子的实例包括EGF、FGF等。促进生长的添加剂的实例包括N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)等。
本发明的制备方法2是一种用于制备视网膜色素上皮细胞片的方法，其包括以下步骤(1)、(2)、(3)和(4):
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，和
(4)第四步，分散步骤(3)中获得的团聚体并且将得到的细胞进行粘附培养。
可以与本发明的制备方法1的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)类似地进行本发明的制备方法2的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)。
说明步骤(4)，步骤(4)用于分散步骤(3)中获得的团聚体并且将得到的细胞进行粘附培养。
在步骤(3)开始后的60天内，优选30天内，更优选为3天进行步骤(4)。
将在步骤(4)中分散的源自团聚体的细胞接种在粘附培养容器中至能够有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片的浓度。例如，当使用65mmBoyden小室将源自团聚体的细胞进行粘附培养时，将被制备成含有约1×103至约1×107个细胞，优选为约3×103至约5×106个细胞，更优选为约5×103至约1×106个细胞，更优选为约2×105个细胞/孔的溶液加入孔中，并且静置平板以让源自团聚体的细胞粘附并培养。
用于步骤(4)中的粘附培养的无血清培养基或含血清培养基的实例包括上述培养基。为了避免复杂的配置过程，例如，优选使用补充以适量的血清代替物如可商购的KSR的无血清培养基(例如，其中加入有DMEM/F-12和Neurobasal的1:1混合物以及1/2xN2补充剂、1/2xB27补充剂和100μM2-巯基乙醇的培养基)。在例如源自人ES细胞的细胞的情形中，加入到无血清培养基的KSR的浓度通常是约1％至约20％，优选约2％至约20％。
在步骤(4)中，优选在含有ROCK抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养细胞。
ROCK抑制物质是能够抑制经由Rho激酶介导的信号的物质。ROCK抑制物质的实例包括Y-27632和法舒地尔(Fasudil)。
用于步骤(4)的ROCK抑制物质的浓度可以是任意的，只要可以有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片即可。例如，在Y-27632的情形中，将其以约0.01μM至约100μM，优选约1μM至约30μM，更优选约20μM的浓度加入。
在步骤(4)中，更优选的是在进一步含有一种或多种选自由以下各项组成的组的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养细胞：作用于Wnt信号途径的物质、抑制FGF信号途径的物质、作用于激活素信号途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质。
作用于Wnt信号途径的物质的实例包括属于Wnt家族的蛋白(例如，Wnt1、Wnt3a、Wnt7a)，Wnt受体激动剂，GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime)(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)等。
用于步骤(4)的作用于Wnt信号途径的物质的浓度可以是任意的，只要可以有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片即可。例如，在CHIR99021的情形中，将其以约0.1μM至约100μM，优选约1μM至约30μM，更优选约3μM的浓度加入。
例如，在从步骤(4)开始的18天内，优选在第6天加入作用于Wnt信号途径的物质。
抑制FGF信号途径的物质的实例包括FGF受体，FGF受体抑制剂(例如，SU-5402、AZD4547、BGJ398)，MAP激酶级联抑制物质(例如，MEK抑制剂、MAPK抑制剂、ERK抑制剂)，PI3激酶抑制剂和Akt抑制剂。
用于步骤(4)的抑制FGF信号途径的物质的浓度可以是任意的，只要可以有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片即可。例如，在SU-5402的情形中，将其以约0.1μM至约100μM，优选约1μM至约30μM，更优选约10μM的浓度加入。
例如，在从步骤(4)开始的18天内，优选在第6天加入抑制FGF信号途径的物质。
作用于激活素信号途径的物质是能够增强由激活素介导的信号的物质。作用于激活素信号途径的物质的实例包括属于激活素家族的蛋白(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB等)，激活素受体和激活素受体激动剂。
用于步骤(4)的作用于激活素信号途径的物质的浓度可以是任意的，只要能够有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片即可。例如，在重组人/小鼠/大鼠激活素A(R&DSystems，Inc.#338-AC)的情形中，将其以约1ng/ml至约10μg/ml，优选约10ng/ml至约1μg/ml，更优选约100ng/ml的浓度加入。
例如，在从步骤(4)开始的18天内，优选在第6天加入作用于激活素信号途径的物质。
作用于BMP信号转导途径的物质的实例包括BMP蛋白如BMP2、BMP4或BMP7和GDF蛋白如GDF7等、抗-BMP受体抗体、BMP部分肽等。
用于步骤(4)中的作用于BMP信号转导途径的物质的浓度可以是任意的，只要能够有效形成均匀的视网膜色素上皮细胞片即可。例如，在BMP4的情形中，将其以约0.01nM至约1μM，优选约0.1nM至约100nM，更优选约1.5nM的浓度加入。
例如，在从步骤(4)开始的18天内，优选在第6天加入作用于BMP信号转导途径的物质。
在步骤(4)中，例如，将细胞培养在进一步含有一种选自由以下各项组成的组的物质的无血清培养基或含血清培养基中：作用于Wnt信号途径的物质，抑制FGF信号途径的物质，作用于激活素信号途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质，或在进一步含有作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中。
在步骤(4)中，优选在用培养基质表面处理的培养容器材料上进行粘附培养。
作为用于在步骤(4)中处理培养容器材料的培养基质，可以提及允许粘附培养源自团聚体的细胞，并形成视网膜色素上皮细胞片的细胞培养基质。为了避免复杂的制备并防止源自异源物种的成分的污染，优选使用合成的培养基质、源自人的基底膜成分、重组人基底膜蛋白等。这样的培养基质的具体实例包括合成的培养基质如SynthemaxTM(Corningincorporated)等，源自人的基底膜成分如CellstartTM(Invitrogen)，人细胞外基质(BD)等，重组人层粘连蛋白如人重组层粘连蛋白111(Biolamina)、人重组层粘连蛋白511(Biolamina)、人重组层粘连蛋白521(Biolamina)、人重组层粘连蛋白411(Biolamina)、人重组层粘连蛋白421(Biolamina)、人重组层粘连蛋白332(Biolamina)和人重组层粘连蛋白211(Biolamina)等。如本文使用的，层粘连蛋白111是由α1链、β1链和γ1链组成的层粘连蛋白，层粘连蛋白511是由α5链、β1链和γ1链组成的层粘连蛋白，层粘连蛋白521是由α5链、β2链和γ1链组成的层粘连蛋白，层粘连蛋白411是由α4链、β1链和γ1链组成的层粘连蛋白，层粘连蛋白421是由α4链、β2链和γ1链组成的层粘连蛋白，层粘连蛋白332是由α3链、β3链和γ2链组成的层粘连蛋白，并且层粘连蛋白211是是由α2链、β1链和γ1链组成的层粘连蛋白。此外，由层粘连蛋白的α链、β链和γ链中每个的C端区域构成的称为E8片段的部分，也已知显示对由细胞表达的整联蛋白的结合活性(J.Biol.Chem.,284,7820-7831(2009))。因此，预期其可类似于上述粘连蛋白使用。
通过本发明的制备方法1或2产生的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片具有与体内视网膜色素上皮细胞极为类似的特性。因此，其还可用于筛选用于由视网膜细胞的病症所致的疾病的治疗药物，或用于细胞治疗的移植材料，用于研究疾病的材料或用于其他病因导致的细胞损伤的治疗药物的药物发现材料。此外，其可用于研究毒性如光毒性，化学物质等的毒性和药效评价中的毒性测试等。
由视网膜细胞的病症所致的疾病的实例包括有机汞中毒(organicmercurypoisoning)、氯喹视网膜病(chloroquineretinopathy)、色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)、年龄相关黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration)、青光眼(glaucoma)、糖尿病性视网膜病(diabeticretinopathy)、新生儿视网膜病(neonatalretinopathy)等。
本发明的制备方法1或2制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片可以用作用于移植的视网膜色素上皮细胞，所述细胞用于在细胞损伤状态补充损伤的细胞或病变组织本身(例如，用于移植手术)等。
实施例
以下参考实施例更详细地说明本发明，所述实施例不被认为是限制性的。
实施例1：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人ES细胞(源自KhES-1)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)中获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的ES细胞分散为单个细胞，并且将单个分散的ES细胞以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中以允许快速形成团聚体，并且在37℃，5％CO2进行培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物中而获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以终浓度1.5nM加入BMP4，并且继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)，并且培养直到自开始悬浮培养的第21天，并且进行显微观察。
在自开始悬浮培养的第18天，确认神经上皮的形成(图1A)。在自开始悬浮培养的第21天，确认细胞分化为具有薄的上皮的视网膜色素上皮细胞(图1B)。
实施例2：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人ES细胞(源自KhES-1)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的ES细胞分散为单个细胞，并且将单个分散的ES细胞以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中以允许快速形成团聚体，并且在37℃，5％CO2进行培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632添加至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以终浓度1.5nM添加BMP4，并且继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)，并且继续悬浮培养直到自开始悬浮培养的第21天。作为对照，甚至在不存在CHIR99021的情况下类似地培养团聚体。一部分在含有CHIR99021的前述培养基中进行悬浮培养的团聚体在相同培养基条件下经历悬浮培养直到自开始悬浮培养的第27天，并且另一部分从开始悬浮培养的第21天至第27天在37℃，5％CO2在无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021(作用于Wnt信号途径的物质)和10μMSU-5402(抑制FGF信号途径的物质)并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)中经历悬浮培养。
在从培养的第21天起不存在作用于Wnt信号途径的物质的情况下培养团聚体，具有薄的上皮的视网膜色素上皮变回具有厚的上皮的神经上皮(图2A)，而在作用于Wnt信号途径的物质的存在下继续培养的团聚体中，暗色的视网膜色素上皮细胞出现在几乎所有团聚体的表面上(图2B)。在作用于Wnt信号途径的物质和抑制FGF信号途径的物质的存在下培养的团聚体显示分化诱导效率的增加，并且形成具有在几乎所有团聚体的表面上的视网膜色素上皮细胞的团聚体(图2C)。
实施例3：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人ES细胞(源自KhES-1)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)中获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的ES细胞分散为单个细胞，并且将单个分散的ES细胞以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中以允许快速形成团聚体，并且在37℃，5％CO2进行培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以终浓度1.5nM加入BMP4，并继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)，并且继续悬浮培养直到自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养的第21天，通过用微量移液器吸入并喷出溶液来使团聚体瓦解，并且将得到的细胞在无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021(作用于Wnt信号途径的物质)并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)中，在37℃，5％CO2进行粘附培养。
到自开始悬浮培养的第27天，观察到具有特征性多边细胞形式的视网膜色素上皮细胞(图3A)。通过细胞染色方法确认蛋白的表达。结果是，细胞对转录因子Mitf(其是视网膜色素上皮细胞标志物)呈阳性(图3B)并且对ZO-1(其是紧密连接标志物)呈阳性(图3C)，由此确认获得的细胞是视网膜色素上皮细胞。
实施例4：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞片
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人ES细胞(源自KhES-1)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的ES细胞分散为单个细胞，并且将单个分散的ES细胞以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中，以允许快速形成团聚体，并且在37℃，5％CO2进行培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以终浓度1.5nM加入BMP4，并继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)并培养直到自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养的第21天，将团聚体在细胞分散溶液Accutase(ICT)中分散，并且使用40μm细胞滤器除去碎片。将得到的细胞悬浮在无血清培养基(200μl)(其是添加有10％KSR，1/2N2补充剂，1/2B27补充剂，20μMY27632的DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1:1混合物)，并且以2x105个细胞/孔接种在用SynthemaxTM涂覆处理后的65mmBoyden小室(Transwell，CorningIncorporated)中，还将具有相同组成的培养基(1ml)加入到下部的孔中，并且在37℃，5％CO2进行粘附培养。每3天交换培养基，并且在自开始悬浮培养的第40天在显微镜下观察上皮形成水平。
到自开始悬浮培养的第40天，形成具有色素积累的具有特征多边细胞形式(图4B)的均匀的视网膜色素上皮细胞片(图4A)。
实施例5：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞片
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人ES细胞(源自KhES-1)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的ES细胞分散为单个细胞，并且将上述培养的ES细胞以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中以允许快速形成团聚体并且在37℃，5％CO2进行培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以浓度1.5nM加入BMP4，并继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)并且培养直到自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养的第21天，将团聚体在细胞分散溶液Accutase(ICT)中分散，并使用40μm细胞滤器去除碎片。将得到的细胞悬浮在无血清培养基(200μl)(其是添加有10％KSR，1/2N2补充剂，1/2B27补充剂，20μMY27632的DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1:1混合物)中并且以2x105个细胞/孔接种在用SynthemaxTM涂覆处理后的65mmBoyden小室(Transwell，CorningIncorporated)中，还将具有相同组成的培养基(1ml)加入到下部的孔，并且在37℃，5％CO2进行粘附培养。在自开始悬浮培养的第24天，即，在自开始粘附培养的第3天，加入3μMCHIR99021，加入10μMSU-5402，同时加入3μMCHIR99021和10μMSU-5402，加入1nM重组人BMP4蛋白，或加入50ng/ml重组人激活素，并继续粘附培养。在不加入前述物质的条件下进行类似的培养。每3天交换培养基，并且在自开始悬浮培养的第40天在显微镜下观察上皮形成的水平。
与没有添加的对照(图5A)相比，当在自开始悬浮培养的第24天加入3μMCHIR99021时(图5B)，细胞分化为较深色的视网膜色素上皮细胞。观察到，通过同时加入3μMCHIR99021和10μMSU-5402(图5D)，色素上皮比通过单独加入3μMCHIR99021(图5B)着色更深。与不添加的对照(图5A)相比，当加入1nM重组人BMP4蛋白(图5E)，或加入50ng/ml重组人激活素(图5F)时，获得更均匀的上皮。
实施例6：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮细胞片
将GrowthFactorReducedMatrigelTM(稀释30倍)，或SynthemaxTM(CorningIncorporated)(稀释40倍)以各100μl加入至65mmBoyden小室(Transwell，CorningIncorporated)的孔。将上述添加有Matrigel的小室在4℃孵育24hr，并且将上述添加有SynthemaxTM的小室在室温孵育2hr，由此进行培养容器材料的涂覆处理。在自开始悬浮培养的第21天，通过实施例4中所述方法，由团聚体制备单细胞悬液，将悬浮的细胞以2x105个细胞/孔接种到无血清培养基(200μl)(其是添加有10％KSR，1/2N2补充剂，1/2B27补充剂，20μMY27632的DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1:1混合物)中，还将具有相同组成的培养基(1ml)加入到下部的孔中，并且在37℃，5％CO2进行粘附培养。在自接种到Boyden小室的第5天观察细胞的粘附和上皮形成。
在涂覆有SynthemaxTM的培养容器材料(图6B)中，培养的来源于团聚体的细胞以与在涂覆有Matrigel(其是基底膜制剂)的培养容器材料(图6A)中相同的方式粘附，并且观察到其中细胞彼此紧密粘附的视网膜色素上皮样形式。
实施例7：使用诱导的多能干细胞(iPS细胞)的视网膜色素上皮细胞的制备实施例
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人iPS细胞系201B7(可从RIKENBioResourcecenter或iPSAcademiaJapanInc.获得)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的iPS细胞分散为单细胞，以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中，以允许快速形成团聚体并在37℃，5％CO2进行悬浮培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以1.5nM的终浓度加入BMP4，并继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充任何作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)并培养直到自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养的第21天，通过用微量移液器注入和喷出溶液来使团聚体瓦解，并将得到的细胞在无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021(作用于Wnt信号途径的物质)并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)中在37℃，5％CO2进行粘附培养。在自开始悬浮培养的第27天，在显微镜下观察细胞形式并且通过细胞染色方法确认视网膜色素上皮标志基因(Mitf，ZO-1)的表达。
以此方式，由人iPS细胞制备视网膜色素上皮细胞。
实施例8：使用诱导的多能干细胞(iPS细胞)的视网膜色素上皮细胞片的制备实施例
根据“Ueno，M.等人PNAS2006，103(25)，9554-9559”和“Watanabe，K.等人NatBiotech2007，25，681-686”中所述的方法培养人iPS细胞系201B7(可从RIKENBioResourcecenter或iPSAcademiaJapanInc.获得)。作为培养基，使用通过将20％KSR(KnockoutTMSerumReplacement；Invitrogen)，0.1mM2-巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，1x非必需氨基酸，5ng/mlbFGF加入至DMEM/F12培养基(Sigma)获得的培养基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)将培养的iPS细胞分散为单细胞，以非细胞粘附96孔培养板(sumilon球形板，SUMITOMOBAKELITECo.，Ltd.)的每个孔1.2×104个细胞悬浮在100μl的无血清培养基中，以允许快速形成团聚体，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。作为用于此的无血清培养基，使用通过将10％KSR，450μM1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，20μMY27632加入至F-12培养基和IMDM培养基的1:1混合物获得的无血清培养基。在自开始悬浮培养的第3天，以1.5nM的终浓度加入BMP4并继续悬浮培养。每3天将孔中一半量的培养基与没有补充作用于BMP信号转导途径的物质的上述培养基交换。在自开始悬浮培养的第18天，将团聚体转移至无血清培养基(其是含有3μMCHIR99021并添加有1xN2补充剂的DMEM/F-12培养基)，并培养直到自开始悬浮培养的第21天。在自开始悬浮培养的第21天，将团聚体在细胞分散溶液Accutase(ICT)中分散，并使用40μm细胞滤器去除碎片。将得到的细胞悬浮在无血清培养基(200μl)(其是添加有10％KSR，1/2N2补充剂，1/2B27补充剂，20μMY27632的DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1:1混合物)中，并以2x105个细胞/孔接种在用SynthemaxTM涂覆处理后的65mmBoyden小室(Transwell，CorningIncorporated)中，还将具有相同组成的培养基(1ml)加入到下部的孔中，并且在37℃，5％CO2进行粘附培养。可以在自开始悬浮培养的第24天，即，在从开始粘附培养的第3天，添加3μMCHIR99021、10μMSU-5402、1nM重组人BMP4蛋白和50ng/ml重组人激活素中的任一种，或这些的组合。每3天交换培养基，并且在自开始悬浮培养的第40天在显微镜下观察上皮形成水平。
以此方式，由人iPS细胞制备视网膜色素上皮细胞片。
本申请是基于在日本提交的专利申请号2013-232795(提交日期：2013年11月11日)，其内容完整地结合于此。
工业实用性
根据本发明的制备方法，可以以高效率制备视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片。

Claims (19)

1.用于制备视网膜色素上皮细胞的方法，其包括
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，和
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体。
2.用于制备视网膜色素上皮细胞片的方法，其包括
(1)第一步，将多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
(2)第二步，将步骤(1)中形成的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜先祖细胞的团聚体，
(3)第三步，将步骤(2)中获得的团聚体在各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行悬浮培养，从而获得含有视网膜色素上皮细胞的团聚体，和
(4)第四步，将步骤(3)中获得的团聚体分散并且对得到的细胞进行粘附培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在血清代替物存在下进行。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在ROCK抑制物质存在下进行。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在还包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质的无血清培养基或含血清培养基中进行：作用于Wnt信号途径的物质、抑制FGF信号途径的物质、作用于激活素信号途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的制备方法，其中在所述步骤(4)中，所述粘附培养在具有用培养基质处理的表面的培养容器材料上进行。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述培养基质是合成的培养基质。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述培养基质是层粘连蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物多能干细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)和步骤(2)在血清代替物存在下进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述悬浮培养在不存在基底膜制剂的情况下进行。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质是一种或多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：BMP2、BMP4、BMP7和GDF7。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤(2)中的所述各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质和作用于BMP信号转导途径的物质而含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基还包含抑制FGF信号途径的物质。
15.用于评价毒性或药效的试剂，其包含通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片。
16.评价测试物质的毒性或药效的方法，其包括将通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片与测试物质接触，并且检查所述物质对所述细胞或细胞片的影响。
17.用于由视网膜组织的病症所致的疾病的治疗剂，其包含通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片。
18.治疗由视网膜组织的病症所致的疾病的方法，其包括将有效量的通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片移植到需要所述移植的受试者。
19.通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞片，其用于治疗由视网膜组织的病症所致的疾病。
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