CN116194079A

CN116194079A - 用于移植用组织的介质

Info

Publication number: CN116194079A
Application number: CN202180062083.5A
Authority: CN
Inventors: 万代道子; 高桥政代; 龟井达也; 小野庆一; 渡健治; 桑原笃
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-05-30
Also published as: US20230310614A1; EP4201428A1; JPWO2022054924A1; CA3194364A1; WO2022054924A1

Abstract

本发明的目的在于提供适于用于治疗视网膜色素变性症(RP:retinitis pigmentosa)等视网膜变性疾病的、视网膜组织向视网膜下的移植的、介质以及包含视网膜组织及该介质的移植用组合物。本发明的移植用介质是用于将视网膜组织向视网膜下移植的移植用介质，其25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为5～500mPa·s，包含透明质酸及制药学上可接受的水性液体。本发明的移植用组合物包含移植用视网膜组织及本发明的移植用介质。

Description

用于移植用组织的介质

技术领域

本发明涉及在将视网膜组织移植至眼球内的视网膜下时所使用的介质、以及包含视网膜组织及介质的移植用组合物等。

背景技术

对罹患视网膜色素变性或老年性黄斑变性等伴有视网膜变性·损伤的疾病的患者而言，视网膜组织的移植被认为是有希望的治疗，研究开发正在推进中。例如，能够由多能干细胞分化诱导来制造包含视细胞的视网膜组织(非专利文献1)。另外，作为将视网膜组织移植至眼球内的视网膜下的方法，报道了将由多能干细胞制造的自体RPE细胞片移植至患者的案例(非专利文献2)。非专利文献1中报道了将RPE组织吸取至20号的SURFLO针的内部，然后将SURFLO针***眼球内的视网膜下腔(subretinal space)，使RPE组织从SURFLO针的前端吐出至视网膜下腔，从而RPE细胞片良好地植活，但并没有关于移植RPE细胞片时所使用的介质的记载。

另外，在视网膜组织、尤其是包含视细胞的视网膜组织的移植中，由于必须将待移植至需要修复的患部的视网膜组织准确地***、并使其植活，因此寻求能够不依赖于医生的技术地进行视网膜组织的移植手术的适宜的介质。

另一方面，专利文献1中公开了将植入体(视网膜细胞移植片)移植至视网膜下的设备，尽管记载了此时使用透明质酸水溶液，但没有任何关于具体的视网膜组织、透明质酸的浓度的记载。另外，非专利文献3中记载了对用于在移植前保存RPE干细胞的介质进行筛选并优化，针对各介质，研究了对RPE干细胞的存活、植活(attachment)、分布(distribution)、增殖及分化为RPE细胞的能力的影响。并且记载了，发现使用0.2％的透明质酸溶液作为RPE干细胞的保存介质的情况下，在保存96小时后，促进RPE干细胞的良好的分布及增殖、以及成熟RPE细胞特有的铺路石状形态的形成(cobblestone formation)及RPE细胞标志物的表达。然而，非专利文献3中并没有记载实际用于移植手术时的效果。

还报道了将透明质酸注入至视网膜下的情况下，发生视网膜脱落(参见非专利文献4)。

如上所述，尚未建立用于将视网膜组织移植至视网膜下的适宜的介质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2005-517468号公报

非专利文献

非专利文献1：A.Kuwahara等，“Generation of a ciliary margin-like stemcell niche from self-organizing human retinal tissue”Nature Communications,6,Article number:6286(2015).

非专利文献2：M.Mandai等，“Autologous InducedStem-Cell-Derived RetinalCells for Macular Degeneration”,The New England Journal of Medicine,2017,376(11),p.1038-1046.

非专利文献3：Y.Tian等，“Screening and optimization of potentialinjection vehicles for storage of retinalpigment epithelial stem cell beforetransplantation”,J Tissue Eng Regen Med.2019；13(1):p76-86.

非专利文献4：T.Nakazawa,等，“Tumor NecrosisFactor-MediatesPhotoreceptor Death in a Rodent Model of Retinal Detachment”InvestigativeOphthalmology&Visual Science,March 2011,Vol.52,No.3,p1384-1391

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的为提供适于用于治疗视网膜色素变性(RP:retinitis pigmentosa)等视网膜变性疾病的、视网膜组织向视网膜下移植的、介质以及包含视网膜组织及该介质的移植用组合物。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本申请的发明人针对用于将视网膜组织移植至视网膜下的移植用介质进行了潜心研究，结果发现了能够将视网膜组织(具体而言神经视网膜片)吸入至施予器具(移植用枪头)并吐出、对在合适地维持顶端面(apical surface)/基底面(basalsurface)的方向的同时移植至受体的视网膜下而言有用的移植用介质，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的内容。

[1]

用于将视网膜组织向视网膜下移植的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为5～500mPa·s，前述移植用介质包含透明质酸及制药学上可接受的水性液体。

[2]

如[1]的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为10～100mPa·s。

[3]

如[1]或[2]的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为1000(1/s)时的粘度为100mPa·s以下，且剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差为100mPa·s以下。

[4]

如[1]～[3]中任一项的移植用介质，其pH为7.0～7.5。

[5]

如[1]～[4]中任一项的移植用介质，其中，制药学上可接受的水性液体为平衡盐类溶液。

[6]

如[1]～[5]中任一项的移植用介质，其包含0.15w/v％～1.50w/v％的平均分子量50万～390万的透明质酸。

[7]

如[1]～[6]中任一项的移植用介质，其还包含硫酸软骨素。

[8]

如[7]所述的移植用介质，其包含0.3w/v％～1.0w/v％的硫酸软骨素。

[9]

如[1]～[8]中任一项的移植用介质，其不含抗菌剂及防腐剂。

[10]

移植用组合物，其包含移植用视网膜组织及[1]～[9]中任一项的移植用介质。

[11]

如[10]的移植用组合物，其中，上述移植用视网膜组织为包含神经视网膜层的移植用神经视网膜片。

[12]

如[11]的移植用组合物，其中，上述移植用神经视网膜片具有表面和背面，上述表面构成包含神经视网膜层的顶端面，上述背面构成接近神经视网膜的内层的基底面，上述移植用视网膜片的自表面起至背面的厚度为100μm～1000μm，上述移植用神经视网膜片的长径为600μm～2500μm，上述移植用神经视网膜片的短径为200μm～1500μm。

[13]

如[12]的移植用组合物，其中，上述表面呈曲率变化小的平滑的形状，上述背面具有曲率变化大的不规则形状。

[14]

如[11]～[13]中任一项的移植用组合物，其包含1个～30个的上述移植用神经视网膜片及5～500μl的上述移植用介质。

[15]

如[11]～[14]中任一项的移植用组合物，其中，上述移植用神经视网膜片为特征如下的神经视网膜片

(1)来源于多能干细胞，

(2)具有三维结构，

(3)包含神经视网膜层，所述神经视网膜层具有包含视细胞层及内层的多个层结构，

(4)上述视细胞层包含选自由视细胞前体细胞及视细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(5)上述内层包含选自由视网膜前体细胞、神经节细胞、无长突细胞及双极细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(6)上述神经视网膜层的表面具有顶端面，

(7)上述内层存在于沿上述顶端面存在的视细胞层的内侧，

(8)相对于上述神经视网膜片的表面的总面积，上述神经视网膜层的顶端面的面积为50％以上，

(9)相对于上述神经视网膜层的顶端面的总面积，连续上皮结构的面积为80％以上，

(10)确认到上述移植用神经视网膜片中的神经视网膜谱系细胞相关基因的表达、且未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达，上述非神经视网膜谱系细胞相关基因包含选自由脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

[16]

如[11]～[15]中任一项的移植用组合物，其中，上述移植用神经视网膜片为

(1)从包含神经视网膜层的细胞聚集体分离而得的，

(2)包含该细胞聚集体中的连续上皮组织的中心附近区域，且

(3)长径为600μm～2500μm，短径为200μm～1500μm及厚度为100μm～1000μm。

[17]

如[11]～[16]中任一项的移植用组合物，上述移植用神经视网膜片为

(1)从至少包含第一上皮组织及第二上皮组织的细胞聚集体分离而得的，

上述第一上皮组织包含人神经视网膜，上述第二上皮组织具有与上述第一上皮组织的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性、且包含非神经视网膜谱系细胞，

(2)包含距上述第二上皮组织最远的上述第一上皮组织上的区域，且

(3)长径为600μm～2500μm，短径为200μm～1500μm，厚度为100μm～1000μm，

上述第二上皮组织为选自由眼球相关组织、脑脊髓组织及其他的与上述第一上皮组织的神经视网膜不同的组织组成的组中的组织。

[18]

如[11]～[17]中任一项的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Rx阳性细胞的比例为30％以上80％以下、40％以上70％以下、45％以上60％以下、或50％以上60％以下。

[19]

如[11]～[18]中任一项的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Chx10阳性细胞的比例为10％以上80％以下、20％以上70％以下、30％以上60％以下、或40％以上50％以下。

[20]

如[11]～[19]中任一项的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Pax6阳性细胞的比例为10％以上80％以下、20％以上70％以下、30％以上60％以下、或40％以上50％以下。

[21]

如[11]～[20]中任一项的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Crx阳性细胞的比例为10％以上70％以下、10％以上60％以下、20％以上60％以下、30％以上60％以下、40％以上60％以下、或50％以上60％以下。

[22]

基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍或者神经视网膜的损伤的疾病的治疗方法，所述方法包括：将[11]～[21]中任一项的移植用组合物移植至需要移植的对象的视网膜下。

发明效果

通过本发明，能提供适于视网膜组织向视网膜下的移植的、介质以及包含视网膜组织及该介质的移植用组合物。该移植用组合物对用于治疗视网膜色素变性症等视网膜变性疾病的视网膜组织的移植治疗而言是有用的。

附图说明

[图1]为示出实施例1中使用移植用枪头将视网膜片向视网膜下移植的方法的图。

[图2]为示出实施例1中针对表12中示出的(1)～(10)的介质在30℃的条件下测定了剪切速度(剪切速率)与粘度的相关关系的结果的图表。

[图3]为示出实施例1中针对表13中示出的介质在25℃的条件下测定了剪切速度(剪切速率)与粘度的相关关系的结果的图表。

[图4]为示出参考例1中的、针对包含移植用神经视网膜的细胞聚集体用Crx及Chx10实施免疫染色的结果的荧光显微镜图像。

[图5]为示出参考例1中的、针对包含移植用神经视网膜的细胞聚集体用Rx及恢复蛋白实施免疫染色的结果的荧光显微镜图像。

[图6]为由典型的细胞聚集体制作帽(cap)和环(ring)的概念图。

[图7]为由呈各种形状的细胞聚集体制作帽和环的概念图。以黑色和灰色示出的部分表示目标外组织。

[图8]示出了典型的移植片的图像及移植片的示意图，同时示出了参考例3中的移植片的高度、长径及短径。

[图9]为示出了参考例4中的、针对移植片用Crx、Chx10、Rx及恢复蛋白实施免疫染色的结果的共聚焦荧光显微镜图像。

[图10A]示出了参考例5中的、从帽和环中提取的RNA的通过定量PCR分析基因表达的结果。

[图10B]示出了参考例5中的、从帽和环中提取的RNA的通过定量PCR分析基因表达的结果。

[图11]为示出参考例6中的、通过定量PCR对从环中提取的RNA进行分析之后，将移植片(帽)移植至大鼠视网膜下，通过荧光显微镜观察移植后的植活图像而得的结果的图像。

[图12]为示出参考例7中的、对由一个细胞聚集体制作的帽和环实施免疫染色的结果的荧光显微镜图像。

[图13]为示出参考例8中的、对由一个细胞聚集体制作的帽实施免疫染色的结果的荧光显微镜图像。

具体实施方式

1.移植用介质

本发明提供在将视网膜组织的移植片移植至哺乳动物的视网膜下时使用的移植用介质。

本发明的移植用介质只要为25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为5～500mPa·s、优选为10～100mPa·s、且包含透明质酸及制药学上可接受的水性液体的介质就没有限定。

另外，就本发明的移植用介质而言，优选的是，25℃条件下剪切速率为1000(1/s)时的粘度为100mPa·s以下，优选为30mPa·s以下，且剪切速率为1～10(1/s)时的粘度的变化量(即剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差)为100mPa·s以下，优选为30mPa·s以下。或者，剪切速率为1～10(1/s)时的粘度的变化率(即剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差，除以剪切速率为1(1/s)时的粘度时的百分率)为约10％以下。

本发明的移植用介质优选还包含硫酸软骨素。透明质酸及硫酸软骨素作为移植用介质的增粘成分发挥功能。

在本说明书中，透明质酸是具有D-葡糖醛酸与D-N-乙酰葡糖胺通过β-1,4和β-1,3的糖苷键交替连接的结构的、分子量为数万～数百万的直链状的高分子多糖。透明质酸具有高的保水能力和粘性，是被广泛用于药物、化妆品等的物质。在本说明书中，“透明质酸”意指一同包括游离体的透明质酸及其盐的概念。作为透明质酸的盐，可举出透明质酸的碱金属盐、碱土金属盐等，具体而言，可以使用市售的透明质酸钠、透明质酸钾等。

本说明书中的透明质酸只要能够将移植用介质的25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度保持在5～500mPa·s、优选10～100mPa·s，就没有特别限定，可以将平均分子量约50万～390万的透明质酸以0.15w/v％～1.50w/v％、优选0.15w/v％～0.75w/v％、更优选0.30w/v％～0.50w/v％的浓度配合于移植用介质中。

硫酸软骨素是具有在D-葡糖醛酸(GlcA)与N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)这两种糖重复的糖链上键合有硫酸的结构的黏多糖。在本说明书中，“硫酸软骨素”意指一同包含游离体的硫酸软骨素及其盐的概念。作为硫酸软骨素的盐，可举出硫酸软骨素的碱金属盐、碱土金属盐等，具体而言，可以使用市售的硫酸软骨素钠、硫酸软骨素钾等。

本说明书中的硫酸软骨素只要能够与透明质酸一同将移植用介质的25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度保持在5～500mPa·s、优选10～100mPa·s，就没有特别限定，可以将平均分子量约2.0万～2.4万的硫酸软骨素以0.3w/v％～1.0w/v％、优选0.4w/v％～0.7w/v％的浓度配合于移植用介质中。

所谓本发明的介质中的“制药学上可接受的水性液体”，只要是能施予至生物体且具有适于移植的物性的水溶液就没有特别限定，例如可以为包括缓冲液、输液、生理盐水、注射用水、灌流液等的水溶液。可优选举出缓冲液。

此处作为适于移植的物性，可举出pH、渗透压等。作为移植用介质的pH，只要是中性区域就没有特别限定，本发明的移植用介质只要调节为pH6.5～8.0、优选pH7.0～7.5左右即可。

作为移植用介质的渗透压，可举出低渗·等渗·高渗，优选接近等渗。作为渗透压比，只要调节为0.7～1.3、优选0.9～1.1即可。

作为“制药学上可接受的水性液体”，具体而言，可举出含有平衡盐类的水溶液(即，平衡盐类溶液)。在含有平衡盐类的水溶液中，可以适当选择并以不对被移植的视网膜组织的存活率造成影响的范围含有缓冲剂、等渗剂、pH调节剂、抗氧化剂、螯合剂等。

作为缓冲剂，例如，可举出磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、氨基酸、ε-氨基己酸等。

作为等渗剂，可举出山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等糖类、甘油、丙二醇等多元醇类、氯化钠等盐类、硼酸等。

作为螯合剂，可举出依地酸钠、柠檬酸等。

作为pH调节剂，例如，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、硼酸或其盐(硼砂)、盐酸、柠檬酸或其盐(柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠等)、磷酸或其盐(磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等)、乙酸或其盐(乙酸钠、乙酸铵等)、酒石酸或其盐(酒石酸钠等)等。

作为抗氧化剂，例如，可举出抗坏血酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢钠、干燥亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、生育酚等。

另外，本发明的移植用介质优选能够实施使用膜滤器等的过滤灭菌等灭菌处理。

作为“制药学上可接受的水性液体”，具体而言，可举出包含选自葡萄糖等糖类、氯化钙、氯化钠、及硫酸镁等无机盐、碳酸氢钠、乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、无水磷酸氢二钠、及盐酸等无机物、以及依地酸盐(例如，依地酸钠)等螯合剂等中的一种或多种成分的水溶液。

作为透明质酸或其盐，可以使用市售的透明质酸或其盐的水溶液。具体而言，可例示出：含有透明质酸钠0.6％、氯化钠、磷酸二氢钠及磷酸氢钠作为成分的OPEGAN(注册商标)0.6眼粘弹剂；含有透明质酸钠1.1％、氯化钠、磷酸二氢钠及磷酸氢钠作为成分的OPEGAN(注册商标)1.1眼粘弹剂；或含有透明质酸钠0.3％、ε-氨基己酸、依地酸钠水合物、氯化钾、氯化钠及pH调节剂作为成分的Hyalein Mini(注册商标)滴眼液0.3％。

制备制药学上可接受的水性液体时，可以使用作为眼内灌注·清洗液而市售的液体。作为眼内灌注·清洗液，具体而言，可以使用作为OPEGUARD(注册商标)而市售的1mL中含有葡萄糖1.5mg、氯化钙水合物0.18mg、硫酸镁水合物0.3mg、碳酸氢钠2.1mg、以及作为添加物的柠檬酸钠水合物、乙酸钠水合物及盐酸的水溶液、或氧化型谷胱甘肽眼灌流液等。另外，制备制药学上可接受的水性液体时，也可以使用汉克斯平衡盐类溶液(HBSS)、厄尔平衡盐类溶液(EBSS)、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、杜氏磷酸缓冲生理盐水(DPBS)等。

作为本发明的移植用介质的一个方式，可举出仅含有透明质酸作为增粘成分的移植用介质，具体而言，例如，可以将OPEGAN(注册商标)0.6眼粘弹剂与OPEGUARD等的水性液体按1：1～1：3进行配合而制备。作为其他方式，例如，可以将Hyalein Mini(注册商标)滴眼液0.3％与OPEGUARD等的水性液体按3：1～1：1进行配合而制备。

作为本发明的移植用介质的一个方式，可举出含有透明质酸、及硫酸软骨素作为增粘成分的移植用介质。此处作为透明质酸及硫酸软骨素的浓度，只要能够将移植用介质的25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度保持在5～500mPa·s、优选10～100mPa·s，就没有特别限定。作为本发明的移植用介质的一个方式，可举出包含0.15w/v％～1.50w/v％的平均分子量50万～390万的透明质酸、及0.3w/v％～1.0w/v％的分子量2.0万～2.4万的硫酸软骨素或其盐的移植用组合物。

作为本发明的移植用介质的一个方式，可以使用含有透明质酸钠、硫酸软骨素钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钠及等渗剂作为成分的Viscoat(注册商标)0.5眼粘弹剂。具体而言，例如，可以将Viscoat(注册商标)0.5眼粘弹剂与OPEGUARD等的水性液体按1：3～1：7进行配合而制备。

“制药学上可接受的水性液体”的特征在于优选不含抗菌剂及防腐剂。

2.移植用视网膜组织

(定义)

在本说明书中，所谓“组织”，是指具有形态、性质不同的一种或多种细胞以一定的模式立体地配置的结构的细胞群的结构体。

在本说明书中，所谓“视网膜组织”，意指一种或多种在生物体视网膜中构成各视网膜层的视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、缪勒氏神经胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、它们的前体细胞、或视网膜前体细胞等视网膜细胞立体地配置而成组织，优选以层状立体地配置而成的组织，也可以为后述的细胞聚集体、细胞片。

视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞、缪勒氏神经胶质前体细胞、视网膜色素上皮前体细胞是指确定会分别向视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、缪勒氏神经胶质细胞、视网膜色素上皮细胞分化的前体细胞。

“视网膜前体细胞(retinal progenitor cell)”是指也能分化为视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞、缪勒氏神经胶质细胞、视网膜色素上皮前体细胞等中的任何未成熟的视网膜谱系细胞的前体细胞，且是最终也能分化为视细胞、视杆细胞、视锥细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞等中的任何成熟的视网膜谱系细胞的前体细胞。

在本说明书中，所谓“视网膜层”，意指构成视网膜的一个或多个细胞以一定的模式形成了单层或多层的层状的细胞群，具体而言，可举出包含视网膜色素上皮细胞的视网膜色素上皮层、及包含神经视网膜细胞的神经视网膜层。也将神经视网膜细胞称为视网膜层特异性神经细胞。

作为神经视网膜层，可举出外界膜、视细胞层(外颗粒层)、外网层、内颗粒层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层及内界膜。

在本说明书中，“神经视网膜”意指包含神经视网膜层的视网膜组织。

作为神经视网膜细胞，可举出视细胞(包括视细胞前体细胞、成熟视细胞)、双极细胞、视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、缪勒氏神经胶质细胞、及它们的前体细胞。

在本说明书中，“神经视网膜前体细胞”意指神经视网膜细胞的前体细胞。

所谓“视细胞(photoreceptor cell)”，在生物体中存在于视网膜的视细胞层中，具有吸收光刺激并转换为电信号的作用。视细胞有于亮处发挥功能的视锥细胞(conecell)和于暗处发挥功能的视杆细胞(或杆体细胞)(rod cell)这两种。另外，作为视锥细胞，可举出表达S-视蛋白(S-opsin)而接收蓝光的S视锥细胞、表达L-视蛋白而接收红光的L视锥细胞、和表达M-视蛋白而接收绿光的M视锥细胞。视细胞是由视细胞前体细胞分化并成熟的。本领域技术人员可以通过例如后述的细胞标志物(在视细胞前体细胞中表达的Crx及Blimp1、在视细胞中表达的恢复蛋白(Recoverin)、在成熟视细胞中表达的视紫红质(Rhodopsin)、S-视蛋白及M/L-视蛋白等)的表达、外节结构的形成等来容易地确认细胞是否为视细胞或者视细胞前体细胞。在一个方式中，视细胞前体细胞为Crx阳性细胞，视细胞为视紫红质、S-视蛋白及M/L-视蛋白阳性细胞。在一个方式中，视杆细胞为NRL及Rhodopsin阳性细胞。在一个方式中，S视锥细胞为S-视蛋白阳性细胞、L视锥细胞为L-视蛋白阳性细胞、及M视锥细胞为M-视蛋白阳性细胞。即本说明书中的视细胞是包括视细胞前体细胞及成熟视细胞的概念。

需要说明的是，神经视网膜细胞不含后述的视网膜色素上皮细胞及睫状体细胞。

作为本说明书中的视网膜组织的一个方式，可举出神经视网膜，优选包含视网膜层特异性神经细胞层的神经视网膜，进一步优选包含视细胞层的神经视网膜。

神经视网膜优选包含10％以上、更优选包含20％以上的视细胞或视细胞前体细胞。

神经视网膜优选包含10％以上、更优选包含20％以上的神经视网膜前体细胞。另外，神经视网膜优选包含10％以上的视细胞前体细胞。另外，在一个方式中，神经视网膜包含3％以上的成熟视细胞。

作为本说明书中的视网膜组织的一个方式，可举出同时包含神经视网膜及含RPE细胞的细胞层的视网膜组织。作为该视网膜组织，例如，可举出WO2019/050015中记载的被RPE细胞被覆的神经视网膜。

作为本说明书中的视网膜组织的一个方式，可举出神经视网膜与RPE细胞介由高分子的水凝胶而粘附的视网膜组织(复合体)。具体而言，可举出下述复合体：包含神经视网膜、视网膜色素上皮细胞和水凝胶的复合体，其中，上述神经视网膜及上述视网膜色素上皮细胞各自来源于人多能干细胞，上述神经视网膜中，形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，上述视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞及视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞。此处作为水凝胶，只要是为高分子且具有对将组织与组织粘附而言有用的物性的物质(例如，可举出糊·粘接剂·具有进行凝胶化的物性的物质·明胶·油脂等)就没有特别限定。

构成上述视网膜组织的细胞可以以在各自中表达的(阳性)或不表达(阴性)的视网膜细胞标志物为指标进行检测或鉴定。

作为视网膜细胞标志物，可举出在视网膜前体细胞中表达的Rx(也称为Rax)及PAX6、在神经视网膜前体细胞中表达的Rx、PAX6及Chx10(也称为Vsx2)，或者，在视细胞前体细胞中表达的Crx及Blimp1。另外，作为视网膜前体细胞或视网膜细胞的阴性标志物，可举出Nkx2.1及SOX1。

作为视网膜层特异性神经细胞的标志物，可举出在视细胞(尤其是成熟视细胞)中表达的恢复蛋白、在视细胞(尤其是视细胞前体细胞)中表达的Crx、Blimp1、在杆体细胞中表达的Rhodopsin、在视杆细胞及视杆细胞前体细胞中表达的Nrl、在视锥细胞中表达的S-视蛋白及LM-视蛋白、在锥体细胞、视锥细胞前体细胞及神经节细胞中表达的RXR-γ、在视锥细胞之中于分化初期出现的视锥细胞或其前体细胞中表达的TRβ2、OTX2及OC2、在双极细胞中表达的Chx10、PKCα、Goα、VSX1及L7、在视网膜神经节细胞中表达的TuJ1及Brn3、在无长突细胞中表达的Calretinin及HPC-1、在水平细胞中表达的Calbindin、在水平细胞、无长突细胞及神经节细胞中共通地表达的Pax6等。

另外，视细胞或视细胞前体细胞的出现比例少的、包含大量神经视网膜前体细胞、形成视细胞层前的分化阶段的层称为“成神经细胞层(neuroblastic layer)”，存在内成神经细胞层和外成神经细胞层。本领域技术人员可以通过已知的方法、例如明视野显微镜下的颜色浓淡(外成神经细胞层色淡，内成神经细胞层色浓)来进行判断。

本领域技术人员可以容易地确认视网膜细胞标志物有无表达、或者细胞群或组织中的视网膜细胞标志物阳性细胞的比例。例如，可举出使用抗体的手段、使用核酸引物的手段、使用测序反应的手段。作为使用抗体的手段，可以通过例如使用市售抗体的流式细胞术、免疫染色等手段，将特定的视网膜细胞标志物阳性细胞的数量除以总细胞数来确认视网膜细胞标志物的蛋白质的表达。作为使用核酸引物的手段，可以通过例如PCR法、半定量PCR法、定量PCR法(例如：实时PCR法)来确认视网膜细胞标志物的RNA的表达。作为使用测序反应的手段，可以使用例如核酸测序仪(例如：下一代测序仪)来确认视网膜细胞标志物的RNA的表达。

“阳性细胞”意指在细胞表面上或细胞内表达特定标志物的细胞。例如，“Chx10阳性细胞”意指表达Chx10蛋白的细胞。

“阴性细胞”意指在细胞表面上或不表达特定标志物的细胞。例如，“SOX1阴性细胞”意指不表达SOX1蛋白的细胞。此处所谓“不表达”，包括其表达量在检测限以下的情况、或者与阳性细胞相比该表达为1/10以下、优选1/50以下的情况。

在其他方式中，例如，“SOX1阴性细胞”意指不表达SOX1的mRNA的细胞。此处所谓“不表达”，包括其表达量在检测限以下的情况、或者与阳性细胞相比该表达为1/10以下、优选1/50以下的情况。尤其是用qPCR法测定mRNA量的情况下，可以用ΔCt值对靶基因(例如SOX1)与内标(GAPDH、ACTB)的差量进行评价，“不表达”的情况下，包括ΔCt值为4以上、更优选为6以上、进一步优选8以上的情况。

“视网膜色素上皮细胞”意指生物体视网膜中存在于神经视网膜的外侧的上皮细胞。本领域技术人员可以通过例如细胞标志物(RPE65、MITF、CRALBP、MERTK、BEST1、TTR等)的表达、黑色素颗粒的存在(黑褐色)、细胞间的紧密连接、多边形·铺路石状的特征性细胞形态等来容易地确认细胞是否为视网膜色素上皮细胞。可以通过VEGF及PEDF等细胞因子的分泌能力等来容易地确认细胞是否具有视网膜色素上皮细胞的功能。在一个方式中，视网膜色素上皮细胞为RPE65阳性细胞、MITF阳性细胞、或者RPE65阳性且MITF阳性细胞。

“睫状体”包含发育过程及成体的“睫状体”、“睫状边缘带”、“纤毛体(Ciliarybody)”。作为“睫状体”的标志物，可举出Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4。作为“睫状边缘带(ciliary marginal zone；CMZ)”，例如，可举出作为在生物体视网膜中存在于神经视网膜与视网膜色素上皮的边界区域的组织、且包含视网膜的组织干细胞(视网膜干细胞)的区域。睫状边缘带也被称为睫状缘(ciliarymargin)或视网膜缘(retinalmargin)，睫状边缘带、睫状缘及视网膜缘是同等的组织。已知睫状边缘带在向视网膜组织的视网膜前体细胞、分化细胞的供给、视网膜组织结构的维持等方面发挥重要作用。作为睫状边缘带的标志物基因，例如，可举出Rdh10基因(阳性)、Otx1基因(阳性)及Zic1(阳性)。“睫状边缘带样结构体”是与睫状边缘带类似的结构体。

(视网膜组织的结构)

本说明书中的视网膜组织可以为具有三维立体结构的形态、即细胞聚集体(cellaggregate；也称为细胞团块(cell cluster)；立体组织·类器官(organoid))，也可以为层状的结构二维扩展而成的细胞片(cell sheet)、即视网膜细胞片(retinal cell sheet)。细胞聚集体·细胞团块中也包括球体(Sphere)。此处球体意指具有近似球状的立体形状的细胞聚集体。作为近似球状的立体形状，是具有三维结构的形状，可举出投影至二维平面时例如呈现圆形或椭圆形的球状形、及多个球状形融合而形成的形状(例如进行二维投影时，显示出2～4个圆形或椭圆形重叠而形成的形状)。在一个方式中，聚集体的核心部具有下述特征：具有小泡性层状结构，在明视野显微镜下，观察到中央部分较暗，外缘部分较亮。

在一个方式中，前述细胞聚集体或细胞片中所含的一部分或全部的细胞彼此粘附。即，聚集体的一部分或全部中，细胞彼此形成细胞-细胞间连接(cell-cell junction)或细胞粘附(cell adhesion)、例如粘附连接(adherence junction)。

前述细胞聚集体或细胞片的形状及大小没有特别限定，作为移植片被施予至哺乳动物、优选猴或人的情况下，可根据受体中视网膜组织的需要修复的面积而适当设定。即，被移植于受体的视网膜组织的大小为适于受体的大小、且为能在用于移植的设备中于细胞吸入部分(移植用的针管)的内部移动的大小。

作为本说明书中的移植用组合物中所含的视网膜组织的一个方式，具体而言，可举出短径为200～1500μm、600～2500μm以下、厚度为100μm～1000的视网膜组织。适于移植的大小的视网膜组织、即移植片可以从细胞聚集体或细胞片适当以适于移植的大小切出而制备。

具体而言，可以从细胞聚集体切出适于移植的大小的细胞片而制成移植片。

本说明书中的视网膜组织也可以具有上皮结构。上皮结构是通过细胞无间隙地覆盖组织的表面而形成的，进行极化而具有“顶端面(apical surface)”和“基底膜(basalsurface)”。此处“基底膜”是包含大量层粘连蛋白及IV型胶原蛋白的50～100nm的层，“顶端面”是指在“基底膜”的相反侧形成的表面(表层面)。在一个方式中，“顶端面”是指：在分化阶段进行至可确认到视细胞或视细胞前体细胞的程度的视网膜组织中，与形成了外界膜且存在视细胞、视细胞前体细胞的视细胞层(外颗粒层)相接的面。另外，这样的顶端面可以使用针对顶端面的标志物(例如：atypical-PKC(以下也简称为“aPKC”)、E-cadherin、N-cadherin)的抗体，利用本领域技术人员已知的免疫染色法等进行鉴定。

形成上皮结构的细胞、即上皮细胞通过粘附连接(adherence junction)及/或紧密连接(tight junction)在上皮细胞彼此间产生牢固的连接，可以形成细胞的层。该细胞层层叠1层至十几层而形成上皮结构。

在本说明书中，将包含神经组织的上皮结构称为神经上皮。尤其是将包含神经视网膜的上皮结构称为神经视网膜上皮(neural retinal epithelium)。

作为一个方式，本说明书中的神经视网膜也可以采取经极化的层结构。例如，神经视网膜为细胞片的形状的情况下，也可以具有顶端/基底的极性。另外，神经视网膜为球状的细胞聚集体的情况下，该细胞聚集体也可以具有上皮结构，该上皮结构也可以在细胞聚集体的表面与内侧具有顶端/基底的极性。

作为本说明书中的移植用组合物中所含的视网膜组织的一个方式，可举出下述视网膜组织：其包含表面(顶端面)和背面(基底面)，表面构成包含在细胞间形成粘附连接而作为上皮组织的神经视网膜层的顶端面，背面构成接近神经视网膜的内层的基底面。可以将这样的视网膜组织称为神经视网膜上皮。作为这样的视网膜组织，优选片状的视网膜组织即神经视网膜片(neural retina sheet)。表面呈曲率变化小的平滑的形状，背面具有曲率变化大的不规则形状。一个方式中，例如，视网膜组织的表面的曲率变化有时类似椭圆(例如，相对于短径1而言长径为1～10的椭圆)的曲率变化(也可以说是曲率的连续变化)。一个方式中，例如，视网膜组织的背面的曲率变化有时类似如“锯齿”那样在正值与负值间往复的曲率的急剧变化(也可以说是曲率的急剧变化)。

本说明书中的视网膜组织优选为具有连续上皮结构的视网膜组织。“连续上皮结构”是指上皮组织连续的状态，也称为“连续上皮”。所谓上皮组织连续，例如是沿相对于上皮组织的切线方向排列10个细胞～10⁷个细胞、优选沿切线方向排列30个细胞～10⁷个细胞、更优选排列10²个细胞～10⁷个细胞的状态。连续上皮结构不具有玫瑰花结样结构中观察到的那样顶端面***的结构。在一个方式中，就具有连续上皮结构的视网膜组织的截面的单位面积的细胞数而言，在对例如10μm厚左右的冷冻切片中的细胞核的数量进行评价的情况下，每100μm²中，有10个细胞～900个细胞，优选30个细胞～300个细胞，更优选50个细胞～250个细胞，进一步更优选75个细胞～160个细胞。

例如，对视网膜组织中形成的连续上皮而言，视网膜组织具有上皮组织特有的顶端面，顶端面与形成神经视网膜层的各层之中的至少视细胞层(外颗粒层)等大致平行地、且连续地形成于视网膜组织的表面。例如在由多能干细胞制作的包含视网膜组织的细胞聚集体的情况下，顶端面形成于聚集体的表面，形成下述连续神经上皮：10个细胞以上、优选30个细胞以上、更优选100个细胞以上、进一步优选400个细胞以上的视细胞或视细胞前体细胞相对于表面沿切线方向有规律地连续排列。这样的包含连续神经上皮的神经视网膜为包含连续上皮的神经视网膜上皮。

可以通过视网膜组织所具有的顶端面的连续性(即不***的形态)来确认视网膜组织是否具有连续上皮。例如，可以通过对顶端面的标志物(例如：aPKC、E-cadherin、N-cadherin)、位于顶端面侧的视细胞或视细胞前体细胞的标志物(例如：Crx或恢复蛋白)进行免疫染色，针对所取得的图像等分析顶端面与视细胞层、及各视网膜层的位置关系，从而判定顶端面的连续性。针对顶端面、视细胞层(外颗粒层)以外的视网膜层，可以通过将细胞核染色的DAPI染色、PI染色、Hoechst染色、或基于定位于细胞核的标志物蛋白(Rx、Chx10、Ki67、Crx等)等的免疫染色等来鉴定。

具体而言，通过同时表达存在于顶端面侧的细胞的标志物、即视细胞标志物或视细胞前体细胞标志物及能将细胞核染色的标志物的细胞连续地存在，由此鉴定顶端面的连续性。

作为本说明书中的视网膜组织，可优选举出包含视细胞或视细胞前体细胞的神经视网膜、换言之包含视细胞层的神经视网膜。

作为本说明书中的视网膜组织，可优选举出特征如下的神经视网膜：神经视网膜层或视细胞层具有连续上皮结构、即具有连续神经上皮结构。

作为本说明书中的视网膜组织，也可以在视细胞层的内侧包含“内层”，前述“内层”包含神经节细胞、无长突细胞。该内层也可以与基底面相接。

上述神经视网膜可以通过用后述的制造方法来制造包含神经视网膜的细胞聚集体而获得。

(包含神经视网膜的细胞聚集体)

在一个方式中，包含神经视网膜的细胞聚集体为球状细胞聚集体。在一个方式中，包含神经视网膜的细胞聚集体中，有时多个神经视网膜重叠存在(例如：参见图7中的概念图(1)及(2)等)。在一个方式中，包含神经视网膜的细胞聚集体包含第一上皮组织(目标上皮组织)及第二上皮组织(目标外上皮组织)，所述第一上皮组织包含移植用神经视网膜，所述第二上皮组织具有与第一上皮组织的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性，且包含非神经视网膜谱系细胞。此处，第一上皮组织表示实质上不含非神经视网膜谱系细胞(目标外细胞)、能切出移植用神经视网膜的上皮组织。另一方面，第二上皮组织也可包含神经视网膜，但由于含有目标外细胞，因此对切出移植用神经视网膜而言是不合格的上皮组织。在其他方式中，包含神经视网膜的细胞聚集体仅包含含移植用神经视网膜的第一上皮组织(目标上皮组织)，不包含目标外上皮组织。

(移植用视网膜组织)

移植用视网膜组织为本说明书中的视网膜组织、并且适用于人移植的人视网膜组织，优选为神经视网膜，更优选仅由神经视网膜形成。

移植用视网膜组织可以从上述细胞聚集体切出适于移植的部位而制备。作为一个方式，可以通过从包含神经视网膜的细胞聚集体切出神经视网膜从而制备移植用视网膜组织。视网膜组织、优选神经视网膜包含连续上皮的情况下，可以切出包含该连续上皮的片状的视网膜组织(以下也称为视网膜片)、优选神经视网膜(以下也称为神经视网膜片)。

移植用神经视网膜至少包含视细胞层，视细胞层至少形成于细胞聚集体的最外侧，另外，视细胞或视细胞前体细胞也可存在于内侧，或者视细胞层也可形成于内侧。视细胞等沿细胞聚集体的表面的切线方向连续即彼此粘附而存在，通过视细胞等沿细胞聚集体的表面的切线方向连续地存在，从而形成包含视细胞等的视细胞层。需要说明的是，切线方向是指，相对于细胞聚集体的表面的切线方向、即视细胞层中的视细胞等进行排列的方向，相对于该神经视网膜呈平行方向或横向。另外，上皮组织的表面中的切线斜率是指，上皮组织中一个个细胞沿一定方向排列时细胞进行排列的方向，指相对于上皮组织(或上皮片)呈平行方向或横向。

用于制备移植用神经视网膜的细胞聚集体也可以包含神经视网膜以外的目标外组织。作为该目标外组织，可举出神经视网膜以外的上皮组织、即包含目标外上皮组织的第二上皮组织。作为第二上皮组织，可举出眼球相关组织及脑脊髓组织。眼球相关组织意指非神经视网膜的眼球组织周边的组织，可举出视网膜色素上皮细胞、睫状体(例如：睫状边缘带)、晶状体、角膜。脑脊髓组织意指脑及脊髓的神经组织，可举出前脑、端脑、大脑、间脑、下丘脑、中脑、后脑、小脑、脊髓。一个方式中，脑脊髓组织可以包含垂体。

作为包含第一上皮组织及第二上皮组织的细胞聚集体的一个例子，可举出图6中的概念图及图7中的概念图(3)及(5)等示出的细胞聚集体。图6中的概念图示出了在作为第一上皮组织的神经视网膜的一部分中，眼球相关组织(视网膜色素上皮细胞、睫状体)作为第二上皮组织(图6的黑色部分)存在的细胞聚集体的一个例子。图7中的概念图(3)示出了在多个神经视网膜重叠存在的情况下(例如：图7中的概念图(1)及(2))，还存在眼球相关组织(视网膜色素上皮细胞、睫状体)(图7中的概念图(3)的黑色部分)作为第二上皮组织的细胞聚集体的一个例子。图7中的概念图(5)示出了脑脊髓组织(大脑等)作为第二上皮组织(图7中的概念图(5)的灰色部分)存在的细胞聚集体的一个例子。存在以图7中的概念图(4)的方式，在包含移植用神经视网膜的细胞聚集体的内侧包含目标外组织的情况。在该情况下，由于不符合“具有与第一上皮组织的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性”的定义，因此不属于第二上皮组织。就移植用神经视网膜和品质评价用样品而言，从在内侧不包含目标外组织的细胞聚集体中进行选择是优选的。

＜提取工序＞

从细胞聚集体切出移植用神经视网膜的情况下，期望以包含视细胞或视细胞前体细胞的标志物阳性细胞的情况为指标。从细胞聚集体切出移植用神经视网膜的情况下，期望以包含视网膜前体细胞或神经视网膜前体细胞的标志物阳性细胞的情况为指标。另外，期望以不含目标外细胞的标志物阳性细胞的情况为指标。

为了获得包含视细胞或视细胞前体细胞标志物阳性细胞、且目标外细胞的标志物阳性细胞为基准以下的(或者目标外细胞标志物为阴性)移植用神经视网膜，期望事先对移植用神经视网膜的品质进行评价。

例如，移植用神经视网膜的品质通过提取(sampling)来源于多能干细胞的包含具有上皮结构的神经视网膜的细胞聚集体的一部分或全部作为品质评价用样品(以下称为“提取工序”)、并用本领域技术人员已知的方法对在所提取的样品中表达的标志物进行检测，从而进行评价。提取细胞聚集体的一部分作为品质评价用样品意指，从多个细胞聚集体中选择一部分细胞聚集体(1个或多个)、或全部细胞聚集体，将选定的细胞聚集体中的一部分使用镊子、剪刀及/或刀等作为评价用样品进行分离(例如：切出(dissect))。提取细胞聚集体的全部作为品质评价用样品意指，从多个细胞聚集体中选择一部分细胞聚集体(1个或多个)细胞聚集体，将选定的1或多个细胞聚集体的全部作为品质评价用样品分别取出(pick up)。从多个细胞聚集体中选择1个或多个细胞聚集体的情况下，随机地进行提取是优选的。在本说明书中，将提取细胞聚集体的一部分作为品质评价用样品的情况下的细胞聚集体记作“包含品质评价用样品的细胞聚集体”，将提取细胞聚集体的全部作为品质评价用样品的情况下的细胞聚集体记作“品质评价用样品的细胞聚集体”。

在一个方式中，品质评价用样品为来源于多能干细胞的包含具有上皮结构的神经视网膜的细胞聚集体的一部分。通过提取细胞聚集体的一部分作为品质评价用样品，从而具有不完全破坏细胞聚集体、可将剩余部分中包含的神经视网膜用于移植这样的优点。即，若通过后述的判定工序将作为细胞聚集体的一部分的品质评价用样品判定为合格，则可将该包含品质评价用样品的细胞聚集体中的具有上皮结构的神经视网膜用作移植用神经视网膜，并用于移植。

在细胞聚集体中，可以将具有连续的上皮结构并可见外成神经细胞层和内成神经细胞层分为2层的部位判定为神经视网膜。另一方面，作为第二上皮组织的眼球相关组织、尤其是视网膜色素上皮细胞在目视或显微镜下呈现黑色，因而本领域技术人员可以容易地与神经视网膜进行区别。另外，就作为第二上皮组织的脑脊髓组织而言，若在目视或显微镜下注意到在细胞聚集体的表面上确认不到连续的上皮结构、确认不到神经视网膜特有的形态特征、及/或色调看起来暗沉等的形态的特征，则本领域技术人员可以容易地与神经视网膜进行区别。因此，即使是包含第二上皮组织的细胞聚集体，本领域技术人员也可以从包含神经视网膜的第一上皮组织中分离移植用神经视网膜和品质评价用样品。

如上所述，在一个方式中，基于与移植用神经视网膜或移植用神经视网膜的候选物的一定的位置关系，设定、提取品质评价用样品。即，通过移植用神经视网膜或其候选物的设定，可以确定作为品质评价用样品切出的区域。此处，在一个方式中，移植用神经视网膜(也称为移植片、帽(Cap))及其候选物可以基于上述细胞聚集体中的位置(例如：上皮组织(连续上皮组织)的中心附近，具有第二上皮组织的情况下，进一步为距第二上皮组织最远的第一上皮组织上的区域)、和后述的(移植用神经视网膜片)中记载的大小等进行确定。因此，本领域技术人员可以将具有该特征的神经视网膜设定为移植用神经视网膜或其候选物。

就从同一细胞聚集体中提取移植用神经视网膜和品质评价用样品的情况下的品质评价用样品(也称为环(Ring))而言，本领域技术人员可以设定为下述区域，所述区域在至少局部与如上所述设定的移植用神经视网膜连续或接近，并在可以进行品质评价的范围内尽可能窄。就提取同一批次的该细胞聚集体中的1个或多个细胞聚集体的一部分作为品质评价用样品的情况下的品质评价用样品而言，本领域技术人员可以提取该细胞聚集体中的上述移植用神经视网膜或其候选物的部分。作为该情况下的品质评价用样品切出的大小，可以是后述的(移植用神经视网膜片)中记载的大小，也可以更小。因此，可以基于与移植用神经视网膜或其候选物的位置的关系及上述大小来设定提取品质评价用样品。

＜检测工序＞

本发明所涉及的移植用神经视网膜的品质评价方法包括：对品质评价用样品中的神经视网膜谱系细胞相关基因及非神经视网膜谱系细胞相关基因(目标外细胞相关基因)的表达进行检测(检测工序)。该检测工序优选对前述基因的表达量定量地进行检测。目标外细胞相关基因包含选自由脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

(神经视网膜谱系细胞相关基因)

神经视网膜谱系细胞相关基因(目标细胞相关基因)意指神经视网膜谱系细胞所表达的基因。作为神经视网膜谱系细胞相关基因，优选为在视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经细胞、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(杆状双极细胞、锥状双极细胞)、缪勒氏神经胶质细胞、或这些细胞的前体细胞、神经视网膜前体细胞等中，较之目标外细胞而言高水平表达的基因。作为神经视网膜谱系细胞相关基因，可举出上述神经视网膜谱系细胞标志物，优选RAX、Chx10、SIX3、SIX6、RCVRN、CRX、NRL及NESTIN。将神经视网膜谱系细胞标志物的GenBank ID示于下述表1。

[表1]

基因名称	GenBank ID
		RAX	NM_013435.2
Ch×10	NM_182894.2
		SIX3	NM_005413.4
SIX6	NM_007374.2
		RCVRN	NM_002903.2
CRX	NM_000554.6
		NRL	NM_006177.4
NESTIN	NM_006617.2

就神经视网膜谱系细胞相关基因而言，表1记载的基因是优选的，但并不限于此。除此以外，作为神经视网膜谱系细胞相关基因，可举出Rax2、Vsx1、Blimp1、RXRG、S-视蛋白、M/L-视蛋白、Rhodopsin、Brn3、L7等。

(非神经视网膜谱系细胞相关基因)

可以通过对在制造包含神经视网膜的细胞聚集体作为医药品原材料的过程中作为副产物被诱导的目标外细胞、及可能作为副产物而制造该目标外细胞的细胞或组织中表达的基因(以下称为非神经视网膜谱系细胞相关基因或目标外细胞相关基因)进行检测从而进行鉴定。

在一个方式中，非神经视网膜谱系细胞相关基因(目标外细胞相关基因)可举出脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因。在一个方式中，可包含未分化iPS细胞标志物基因作为非神经视网膜谱系细胞相关基因。

在一个方式中，脑脊髓组织标志物基因可以是选自由端脑标志物基因、间脑·中脑标志物基因及脊髓标志物基因组成的组中的1个以上的基因。间脑·中脑标志物基因可以是选自由间脑标志物基因、中脑标志物基因、及与作为间脑的一部分的下丘脑相关的下丘脑标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

在一个方式中，眼球相关组织标志物基因可以是选自由视柄标志物基因、睫状体标志物基因、晶状体标志物基因及视网膜色素上皮标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

端脑标志物基因意指在端脑中表达的基因。端脑标志物基因可包括选自由FoxG1(别名Bf1)、Emx2、Dlx2、Dlx1及Dlx5组成的组中的1个以上的基因。将端脑标志物基因的GenBank ID示于下述表2。

[表2]

就端脑标志物基因而言，表2记载的基因是优选的，但并不限于此。除此以外，作为端脑标志物基因，可举出Emx1、LHX2、LHX6、LHX7、Gsh2等。

间脑·中脑标志物基因意指在间脑及/或中脑中表达的基因。间脑·中脑标志物基因可包括选自由OTX1、OTX2及DMBX1组成的组中的1个以上的基因。将间脑·中脑标志物基因的GenBank ID示于下述表3。间脑·中脑标志物基因可包括与作为间脑的一个区域的下丘脑相关的、后述的下丘脑标志物。即，间脑·中脑标志物基因可包括选自由OTX1、OTX2、OTX2、DMBX1、Rx、Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1组成的组中的1个以上的基因。

[表3]

下丘脑标志物基因意指在下丘脑中表达的基因。下丘脑标志物基因可包括选自由Rx、Nkx2.1、Dmbx1、OTP、gad1、FGFR2及EFNA5组成的组中的1个以上的基因。将下丘脑标志物基因的GenBank ID示于下述表4。

[表4]

脊髓标志物基因意指在脊髓中表达的基因。脊髓标志物基因可包括选自由HoxB2、HoxA5、HOXC5、HOXD1、HOXD3及HOXD4组成的组中的1个以上的基因。将脊髓标志物基因的GenBank ID示于下述表5。

[表5]

就脊髓标志物基因而言，表5记载的基因是优选的，但并不限于此。除此以外，作为脊髓标志物基因，可举出Hox基因簇的基因簇等。

另一方面，在一个方式中，在制造工序中使用类视黄醇类(例如可举出视黄酸、视黄醛、视黄醇、全反式视黄酸、11-顺式视黄酸)时，即使在制造了品质良好的视网膜组织的情况下，仍可观察到HOX基因(例如，HOXC5、HOXA5及HOXB2)的表达。HOX基因被认为表达受视黄酸信号调控，HOX基因表达以不影响视网膜组织的分化诱导的程度增加。这一视黄酸信号的效果被认为是由沿前后轴的后部化(posteriorization)导致的。因此，在制造工序中使用类视黄醇类时(尤其是在开始向视网膜分化诱导的时间之后使用类视黄醇类的情况下)，将HOX基因(例如，HOXC5、HOXA5及HOXB2)排除在品质评价对象基因之外，或者即使确认到这些基因的表达，也将移植用神经视网膜的品质判断为良好。

视柄标志物基因意指在视柄中表达的基因。视柄标志物基因可包括选自由GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A组成的组中的1个以上的基因。将视柄标志物基因的GenBank ID示于下述表6。

[表6]

晶状体标志物基因意指在晶状体中表达的基因。晶状体标志物基因可包括选自由CRYAA及CRYBA1组成的组中的1个以上的基因。将晶状体标志物基因的GenBank ID示于下述表7。

[表n

睫状体标志物基因意指在睫状体、睫状边缘带、及/或Ciliary body中表达的基因。睫状体标志物基因可包括选自由Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4组成的组中的1个以上的基因。将睫状体标志物基因的GenBank ID示于下述表8。

[表8]

视网膜色素上皮标志物基因意指在视网膜色素上皮细胞中表达的基因。视网膜色素上皮标志物基因可举出上述视网膜色素上皮标志物，可包括选自由MITF、TTR及BEST1组成的组中的1个以上的基因。将视网膜色素上皮标志物基因的GenBank ID示于下述表9。

[表9]

/>

在一个方式中，目标外细胞相关基因还可包括未分化多能干细胞标志物基因。

未分化多能干细胞标志物基因可包括选自由Oct3/4、Nanog及lin28组成的组中的1个以上的基因。优选地，未分化多能干细胞标志物基因为选自由Oct3/4、Nanog及lin28组成的组中的1个以上的基因。将未分化多能干细胞标志物基因的GenBank ID示于下述表10。

[表10]

(检测手段)

在一个方式中，就神经视网膜谱系细胞相关基因及非神经视网膜系目标外细胞相关基因的表达的检测而言，没有特别限定，可举出Western印迹、免疫染色、流式细胞术分析/流式细胞仪(FACS(注册商标，BD公司制)等)、Northern印迹、电泳法、PCR(优选定量PCR(qPCR)及/或实时PCR)、基因芯片分析、下一代测序仪等手段。其中，从定量性、检测灵敏度、结果的稳定性和速度的观点考虑，定量PCR是有用的。进而通过将用于实施单细胞的定量PCR的装置(例如，Biomark HD(Fluidigm公司制)等)应用于通常的定量PCR，可以在短时间评价多个品质评价用样品。

在一个方式中，可以通过定量PCR同时检测2个以上的品质评价用样品中的、各神经视网膜谱系细胞相关基因及非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达量。该定量PCR例如可以经由下述包括下述工序(1)～(5)的方法实施。具体的方法是本领域技术人员已知的。

工序(1)，准备流路板、含有由2个以上的上述品质评价用样品得到的核酸的溶液(样品溶液)、和对1个以上的上述神经视网膜谱系细胞相关基因或上述非神经视网膜谱系细胞相关基因具有特异性的1个或多个引物的溶液(引物溶液)，前述流路板具有1组包含8个以上且800个以下独立的样品孔的样品孔组、1组以上包含8个以上且800个以下独立的引物孔的引物孔组、以及将样品孔组中的独立的样品孔与各引物孔组中的独立的引物孔相连接的流路；

工序(2)，在样品孔组中，针对每个上述品质评价用样品以成为1样品溶液/1样品孔的方式添加上述样品溶液；

工序(3)，在上述1个以上的引物孔组中，将上述引物溶液以成为不同的引物孔组的方式添加至1个以上的引物孔中；

工序(4)，介由上述流路，将上述引物分别与上述核酸进行混合；及

工序(5)，使用(4)中得到的混合液实施定量PCR。

另外，使用能检测表达细胞的比例的流式细胞仪的流式细胞术分析也是有用的。近年来，检测速度不断改良，也可利用具备高通量性、能评价大量检体的流式细胞仪(FACS(注册商标)等)。因此，就神经视网膜谱系细胞相关基因及非神经视网膜系目标外细胞相关基因的表达的检测而言，高通量流式细胞仪的利用也是有用的。这样的高通量流式细胞仪可以使用市售品(例如：MACSQuant(注册商标)Analyzers：Miltenyi Biotec公司制)。

＜判定工序＞

从细胞聚集体切出的移植用视网膜组织、优选移植用神经视网膜片确认到神经视网膜谱系细胞相关基因的表达、且未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达的情况下，判定为可用于移植、即适于移植(判定工序)。

确认到神经视网膜谱系细胞相关基因的表达意指在基因表达的检测方法中，观察到通过该检测方法实质上可检测到的水平(例如，检测下限值以上)的神经视网膜谱系细胞相关基因的表达。另外，未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达意指在基因表达的检测方法中通过该检测方法实质上无法检测到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达(例如低于检测下限值)。实质上的能检测性是指，以超出不能认为该基因实质上发挥功能的程度的水平检测到该基因。本领域技术人员可以根据该基因及该检测方法进行适当设定。例如，在具有定量性的基因表达的检测方法的情况下，可将以该基因表达的检测下限值为基准超过0％～10％以下、超过0％～5％以下的范围判断为并非实质上可检测到的水平(即，无法检测到该基因的表达)。

在一个方式中，定量PCR法中，优选在满足以下基准1及基准2的情况下，判定为可用作移植用神经视网膜。

基准1：神经视网膜谱系细胞相关基因的循环阈值(Ct值)与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为10以下

基准2：非神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为5以上

循环阈值(Ct值)意指在基于PCR的基因扩增以指数函数的方式发生的区域内达到固定的扩增产物量的循环数。Ct值与基因的初始量呈负相关，因此可用于基因的初始拷贝数的计算。在一个方式中，“2＾Ct值(2的Ct值次方)”与基因的初始量呈反比，因此可用于基因的初始拷贝数的计算。具体而言，含有2倍初始量的基因的样品较之在扩增前仅含有一半拷贝数的基因的样品而言，Ct值领先1个循环。固定的扩增产物量只要在基于PCR的基因扩增以指数函数的方式发生的区域内即可，本领域技术人员可进行设定。

内标基因意指试样间表达量的差异小的基因。作为内标基因，可适当使用本领域技术人员已知的基因，例如，可举出18S核糖体RNA、β肌动蛋白、HPRT、α微管蛋白、转铁蛋白受体、泛素、GAPDH等，优选GAPDH。

Ct值与基因的初始量呈负相关，因此依赖于细胞内的基因的表达量。即，含有核酸的溶液的浓度固定时，Ct值根据所使用的内标基因的不同而有所不同，特定基因的Ct值与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)受所使用的内标基因影响。除非另有记载，本说明书中的ΔCt值以使用GAPDH作为内标基因时的值作为基准而进行记载。

使用GAPDH以外的内标基因作为内标基因的情况下，通过比较GAPDH与该GAPDH以外的内标基因的表达量，可以对前述基准1及基准2的ΔCt值进行校正。

在一个方式中，使用β肌动蛋白作为内标基因的情况下，在本申请的制造方法中，GAPDH和β肌动蛋白中，GAPDH的Ct值比β肌动蛋白的Ct值低大约1左右，即GAPDH的RNA的绝对量为β肌动蛋白的RNA的绝对量的2倍左右，因此，可设为：

基准1：神经视网膜谱系细胞相关基因的循环阈值(Ct值)与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为9以下

基准2：非神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为4以上。

在一个方式中，使用HPRT作为内标基因的情况下，在本申请的制造方法中，GAPDH和HPRT中，GAPDH的Ct值比HPRT低大约7左右，即GAPDH的RNA的绝对量为HPRT的RNA的绝对量的2⁷(128倍)左右，因此可设为：

基准1：神经视网膜谱系细胞相关基因的循环阈值(Ct值)与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为3以下

基准2：非神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差(ΔCt值)为-2以上。

神经视网膜谱系细胞相关基因只要是上述基因即可。作为神经视网膜谱系细胞相关基因，存在多个基因。即，即使在从同一神经视网膜谱系细胞中进行提取的情况下，前述基准值1的Ct值也可根据神经视网膜谱系细胞相关基因的种类的不同而有所不同。本领域技术人员可以根据该神经视网膜谱系细胞相关基因的表达部位、表达量等已知信息，针对每个基因设定可判断神经视网膜谱系细胞相关基因表达的ΔCt值。

例如，对于Chx10基因，以GAPDH为内标的情况下，ΔCt值可以为20以下，优选为15以下，更优选为10以下。

例如，对于恢复蛋白基因，以GAPDH为内标的情况下，ΔCt值可以为16以下，优选为11以下，更优选为6以下。

一般而言，神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因(例如：GAPDH)的Ct值之差(ΔCt值)例如可以为25以下、20以下、15以下或10以下。神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差例如可以为-10以上、-5以上、0以上或5以上。

非神经视网膜谱系细胞相关基因只要是上述基因即可。作为非神经视网膜谱系细胞相关基因，存在多个基因。即，即使在从同一非视网膜谱系细胞中进行提取的情况下，Ct值也根据非神经视网膜谱系细胞相关基因的不同而有所不同。本领域技术人员可以根据该非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达部位、表达量等已知信息，针对每个基因设定可判断非神经视网膜谱系细胞相关基因表达的ΔCt值。例如，对于PAX2基因，以GAPDH为内标的情况下，ΔCt值可以为5以上。对于HOXB2基因，以GAPDH为内标的情况下，ΔCt值可以为5以上。一般而言，非神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差可以为30以下、25以下、20以下。另外，非神经视网膜谱系细胞相关基因的Ct值与内标基因的Ct值之差例如可以为0以上、3以上或5以上。

(移植用神经视网膜片)

本说明书中的移植用视网膜组织优选为移植用神经视网膜，更优选为包含神经视网膜层的移植用神经视网膜片。作为移植用神经视网膜片，可举出下述移植用神经视网膜片，其具有表面和背面，表面构成包含神经视网膜层的顶端面，背面构成包含基底膜成分的基底面，移植用神经视网膜片的自基底面起至顶端面的厚度为100μm～1000μm，移植用神经视网膜片的长径为600μm～2500μm，移植用神经视网膜片的短径为200μm～1500μm。

在本发明的一个方式中，移植用视网膜组织为移植用神经视网膜片，其特征在于，

(1)来源于多能干细胞，

(2)具有三维结构，

(4)视细胞层包含选自由视细胞前体细胞及视细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(5)内层包含选自由视网膜前体细胞、神经节细胞、无长突细胞及双极细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(6)神经视网膜层的表面具有顶端面，

(7)内层存在于沿顶端面存在的视细胞层的内侧，

(8)相对于移植用神经视网膜片的表面的总面积，神经视网膜层的顶端面的面积为50％以上，

(9)相对于神经视网膜层的顶端面的总面积，连续上皮结构的面积为80％以上，

(10)确认到移植用神经视网膜片中的神经视网膜谱系细胞相关基因的表达，且未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达，非神经视网膜谱系细胞相关基因包含选自由脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

就该移植用神经视网膜片而言，(3)包含神经视网膜层，前述神经视网膜层具有包含视细胞层及内层的多个层结构。如(6)及(7)所述，视细胞层存在于该移植用神经视网膜片的外侧(表面)，内层中也存在异位性视细胞层。

就该移植用神经视网膜片而言，(5)内层包含选自由视网膜前体细胞、神经节细胞、无长突细胞及双极细胞组成的组中的1个以上的细胞，也可包含选自由异位性的视细胞前体细胞及视细胞组成的组中的1个以上的细胞。在一个方式中，还提供：神经节细胞、无长突细胞、水平细胞的含有率为总细胞数的30％以下的移植用神经视网膜片，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞及双极细胞的含有率为总细胞数的30％以下的移植用神经视网膜片、及/或双极性细胞的含有率为总细胞数的10％以下的移植用神经视网膜片。

就该移植用神经视网膜片而言，(8)相对于移植用神经视网膜片的表面的总面积，神经视网膜层的面积为40％以上，优选为50％以上，更优选为60％以上。就该移植用神经视网膜片而言，(9)相对于神经视网膜层的顶端面的总面积，连续上皮结构的面积为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上。

神经视网膜谱系细胞相关基因及非神经视网膜谱系细胞相关基因(脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因)为上述基因。

(10)确认到移植用神经视网膜片中的神经视网膜谱系细胞相关基因的表达、且未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达可以通过取移植用神经视网膜片的一部分对基因的表达进行检测来判明。另外，如果是从通过上述移植用神经视网膜的品质评价方法而在品质评价用样品中实质上确认到神经视网膜谱系细胞相关基因的表达、且实质上未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达的细胞聚集体中分离的移植用神经视网膜片，则无需检测移植用神经视网膜片自身的基因表达。所谓实质上确认到该基因的表达或者未确认到表达如上所述，是在基因的表达的检测方法中，根据是否为可通过该检测方法实质上检测到的水平来确定的。

移植用神经视网膜片中的神经视网膜谱系细胞相关基因例如可以为选自由Rx、Chx10、Pax6及Crx组成的组中的1个以上。相对于总细胞数而言的表达神经视网膜谱系细胞相关基因的细胞(阳性细胞)的比例根据神经视网膜的分化阶段的不同而有所不同。

在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Rx阳性细胞的比例可以为30％以上、40％以上、50％以上、或60％以上。在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Chx10阳性细胞或Pax6阳性细胞的比例可以为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、或50％以上。在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Crx阳性细胞的比例可以为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、或50％以上。

在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Rx阳性细胞的比例可以为30％以上80％以下、40％以上70％以下、45％以上60％以下、或50％以上60％以下。在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Chx10阳性细胞或Pax6阳性细胞的比例可以为10％以上80％以下、20％以上70％以下、30％以上60％以下、或40％以上50％以下。在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Crx阳性细胞的比例可以为10％以上70％以下、10％以上60％以下、20％以上60％以下、30％以上60％以下、40％以上60％以下、或50％以上60％以下。

在一个方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言，(1)Chx10阳性且Pax6阳性细胞(神经视网膜前体细胞)的比例可以为10％以上50％以下或10％以上30％以下，(2)Chx10阳性且Pax6阴性细胞(偏向双极细胞的前体细胞)的比例可以为10％以上25％以下或15％以上25％以下，(3)Chx10阴性且Pax6阳性细胞(神经节细胞及无长突细胞)的比例可以为10％以上25％以下或10％以上20％以下。

在其他方式中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言，(1)Chx10阳性且Pax6阳性细胞(神经视网膜前体细胞)的比例可以为20％以上40％以下，(2)Chx10阳性且Pax6阴性细胞(偏向双极细胞的前体细胞)的比例可以为5％以上20％以下，(3)Chx10阴性且Pax6阳性细胞(神经节细胞及无长突细胞)的比例可以为5％以上20％以下或5％以上15％以下。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片是通过上述移植用神经视网膜的品质评价方法被判定为可作为移植用神经视网膜使用的移植用神经视网膜，并且是可以经分离而得的片状的移植用神经视网膜。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片是从包含神经视网膜的细胞聚集体分离而得的，可以是包含该细胞聚集体中的连续上皮组织的中心附近区域的移植用神经视网膜片。

在一个方式中，移植用视网膜组织为移植用神经视网膜片，前述移植用神经视网膜片为

(1)从包含神经视网膜层的细胞聚集体分离而得的，

(2)包含该细胞聚集体中的连续上皮组织的中心附近区域，且

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片从包含神经视网膜、视网膜色素上皮细胞及睫状边缘带结构体的细胞聚集体分离而得，可以是具有与神经视网膜上皮结构的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性、且包含距包含视网膜色素上皮细胞的部分最远的上皮结构上的区域的移植用神经视网膜片。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片从包含神经视网膜和脑脊髓组织的细胞聚集体分离而得，可以是具有与神经视网膜上皮结构的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性、且包含距包含脑脊髓组织的部分最远的上皮结构上的区域的移植用神经视网膜片。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片从包含2个以上的神经视网膜上皮的细胞聚集体分离而得，可以是包含其中适宜分离的形态良好及/或大小较大的神经视网膜上皮的中央部的移植用神经视网膜片。

在一个方式中，移植用视网膜组织为移植用神经视网膜片，前述植用神经视网膜片为

(1)从至少包含第一上皮组织及第二上皮组织的细胞聚集体分离而得的，第一上皮组织包含人神经视网膜，第二上皮组织具有与第一上皮组织的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性、且包含非神经视网膜谱系细胞，

(2)包含距第二上皮组织最远的第一上皮组织上的区域，且

第二上皮组织为选自由眼球相关组织、脑脊髓组织及其他的与第一上皮组织的神经视网膜不同的组织组成的组中的组织。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片的长径例如可以为300μm～3300μm，优选为600μm～2500μm，更优选为1100μm～1700μm。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片的短径例如可以为100μm～2000μm，优选为200μm～1500μm，更优选为400μm～1100μm。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片的高度例如可以为50μm～1500μm，优选为100μm～1000μm，更优选为200μm～700μm。

在一个方式中，本发明所涉及的移植用神经视网膜片的体积例如可以为0.001mm³～4.0mm³，优选为0.01mm³～1.5mm³，更优选为0.07mm³～0.57mm³。

测定移植用神经视网膜片的长径、短径及高度的方法没有特别限定，例如，根据显微镜下拍摄的图像进行测定即可。例如，对于从细胞聚集体切出的移植用神经视网膜片，可以用实体显微镜拍摄在将切割面朝向物镜侧的状态下拍摄的正面图像、和在切割面以从物镜观察呈垂直的方式倾斜的状态下拍摄的侧面图像，根据拍摄的图像进行测定。此处，长径意指正面图像中，连接该片截面上的2个端点的线段之中最长的线段及其长度。短径意指正面图像中，连接该片截面上的2个端点的线段且与长径正交的线段之中最长的线段及其长度。高度意指与该片截面正交的线段且以与该片截面的交点和视网膜片的顶点为端点的线段之中最长的线段及其长度。该片的体积意指在将移植片近似为以截面穿过长径的方式对半切割后的椭圆体的基础上按照以下的计算式算出的体积。

体积＝2/3×圆周率(π)×(长径/2)×(短径/2)×高度

可使用本发明的介质并施予的视网膜组织没有特别限定。

作为一个方式，作为视网膜组织，可举出Bryce T.McLelland等著，IOVS,May2018,Vol.59,No.6,p2586中记载的视网膜片。

作为一个方式，作为视网膜组织，也可以由用下述的文献中记载的制造方法制造的视网膜组织制作视网膜片。

Nakano,T.等，Cell Stem Cell 10,771-785(2012).

KawaharaA.等，Nature Communications,6,p.6286(2015).

KuwaharaA,Yamasaki S,等，Sci Rep.2019Dec 12；9(1):18936.

Lamba,D.A.,Gust,J.&Reh,T.A.Cell Stem Cell 4,73-79,(2009).

Zhu,J.,Cifuentes,H.,Reynolds,J.&Lamba,D.A.Cell Stem Cell20,374-384.e375(2017)

Meyer,J.S.等，Stem Cells 29,1206-1218,(2011).

Zhong,X.等，Nat Commun 5,doi:10.1038/ncomms5047(2014).

Boucherie,C.,等，Stem Cells 31,408-414,doi:10.1002/stem.1268(2013).

Gonzalez-Cordero,A.等，Nat Biotechnol 31,741-747,(2013).

Mellough,C.B.等，Stem Cells 33,2416-2430,(2015).

Hallam,D.等，Stem Cells,doi:10.1002/stem.2883(2018).

Reichman,S.等，PNAS 111,8518-8523,(2014).

Gagliardi,G.等，Stem Cell Reports 11,665-680,(2018).

Tucker,B.A.,等，Stem Cells Transl Med 2,16-24,(2013).

Wahlin,K.J.等，Sci Rep 7,766,(2017).

DiStefano,T.等，Stem Cell Reports 10,300-313,(2018).

(视网膜组织的制造)

在本说明书中，用于移植的视网膜组织可以是从生物体(例如，胎儿)切除而得的视网膜组织，也可以是由自体或异体多能干细胞(例如，由受精14天以内的胚胎建立的胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞))分化诱导而得的视网膜组织。视网膜组织可以为包含视细胞的神经视网膜。

由生物体准备视网膜组织的方法是本领域技术人员已知的。具体而言，可以在麻醉下切出视网膜组织。

作为由多能干细胞分化诱导而得的视网膜组织，可举出将由多能干细胞形成的细胞聚集体在适宜的分化诱导条件下进行悬浮培养而得到的视网膜组织。

此处用作原料的“多能干细胞”可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞、体细胞等诱导。作为多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)、EG细胞(Embryonic germ cell)、人工多能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stemcell)等。从间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(Multi-lineagedifferentiating stress enduring cell，多系分化持续应激细胞)、由生殖细胞(例如***)制得的GS细胞也包含于多能干细胞中。

人胚胎干细胞建立于1998年，也逐渐被用于再生医学。胚胎干细胞的制造方法被记载于例如WO96/22362、WO02/101057、US5，843，780、US6，200，806、US6，280，718等中。胚胎干细胞可以自规定的机构获得，还可购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1、KhES-2及KhES-3可以自京都大学再生医科学研究所获得。作为人胚胎干细胞的Crx：：Venus株(来源于KhES-1)可以自国立研究开发法人理化学研究所获得。

“人工多能干细胞”通过将体细胞利用已知的方法等进行重编程(reprogramming)而诱导出多能性的细胞。

人工多能干细胞是由山中等于2006年用小鼠细胞建立的(Cell，2006，126(4)，pp.663-676)。就人工多能干细胞而言，在2007年还在人成纤维细胞中得以建立，与胚胎干细胞同样具有多能性和自我复制能力(Cell，2007，131(5)，pp.861-872；Science，2007，318(5858)，pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)，pp.101-106)。

具体而言，人工多能干细胞可举出通过使成纤维细胞、外周血单核细胞等已分化的体细胞表达选自包括Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等的重编程基因簇中的多个基因的组合中的任一者来进行重编程、从而诱导出多分化能力的细胞。作为优选的重编程因子的组合，可举出(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells、2013；31：458-466)。

作为人工多能干细胞，除了用基于基因表达的直接重编程进行制造的方法以外，还可以通过化合物的添加等来由体细胞诱导人工多能干细胞(Science，2013，341，pp.651-654)。

另外，也可以获得已株系化的人工多能干细胞，例如，可以自京都大学和iPSAcademia Japan株式会社获得由京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人的人工多能性细胞株。作为已株系化的人工多能干细胞，例如，可以自京都大学获得由京都大学建立的Ff-I01细胞、Ff-I14细胞及QHJI01s04细胞。

在本说明书中，多能干细胞优选为胚胎干细胞或人工多能干细胞，更优选为人工多能干细胞。

在本说明书中，多能干细胞为人的多能干细胞，优选为人的人工多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。

人iPS细胞等多能干细胞可以用本领域技术人员已知的方法进行维持培养及扩大培养。

制造上述2所述的视网膜组织的方法没有特别限定，可以用本领域技术人员已知的方法进行制造。

上述2所述的视网膜组织优选为包含神经视网膜层的视网膜组织(神经视网膜)。用于移植的神经视网膜组织可以是将包含神经视网膜的细胞聚集体或其一部分切出而得的视网膜片。

本说明书中的包含神经视网膜的细胞聚集体具有上皮结构，可以对多能干细胞进行分化诱导而获得。

作为一个方式，可举出使用分化诱导因子的、包含神经视网膜的细胞聚集体的制造方法。作为分化诱导因子，可举出基底膜标准品、BMP信号转导通路作用物质、Wnt信号转导通路抑制物质、IGF信号转导通路作用物质等。作为一个方式，可举出基于自我组织化的包含神经视网膜的细胞聚集体的制造方法。自我组织化是指细胞群自主地创出复杂结构的机制。例如，可以通过SFEB(Serum-free Floatingculture of Embryoid Bodies-likeaggregates)法(WO2005/12390)、SFEBq法(WO2009/148170)来实施自我组织化。

作为由多能干细胞形成细胞聚集体的方法，例如，可举出SFEB(Serum-freeFloatingculture of Embryoid Bodies-like aggregates)法(WO2005/12390)、SFEBq法(WO2009/148170)。

作为实施由多能干细胞向视网膜组织分化诱导的方法，可举出WO2011/055855、WO2013/077425、WO2015/025967、WO2016/063985、WO2016/063986、WO2017/183732、“PLoSOne.2010Jan 20；5(1)：e8763.”、“Stem Cells.2011Aug；29(8)：1206-18.”、“Proc NatlAcad Sci USA.2014Jun 10；111(23)：8518-23”、“Nat Commun.2014Jun 10；5：4047”、WO2012/173207、WO2015/053375、WO2015/053376、WO2015/068505、WO2017/043605、WO2017/183732、WO2019/017492、WO2019/054514、WO2019/054515、“Stem Cell Reports，2(2)，205-218(2014)”、“Cell Stem Cell，10(6)，771-785(2012)”“Nature Comm unications|6：6286(2015)等文献中公开的方法，但没有特别限定。

另外，作为视网膜组织的制造方法，可举出Bryce T.McLelland等著，IOVS,May2018,Vol.59,No.6,p2586中记载的方法。

另外，作为视网膜组织的制造方法，可举出下述的文献中记载的方法。

Nakano,T.等，Cell Stem Cell 10,771-785(2012).

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DiStefano,T.等，Stem Cell Reports 10,300-313,(2018).

作为一个具体的方式，可以通过包括下述工序(A)、(B)、(C)及(D)的方法来制备包含神经视网膜的细胞聚集体。

工序(A)，将多能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，用多能干细胞培养用的培养基进行培养；

工序(B)，通过对工序(A)中得到的细胞进行悬浮培养来使其形成细胞聚集体；

工序(C)，将工序(B)中得到的细胞聚集体进一步在含有BMP信号转导通路作用物质的培养基中进行悬浮培养；及

工序(D)，对工序(C)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，使其成熟化。

需要说明的是，工序(A)可还包含TGFβ家族信号转导通路抑制物质及/或音猬因子(Sonic Hedgehog)信号转导通路作用物质。

另外，就工序(B)而言，如后文所述，可包含音猬因子信号转导通路作用物质、及/或Wnt信号转导通路抑制物质。

本方法也公开于例如WO2015/025967、WO2016/063985、WO2017/183732中，更详细而言，可参见WO2015/025967、WO2016/063985、WO2017/183732、WO2019/017492、WO2019/054514、WO2019/054515等。

工序(A)中使用的所谓“多能干细胞培养用培养基”，是能在无饲养层条件下培养多能干细胞的培养基，作为该培养基，可举出含有未分化维持因子的培养基。

在本说明书中，未分化维持因子只要是具有抑制多能干细胞的分化的作用的物质就没有特别限定。作为本领域技术人员普遍使用的未分化维持因子，可举出FGF信号转导通路作用物质、TGFβ家族信号转导通路作用物质、胰岛素等。作为FGF信号转导通路作用物质，具体而言，可举出成纤维细胞生长因子(例如，bFGF、FGF4、FGF8)。另外，作为TGFβ家族信号转导通路作用物质，可举出TGFβ信号转导通路作用物质、Nodal/活化素信号转导通路作用物质。作为TGFβ信号转导通路作用物质，可举出例如TGFβ1、TGFβ2。作为Nodal/活化素信号转导通路作用物质，可举出例如Nodal、活化素A、活化素B。对人多能干细胞(人ES细胞、人iPS细胞)进行培养的情况下，工序(A)中的培养基优选包含bFGF作为未分化维持因子。

工序(A)中使用的培养基中的未分化维持因子浓度是能维持所培养的多能干细胞的未分化状态的浓度，本领域技术人员可以适当设定。例如，具体而言，在不存在饲养细胞的条件下使用bFGF作为未分化维持因子的情况下，其浓度通常为4ng～500ng/mL左右，优选为10ng～200ng/mL左右，更优选为30ng～150ng/mL左右。

作为能在无饲养层条件下使用的多能干细胞培养用培养基，大量的合成培养基正在进行研发·销售，例如可举出Essential 8培养基(Life Technologies公司制)。就Essential 8培养基而言，在DMEM/F12培养基中作为添加剂含有L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)、***钠(14μg/L)、胰岛素(19.4mg/L)、NaHCO₃(543mg/L)、转铁蛋白(10.7mg/L)、bFGF(100ng/mL)、及、TGFβ家族信号转导通路作用物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods、8、424-429(2011))。作为其他的市售无饲养层培养基，可举出S-medium(DS Pharma Biomedical公司制)、StemPro(Life Technologies公司制)、hESF9(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2008Sep 9；105(36)：13409-14)、mTeSR1(STEMCELLTechnologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELLTechnologies公司制)、或StemFit(味之素公司制)。通过在上述工序(A)中使用上述培养基，可以简便地实施本发明。通过使用上述培养基，能进行无饲养层条件下的多能干细胞的培养。作为一个例子，工序(A)中使用的培养基为没有添加BMP信号转导通路作用物质、Wnt信号转导通路作用物质及Wnt信号转导通路抑制物质中的任一者的无血清培养基。

除非另有记载，包含神经视网膜的细胞聚集体的制备中使用的培养基、即上述工序(B)、(C)及(D)中使用的培养基可以使用细胞增殖用基础培养基(也称为基础培养基)。细胞增殖用基础培养基只要能培养细胞就没有特别限定，可以适当使用作为细胞增殖用培养基而市售的基础培养基。具体而言，例如，可举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、MEM培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、Leibovitz’s L-15培养基或它们的混合培养基等可用于动物细胞培养的培养基。另外，可使用添加有作为辅助培养基的N2培养基的培养基。

在本说明书中，所谓TGFβ家族信号转导通路抑制物质，表示抑制TGFβ家族信号转导通路、即经由Smad家族进行传递的信号转导通路的物质，具体而言，可举是出TGFβ信号转导通路抑制物质(例如：SB431542、LY-364947、SB505124、A-83-01等)、Nodal/活化素信号转导通路抑制物质(例如：SB431542、A-83-01等)及BMP信号转导通路抑制物质(例如：LDN193189、Dorsomorphin等)。上述物质均有市售，是可以获得的。

在本说明书中，所谓音猬因子(以下有时记作“Shh”)信号转导通路作用物质，是能增强经由Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导通路作用物质，例如，可举出SHH、SHH的部分肽(例如，音猬因子N端(Shh-N)、重组人音猬因子(C24II)N端(SHH-C24II)、重组小鼠音猬因子(C25II)N端(SHH-C25II))、Shh以外的Hedgehog家族蛋白(例如，Hh、IHH、DHH、EHH、TwHH)、PMA(Purmorphamine)、SAG(Smoothened Agonist)等。

上述工序(A)中，TGFβ家族信号转导通路抑制物质及音猬因子信号转导通路作用物质的浓度只要是能诱导向视网膜谱系细胞的分化的浓度即可。例如，SB431542通常以0.1～200μM、优选2～50μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05～50μM、优选0.5～5μM的浓度使用。LDN193189通常以1～2000nM、优选10～300nM的浓度使用。SAG通常以1～2000nM、优选10～700nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μM、优选0.02～2μM的浓度使用。

在工序(A)中的无饲养层条件下的多能干细胞的培养中，为了向多能干细胞提供替代饲养细胞的支架，可使用合适的基质作为支架。作为能够用作支架的基质，可举出层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28，611-615，(2010))、层粘连蛋白片段(Nat Commun 3，1236，(2012))、基底膜标准品(Nat Biotechnol 19，971-974，(2001))、明胶、胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白(Entactin)、玻连蛋白(Vitronectin)等。

就工序(A)中的多能干细胞的培养时间而言，在TGFβ家族信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质(例如：100nM～700nM)的存在下进行培养时，在可以达成使工序(B)中形成的细胞聚集体的品质提高的效果的范围内没有特别限定，通常为0.5～144小时。在一个方式中，优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，更优选为18～28小时(例如24小时)。

工序(B)中使用的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免混入化学上尚未确定的成分的观点出发，适宜使用无血清培养基。为了避免制备的繁杂性，例如，可举出适量添加有市售的KSR等血清替代物的无血清培养基。作为向无血清培养基中的KSR的添加量，通常为约1％至约30％，优选为约2％至约20％。

在形成聚集体时，首先，通过工序(A)中得到的细胞的分散操作，制备分散的细胞。通过分散操作得到的所谓“分散的细胞”，可举出例如7成(优选8成以上)以上为单一细胞，存在3成以下(优选2成以下)的2～50个细胞的团块的状态。所谓分散的细胞，可举出几乎不存在细胞之间的粘附(例如面粘附)的状态。

将分散的细胞的悬浮液接种至培养器中，通过将分散的细胞于培养器中在非贴壁的条件下进行培养，使多个细胞聚集而形成聚集体。作为一个方式，通过向96孔板这样的多孔板(U底、V底)的各孔中加入一定数量的分散的干细胞，对其进行静置培养，细胞迅速聚集，由此在各孔中形成1个聚集体(SFEBq法)。使用96孔板对细胞进行悬浮培养时，将以每1个孔成为约1×10³至约1×10⁵细胞(优选为约3×10³至约5×10⁴细胞、约4×10³至约2×10⁴细胞)的方式制备的液体添加至孔中，将板静置，使其形成聚集体。

在一个方式中，工序(B)中使用的培养基含有音猬因子信号转导通路作用物质。

即，作为一个具体的方式，可以通过包括下述工序(A)、(B)及(C)的方法来制备包含神经视网膜的细胞聚集体：

工序(A)，将多能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，且在含有未分化维持因子的培养基中进行培养，前述培养基可任意地含有TGFβ家族信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质；

工序(B)，将工序(A)中得到的细胞在含有音猬因子信号转导通路作用物质的培养基中进行悬浮培养来使其形成细胞聚集体；

工序(C)，将工序(B)中得到的细胞聚集体进一步在含有BMP信号转导通路作用物质的培养基中进行悬浮培养。

作为工序(B)中的音猬因子信号转导通路作用物质，可以以上述的浓度(例如：10nM～300nM)使用上述物质。音猬因子信号转导通路作用物质优选从开始悬浮培养时包含于培养基中。培养基中可添加ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。培养时间为例如12小时～6天。在一个例子中，工序(B)中使用的培养基为未添加选自由BMP信号转导通路作用物质、Wnt信号转导通路作用物质、TGFβ家族信号转导通路抑制物质及TGFβ家族信号转导通路作用物质组成的组中的一者以上(优选全部)的培养基。

作为一个方式，工序(B)中的细胞聚集体在表达多能性标志物的分化阶段。具体而言，是能检测到选自Oct3/4、Sox2、Klf4、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb及Esrrb中的一个或多个标志物的分化阶段。

在本说明书中，所谓BMP信号转导通路作用物质，是能增强经由BMP介导的信号转导通路的物质。作为BMP信号转导通路作用物质，可举出例如BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白、GDF7等GDF蛋白、抗BMP受体抗体、或BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白及BMP7蛋白例如可自R&D Systems公司获得，GDF7蛋白例如可自和光纯药获得。

就工序(C)中使用的培养基而言，例如，可举出添加有BMP信号转导通路作用物质的无血清培养基或血清培养基(优选为无血清培养基)。无血清培养基、血清培养基可如上所述地准备。在一个例子中，工序(C)中使用的培养基为未添加选自由Wnt信号转导通路作用物质、TGFβ家族信号转导通路抑制物质及TGFβ家族信号转导通路作用物质组成的组中的一者以上(优选为全部)的培养基。另外，在一个例子中，工序(C)中使用的培养基为未添加音猬因子信号转导通路作用物质的培养基。另外，工序(C)中使用的培养基为可添加Wnt信号转导通路作用物质的培养基。

BMP信号转导通路作用物质的浓度只要是能诱导向视网膜谱系细胞的分化的浓度即可。例如人BMP4蛋白的情况下，以成为约0.01nM～约1μM、优选约0.1nM～约100nM、更优选约1nM～约10nM、进一步优选约1.5nM(55ng/mL)的浓度的方式添加至培养基中。

BMP信号转导通路作用物质可在工序(A)的悬浮培养开始起约24小时之后进行添加，也可在悬浮培养开始后数天以内(例如，15天以内)添加至培养基。优选地，BMP信号转导通路作用物质在悬浮培养开始后第1天～第15天之间、更优选第1天～第9天之间、最优选第3天添加至培养基中。

作为具体的方式，例如，可以在工序(B)的悬浮培养开始后第1～9天、优选第1～3天，将培养基的一部分或全部更换为含BMP4的培养基，以使BMP4的最终浓度成为约1～10nM的方式制备培养基，在BMP4的存在下培养例如1～12天、优选2～9天、进一步优选2～5天。此处，为了将BMP4的浓度维持在同一浓度，可以经1次或2次左右将培养基的一部分或全部更换为含BMP4的培养基。或者可以阶段性地减少BMP4的浓度。例如，可以将BMP信号转导通路作用物质(BMP4)的浓度维持至工序(B)的悬浮培养开始后第2～10天，然后在工序(B)的悬浮培养开始后第6～20天阶段性地减少BMP信号转导通路作用物质(BMP4)的浓度。

上述工序(A)～工序(C)中的培养温度、CO₂浓度等培养条件可以适当设定。培养温度为例如约30℃～约40℃，优选为约37℃。另外CO₂浓度为例如约1％～约10％，优选为约5％。

通过改变上述工序(C)中的培养时间，可以制造各种分化阶段的视网膜谱系细胞作为包含于细胞聚集体中的视网膜谱系细胞。即，可以制造以各种比例包含未成熟的视网膜谱系细胞(例如：视网膜前体细胞、视细胞前体细胞)和成熟的视网膜谱系细胞(例如：视细胞)的、细胞聚集体中的视网膜谱系细胞。通过延长工序(C)的培养时间，可以增加成熟的视网膜谱系细胞的比例。

上述工序(B)及/或工序(C)可使用WO2017/183732中公开的方法。即，工序(B)及/或工序(C)中，可以在进一步含有Wnt信号转导通路抑制物质的培养基中进行悬浮培养，形成细胞聚集体。

作为工序(B)及/或工序(C)中使用的、Wnt信号转导通路抑制物质，只要是能抑制经由Wnt介导的信号转导的物质就没有特别限定，可以是蛋白质、核酸、低分子化合物等中的任一者。经由Wnt介导的信号是介由以Frizzled(Fz)及LRP5/6(low-densitylipoprotein receptor-related protein 5/6)的异源二聚体的方式存在的Wnt受体而转导的。作为Wnt信号转导通路抑制物质，例如，可举出直接作用于Wnt或Wnt受体的物质(抗Wnt中和抗体、抗Wnt受体中和抗体等)、抑制编码Wnt或Wnt受体的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制Wnt受体与Wnt的结合的物质(可溶型Wnt受体、显性负性Wnt受体等、Wnt拮抗剂、Dkk1、Cerberus蛋白等)、对起因于基于Wnt受体的信号转导的生理活性进行抑制的物质[CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺)、D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4，7-甲桥-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)、以及IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]乙酰胺)等低分子化合物等]等，但并不限于此。作为Wnt信号转导通路抑制物质，可含有上述物质中的一种或两种以上。CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等是已知的Wnt信号转导通路抑制物质，可适当获得市售品等。作为Wnt信号转导通路抑制物质，优选使用IWR1e。

工序(B)中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度只要是能形成良好的细胞聚集体的浓度即可。例如IWR-1-endo的情况下，以成为约0.1μM至约100μM、优选约0.3μM至约30μM、更优选约1μM至约10μM、进一步优选约3μM的浓度的方式添加至培养基中。使用IWR-1-endo以外的Wnt信号转导通路抑制物质的情况下，期望以显示与上述IWR-1-endo的浓度同等的Wnt信号转导通路抑制活性的浓度使用。

工序(B)中，向培养基中添加Wnt信号转导通路抑制物质的时机优选为较早。就Wnt信号转导通路抑制物质而言，可从工序(B)中的悬浮培养开始起通常6天以内、优选3天以内、更优选1天以内、更优选12小时以内、进一步优选于工序(B)中的悬浮培养开始时添加至培养基。具体而言，例如，可以实施添加有Wnt信号转导通路抑制物质的基础培养基的添加、该基础培养基的一部分或全部的培养基的更换。工序(B)中使Wnt信号转导通路抑制物质作用于工序(A)中得到的细胞的时间没有特别限定，优选是使其在工序(B)中的悬浮培养开始时添加于培养基之后、直至工序(B)结束时(即将添加BMP信号转导通路作用物质添加前)发挥作用。进一步优选的是，如后文所述，工序(B)结束后(即工序(C)期间)也继续暴露于Wnt信号转导通路抑制物质。作为一个方式，如后文所述，可以在工序(B)结束后(即工序(C)期间)也继续使Wnt信号转导通路抑制物质发挥作用，使其作用至视网膜组织形成为止。

工序(C)中，作为Wnt信号转导通路抑制物质，可以使用前述的Wnt信号转导通路抑制物质中的任一者，优选在工序(C)中使用与工序(B)中使用的Wnt信号转导通路抑制物质相同种类的物质。

工序(C)中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度只要是能诱导视网膜前体细胞及视网膜组织的浓度即可。例如IWR-1-endo的情况下，以成为约0.1μM至约100μM、优选约0.3μM至约30μM、更优选约1μM至约10μM、进一步优选约3μM的浓度的方式添加至培养基中。使用IWR-1-endo以外的Wnt信号转导通路抑制物质的情况下，期望以显示与上述IWR-1-endo的浓度同等的Wnt信号转导通路抑制活性的浓度使用。将工序(B)的培养基中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度设为100时，工序(C)的培养基中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度优选为50～150，更优选为80～120，进一步优选为90～110，与第二工序的培养基中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度同等的情况是更优选的。

就Wnt信号转导通路抑制物质在培养基中的添加时间而言，在能够实现包含视网膜谱系细胞或视网膜组织的聚集体形成的范围内没有特别限定，但越早越好。优选的是，在工序(C)开始时向培养基中添加Wnt信号转导通路抑制物质。更优选的是，在工序(B)中添加Wnt信号转导通路抑制物质之后，工序(C)中仍继续包含于(即，自工序(B)开始时起)培养基中。进一步优选的是，在工序(B)的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制物质之后，工序(C)中仍继续包含于培养基中。例如，只要将BMP信号转导通路作用物质(例、BMP4)添加于工序(B)中得到的培养物(含有Wnt信号转导通路抑制物质的培养基中的聚集体的悬浮液)中即可。

使Wnt信号转导通路抑制物质发挥作用的时间没有特别限定，优选的是，在工序(B)中的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制物质的情况下，以工序(B)中的悬浮培养开始时为起算点，为2天至30天，更优选为6天至20天、8天至18天、10天至18天、或10天至17天(例如，10天)。在其他方式中，就使Wnt信号转导通路抑制物质发挥作用的时间而言，在工序(B)中的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制物质的情况下，以工序(B)中的悬浮培养开始时为起算点，优选为3天至15天(例如，5天、6天、7天)，更优选为6天至10天(例如，6天)。

通过将用上述方法得到的细胞聚集体在含有Wnt信号转导通路作用物质、及/或FGF信号转导通路抑制物质的无血清培养基或血清培养基中培养2天至4天左右的时间(工序(D))，然后在不含Wnt信号转导通路作用物质及FGF信号转导通路抑制物质的无血清培养基或血清培养基中培养30天～200天左右(30天～150天、50天～120天、60天～90天)(工序(E))，也可以制造包含睫状边缘带样结构体的神经视网膜。

可以从下述细胞聚集体通过上述工序(D)及工序(E)来制造包含睫状边缘带样结构体的神经视网膜，所述细胞聚集体是从工序(A)～(C)中得到的、工序(B)的悬浮培养开始后第6～30天、第10～20天(第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天)的细胞聚集体

作为Wnt信号转导通路作用物质，只要是能增强经由Wnt介导的信号转导的物质就没有特别限定。作为具体的Wnt信号转导通路作用物质，例如，可举出GSK3β抑制剂(例如，6-Bromoindirubin-3’-oxime(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)。例如CHIR99021的情况下，可举出约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM的范围。

作为FGF信号转导通路抑制物质，只要是能抑制经由FGF介导的信号转导的物质就没有特别限定。作为FGF信号转导通路抑制物质，例如，可举出SU-5402、AZD4547、BGJ398等。例如SU-5402的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM、更优选约5μM的浓度添加。

在一个例子中，工序(D)中使用的培养基为未添加选自由BMP信号转导通路作用物质、Wnt信号转导通路抑制物质、SHH信号转导通路作用物质、TGFβ家族信号转导通路抑制物质及TGFβ家族信号转导通路作用物质组成的组中的一者以上(优选全部)的培养基。

上述工序(E)的一部分或全部工序可使用WO2019/017492中公开的连续上皮组织维持用培养基进行培养。即，通过使用连续上皮组织维持用培养基进行培养，能够维持神经视网膜的连续上皮结构。作为一个例子，可举出Neurobasal培养基(例如：Thermo FisherScientific公司制、21103049)中配合有B27补充剂(例如：Thermo Fisher Scientific、12587010)的培养基作为连续上皮组织维持用培养基。

对于上述工序(E)中的培养而言，为了兼顾视网膜谱系细胞(尤其是视细胞)的分化及/或成熟化、和连续上皮结构的维持，阶段性地更换为连续上皮组织维持用培养基是优选的。例如，可以在最初的10天～30天使用细胞增殖用基础培养基(例如：在DMEM/F12培养基中添加有10％胎牛血清、1％N2补充剂、及100μM牛磺酸的培养基)、之后的10天～40天使用细胞增殖用基础培养基和连续上皮组织维持用培养基的混合培养基(在DMEM/F12培养基中添加有10％胎牛血清、1％N2补充剂、及100μM牛磺酸的培养基、与在Neurobasal培养基中添加有10％胎牛血清、2％B27补充剂、2mM谷氨酰胺、及100μM牛磺酸的培养基按1：3的比率混合而得的培养基)，之后的20天～140天使用连续上皮组织维持用培养基(例如：在Neurobasal培养基中添加有10％胎牛血清、2％B27补充剂、2mM谷氨酰胺、及100μM牛磺酸的培养基)进行培养。

上述工序(E)的一部分或全部工序中，在使用细胞增殖用基础培养基、连续上皮组织维持用培养基或它们的混合培养基中的任何培养基的情况下，均可进一步含有甲状腺激素信号转导通路作用物质。通过在含有甲状腺激素信号转导通路作用物质的培养基中进行培养，能够制造包含神经视网膜中所含的双极细胞、无长突细胞、神经节细胞或水平细胞等的比例低、且视细胞前体细胞的比例增大的包含神经视网膜的细胞聚集体。

在本说明书中，所谓甲状腺激素信号转导通路作用物质，是能增强经由甲状腺激素介导的信号转导的物质，只要是能增强甲状腺激素信号转导通路的物质就没有特别限定。作为甲状腺激素信号转导通路作用物质，例如，三碘甲状腺原氨酸(以下有时简称T3)、甲状腺素(以下有时简称T4)、甲状腺激素受体(优选为TRβ受体)激动剂等。

另外，作为本领域技术人员已知的甲状腺激素受体激动剂，可举出国际公开第97/21993号册、国际公开第2004/066929号册、国际公开第2004/093799号、国际公开第2000/039077号册、国际公开第2001/098256号册、国际公开第2003/018515号册、国际公开第2003/084915号册、国际公开第2002/094319号册、国际公开第2003/064369号册、日本特开2002-053564号公报、日本特开2002-370978号公报、日本特开2000-256190号公报、国际公开第2007/132475号册、国际公开第2007/009913号册、国际公开第2003/094845号册、国际公开第2002/051805号册或国际公开第2010/122980号册中记载的二苯甲烷衍生物、二芳基醚衍生物、哒嗪衍生物、吡啶衍生物或吲哚衍生物等化合物。

使用T3作为甲状腺激素信号转导通路作用物质的情况下，例如，可以以成为0.1～1000nM的范围的方式添加至培养基中。可举出具有与优选1～500nM；更优选10～100nM；进一步优选30～90nM；进一步更优选60nM左右的浓度的T3相当的甲状腺激素信号转导亢进活性的浓度。使用T4作为甲状腺激素信号转导通路作用物质的情况下，例如，可以以成为1nM～500μM的范围的方式添加至培养基中。优选为50nM～50μM；更优选为500nM～5μM的范围。使用其他的甲状腺激素受体激动剂的情况下，只要是显示出与上述的浓度的T3或T4所显示的激动剂活性同等程度的活性的浓度即可。

工序(E)中使用的培养基可适当含有L-谷氨酰胺、牛磺酸、血清等。在一个例子中，工序(E)中使用的培养基为未添加选自由BMP信号转导通路作用物质、FGF信号转导通路抑制物质、Wnt信号转导通路作用物质、Wnt信号转导通路抑制物质、SHH信号转导通路作用物质、TGFβ家族信号转导通路抑制物质及TGFβ家族信号转导通路作用物质组成的组中的一者以上(优选全部)的培养基。

作为一个具体的方式，可以通过包含下述工序(A)～(E)的方法来制备包含神经视网膜的细胞聚集体：

工序(A)，将多能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在含有未分化维持因子、且可任意地含有TGFβ家族信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质的培养基中进行培养；

工序(B)，将工序(A)中得到的细胞在可含有Wnt信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质的培养基中进行悬浮培养来使其形成细胞聚集体；

工序(C)，将工序(B)中得到的细胞聚集体进一步在含有BMP信号转导通路作用物质的培养基中进行悬浮培养；

工序(D)，将工序(C)中得到的细胞聚集体在含有Wnt信号转导通路作用物质、及/或FGF信号转导通路抑制物质的无血清培养基或血清培养基中培养2天至4天左右的时间；及，

工序(E)，将工序(D)中得到的细胞聚集体在不含Wnt信号转导通路作用物质及FGF信号转导通路抑制物质、而可含有甲状腺激素信号转导通路作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养30天～200天左右。

工序(A)，将多能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在含有未分化维持因子、且含有TGFβ家族信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质的培养基中培养12小时～48小时；

工序(B)，将工序(A)中得到的细胞在含有Wnt信号转导通路抑制物质及/或音猬因子信号转导通路作用物质的培养基中悬浮培养12小时～72天(24小时～48小时)来使其形成细胞聚集体；

工序(C)，将工序(B)中得到的细胞聚集体进一步在含有BMP信号转导通路作用物质的培养基中悬浮培养8天～15天(10天～13天)；

工序(D)，将工序(C)中得到的细胞聚集体在含有Wnt信号转导通路作用物质、及/或FGF信号转导通路抑制物质的无血清培养基或血清培养基中培养2天至4天；及，

工序(E)，将工序(D)中得到的细胞聚集体在不含Wnt信号转导通路作用物质及FGF信号转导通路抑制物质、而可含有甲状腺激素信号转导通路作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养10天～200天左右。

此处，工序(E)，也可以包括下述工序：在细胞增殖用基础培养基中培养10天～30天，接着在细胞增殖用基础培养基与包含甲状腺激素信号转导通路作用物质的连续上皮组织维持用培养基的混合培养基中培养10天～40天，进一步在包含甲状腺激素信号转导通路作用物质的连续上皮组织维持用培养基中培养20天～140天。

在一个方式中，工序(E)包括在甲状腺激素信号转导通路作用物质的存在下培养20天～60天(30天～50天)。

在一个方式中，工序(B)～工序(E)的培养时间为70天～100天(80天～90天)。

通过上述方法，可以制造包含神经视网膜的细胞聚集体，但不限于此。作为一个方式，包含神经视网膜的细胞聚集体也可以以细胞聚集体的混合物的形式而获得。作为其他方式，例如可以在96孔板的每1个孔中制造1个细胞聚集体，也可以逐个获得包含神经视网膜的细胞聚集体。

3.移植用组合物

本发明的移植用组合物包含上述1所述的移植用介质及上述2所述的移植用视网膜组织。移植用视网膜组织优选为2所述的移植用神经视网膜片。

本发明的移植用组合物包含：供1次移植于受体的移植用视网膜组织、即移植片；和为了在不损伤移植片的情况下顺畅地进行将该移植片吸取于移植用设备中并吐出至受体的视网膜下的操作所需的量的移植用介质。

具体而言，本发明的移植用组合物例如包含1个～30个的移植片及5～500μl的移植用组合物。优选包含1个～2个的移植片及5～50μl的移植用组合物。在其他方式中，包含3个～4个的移植片及5～100μl的移植用组合物。在其他方式中，包含5个～6个的移植片及10～150μl的移植用组合物。在其他方式中，包含7个～10个的移植片及20～200μl的移植用组合物。在其他方式中，包含11个～30个的移植片及30～300μl的移植用组合物。移植片优选为移植用神经视网膜片。

具体而言，本发明的移植用组合物例如包含1个～30个的移植片及5～500μl的移植用组合物。此处作为1个前述移植片中所含的细胞数，可举出10,000～1,000,000个细胞，优选5,000～300,000个细胞。

优选的是，包含1个～2个的移植片(细胞数为10,000～2,000,000个细胞，优选为5,000～600,000个细胞)及5～50μl的移植用组合物。在其他方式中，包含3个～4个的移植片(细胞数为30,000～4,000,000个细胞，优选为15,000～1,200,000个细胞)及5～100μl的移植用组合物。在其他方式中，包含5个～6个的移植片(细胞数为50,000～6,000,000个细胞，优选为25,000～1,800,000个细胞)及10～150μl的移植用组合物。在其他方式中，包含7个～10个的移植片(细胞数为70,000～10,000,000个细胞，优选为35,000～3,000,000个细胞)及20～200μl的移植用组合物。在其他方式中，包含11个～30个的移植片(细胞数为110,000～30,000,000个细胞，优选为55,000～9,000,000个细胞)及30～300μl的移植用组合物。

作为本发明的一个方式，提供包含本发明的移植用组合物的药物组合物，前述本发明的移植用组合物包含移植用视网膜组织和移植用介质。

药物组合物能用于治疗基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍或者神经视网膜的损伤的疾病。作为基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍的疾病，例如，可举出视网膜变性疾病、黄斑变性、老年性黄斑变性、视网膜色素变性、青光眼、角膜疾病、视网膜脱落、中心性浆液性脉络膜视网膜症、锥体营养不良、锥体杆体营养不良等眼科疾病。作为神经视网膜的损伤状态，例如，可举出视细胞变性死亡的状态等。

作为本发明的一个方式，提供包含本发明的移植用组合物的、基于神经视网膜的障碍的疾病的治疗药。

本发明的移植用组合物可以经过从包含移植片及保存用介质的组合物中除去保存用介质、替换为移植用介质的工序而制备。此处前述保存用介质没有特别限制，作为一个例子，可举出WO2019/017491中记载的保存液。

4.移植方法·治疗方法

可以将本发明的移植用组合物注入至具有例如黄斑变性(例如，萎缩型及渗出性老年性黄斑变性、眼底黄色斑点症)、遗传性视网膜疾病、视网膜色素变性(也称为视网膜色素变性症)、锥体营养不良、杆体营养不良、锥体杆体营养不良、黄斑裂孔、巨大黄斑裂孔、青光眼等视网膜疾病的哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠等，优选为人)的视网膜下从而进行移植。作为移植方法，例如，可举出通过切开眼球等将移植用组合物移植至损伤部位的视网膜下的方法。作为进行移植的方法，例如可举出使用适当大小的注射器、或包含针或树脂制枪头的移植用设备进行注入的方法、用镊子夹着进行移植的方法。

将本发明的移植用组合物用于视网膜色素变性的治疗的情况下，例如，可以用于矫正视力低于0.7、优选视力低于0.2的治疗。

将本发明的移植用组合物用于视网膜色素变性的治疗的情况下，例如，可举出具有视野狭窄的疾病，例如静态视野检查(可用Humphrey视野检查进行检查)中中心部20度的视野残存的疾病，优选静态视野检查(可用Humphrey视野检查进行检查)中中心部10度的视野残存的疾病，更优选静态视野检查(可用Humphrey视野检查进行检查)中中心部5度的视野残存的疾病。可以将本发明的移植用组合物移植至丧失视觉功能的视网膜的区域而进行治疗。

将本发明的移植用组合物用于视网膜色素变性的治疗的情况下，例如，可以用于Humphrey视野检查(10-2)中MD值低于-30dB的治疗。

作为本发明的一个方式，可举出对基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍或者神经视网膜的损伤的疾病进行治疗的方法，前述方法包括将本发明的移植用组合物移植至需要移植的对象(例如，发生眼科疾病的眼的视网膜下)。可以使用本发明的移植用组合物作为基于神经视网膜的障碍的疾病的治疗药，或者用于在神经视网膜的损伤状态下对符合的损伤部位进行补充。通过向需要移植的、具有基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍的疾病的患者、或神经视网膜的损伤状态的患者移植本发明的移植用组合物，对该神经视网膜谱系细胞或有障碍的神经视网膜进行补充，从而能够对基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍的疾病、或神经视网膜的损伤状态进行治疗。

实施例

以下示出实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：移植用介质的候选物的粘度的研究

为了建立将具有长径为1mm以上的大小的视网膜组织片移植至人的视网膜下的手段，对其移植用介质进行了研究。

首先进行了将视网膜片移植于猴的视网膜下的手术的预备研究。作为移植用介质，使用了不含透明质酸及硫酸软骨素的平衡盐类溶液(balanced salt solution，BSS)。

使用白内障·玻璃体手术装置，进行通常实施的玻璃体蒂显微镜下切开术，根据需要引起玻璃体后脱离。使用白内障·玻璃体手术装置的液体注入功能将平衡盐类溶液注入至视网膜下，制作局灶性的视网膜脱落(泡)。用玻璃体剪刀将脱落的部位的视网膜部分切开，形成移植用创口。

连接塑料枪头(移植用枪头)和吐出装置，吸取包含视网膜片的平衡盐类溶液。经由巩膜上制作的切创口***移植用枪头，使移植用枪头到达至视网膜上制作的移植用创口，使用白内障·玻璃体手术装置的液体注入功能，将包含视网膜片的平衡盐类溶液***视网膜下(参见图1)。

其结果，视网膜片在泡内四处运动，难以稳定地实施视网膜下施予。

于是，使用以下的表11中示出的透明质酸水溶液，对移植用介质的组成进行了研究。

[表11]

即，作为移植用介质的候选物，使用以下的介质：

(1)Viscoat原液、

(2)Viscoat 2倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：1)、

(3)Viscoat 4倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：3)、

(4)Hyalein Mini、

(5)Provisc、

(6)HEALON、

(7)OPEGAN、

(8)OPEGAN 1.5倍稀释(OPEGAN：OPEGUARD＝2：1)、

(9)OPEGAN 2倍稀释(OPEGAN：OPEGUARD＝1：1)。

需要说明的是，OPEGUARD如上所述，是在1mL中含有葡萄糖1.5mg、氯化钙水合物0.18mg、硫酸镁水合物0.3mg、碳酸氢钠2.1mg、以及作为添加物的柠檬酸钠水合物、乙酸钠水合物及盐酸的水溶液(即含有糖的平衡盐类溶液)。

另外，作为比较，使用(10)平衡盐类溶液(BSS)。针对上述(1)～(10)的介质，使用粘度测定装置在“30℃、剪切速度1/s＝2”的条件下测定粘度。将结果示于表12。

[表12]

/>

N.A.：实质上不含有

另外，针对上述(1)～(9)的介质，使用粘度测定装置，在30℃的条件下测定剪切速度(剪切速率)与粘度的相关关系。将结果示于图2及表13。

[表13]

*剪切速率为1～10时的粘度的变化量(mPa·s)的绝对值

将上述(1)～(10)的介质的各自加至视网膜片，用塑料枪头(移植用枪头，Bethel公司制；图8所例示的视网膜片能够通过枪头之中、且枪头的长度为1cm以上10cm以下的移植用枪头)进行吸入排出，观察视网膜片的行为。其结果，首先，(1)、(5)、(6)、(7)的粘弹性过高，试图使视网膜片在介质中移动时马上被撕裂成碎片，可知反复的滑动是不可能的。(2)Viscoat 2倍稀释(2900mPa·s)下，尽管视网膜片是可滑动的，但是视网膜片在液体中不易滑动，可知容易被撕裂而损坏。(3)Viscoat 4倍稀释、(8)OPEGAN 1.5倍稀释、(9)OPEGAN 2倍稀释、及(4)Hyalein Mini(37mPa·s)下，视网膜片良好地滑动。另一方面，使用粘度更低的(10)平衡盐类溶液的情况下，发现猛烈地吐出，可知粘度低时不易进行移植。

另外，使用上述的枪头塑料枪头以外的市售的移植用枪头也得到同样的结果。

即，作为视网膜片的移植用介质，调节了粘度的介质是重要的，可知剪切速率为2(1/s)时的粘度为2mPa·s以上1040mPa·s以下的情况下可带来良好的结果。

另外，如图2所示，确认到使X轴所示的“剪切速度”(剪切速率)变化的情况下，Y轴所示的“粘性(粘度)”发生变化，它们的相关关系在各个施予介质中是不同的。因此，实施移植用介质的优化时，可考虑通过对剪切速度”与“粘度”的关系进行评价来对更良好的移植用介质进行表征。

根据图2及表13的结果可知，剪切速率小的情况下、例如为10(1/s)以下的情况下粘度的变化率小是优选的。另外，可知剪切速率为1～10(1/s)时的粘度的变化量(即，剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差)为500mPa·s以下(表12的(8)中为314mPa·s)。

另外，可知剪切速率为1000(1/s)时的粘度为100mPa·s以下(表12的(8)中为68mPa·s)。

进一步地，为了找出最优粘度，进行了追加研究。将使用以下的表14中示出的透明质酸水溶液在“25℃、剪切速度为1/s＝2”的条件测得的粘度示于表14。进一步地，将测定了25℃时的剪切速度与粘度的相关关系的结果分别示于图3及表14。

[表14]

BCT：Viscoat；OGD：OPEGUARD；N.A.：不符合(即未稀释)；

BSS+：在缓冲液(BSS)中添加有氧化型谷胱甘肽的缓冲液(ALCON公司制)

*剪切速率为1～10时的粘度的变化量(mPa·s)的绝对值

将上述介质的各自加至视网膜片，用塑料枪头(移植用枪头，Bethel公司制)吸入排出，观察视网膜片的行为即是否顺畅地滑动。其结果，OPEGUARD及BSS+以外的介质中，所有视网膜片良好地滑动。即，作为移植用介质的25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度，可知5～500mPa·s是适宜的。

基于图3的结果，研究移植用介质的25℃时的剪切速度与粘度的相关关系。

其结果，可知作为介质的物性，在下述范围内显示良好的结果：

剪切速度(1/s)为2时粘度(mPa·s)为6.9～434.0的范围剪切速度(1/s)为10时粘度(mPa·s)为6.9～410.0的范围剪切速度(1/s)为100时粘度(mPa·s)为6.8～236.0的范围剪切速度(1/s)为1000时粘度(mPa·s)为5.9～78.8的范围剪切速度(1/s)为10000时粘度(mPa·s)为4.3～20.6的范围。

该结果与图2的结果是一致的。即，可知剪切速率小的情况下、例如10(1/s)以下的情况下粘度的变化率小是优选的，例如剪切速率为1～10(1/s)时的粘度的变化率(即，剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差，除以剪切速率为1(1/s)时的粘度时的百分率)为约10％以下，作为变化量，粘度为30mPa·s以下(表14的BCT：OGD＝1：3中为26mPa·s)。

另外，可知剪切速率为1000(1/s)时的粘度为100mPa·s以下。实施例2：大鼠视网膜下施予中的移植用组合物的粘度的研究

进行了大鼠视网膜下施予中的移植用组合物的粘度的研究。就大鼠的移植方法而言，用Shirai等，Proc Natl Acad Sci U S A 2016,113:E81-90.记载的方法进行。

基于实施例1的结果，在下述两个条件下进行移植

·Viscoat 2倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：1)

·Viscoat 4倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：3)

。其结果，可知Viscoat 4倍稀释下，可以稳定地进行视网膜下移植。实际上，该条件下移植至20只裸大鼠，有18只移植成功。另一方面，可知Viscoat 2倍稀释下，移植本身是可实施的，但粘度高，移植稍难。

另外，在6个月后对Viscoat 4倍稀释下进行了移植的大鼠的眼球进行病例分析，结果，未观察到安全上特别成为问题的部位，可知视网膜片良好地植活。证实了Viscoat 4倍稀释不会抑制视网膜片的植活。

即证实了即使将Viscoat 4倍稀释中所含的粘弹性物质(透明质酸等)在该浓度·体积下施予至视网膜下，在安全性及视网膜片的植活上也无需担心。换言之，考察了若为Viscoat 4倍稀释以下的浓度·量，则无需担心安全性及植活性。

根据以上的结果可知，Viscoat 4倍稀释的介质的安全性·功能性优异，且移植的手艺上也适宜。

实施例3：猴视网膜下施予中的移植用组合物的粘度的研究

使用食蟹猴，进行猴视网膜下施予中的移植用组合物的粘度的研究。移植用实施例1记载的方法进行。另外，移植时，由熟练的外科医生、即具有10年以上眼科手术经验的临床外科医生对手艺上的易用性进行评价。

就施予介质而言，基于实施例1的结果，使用以下的介质。

·Viscoat 2倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：1)粘度(30℃、剪切速度1/s＝2)：2900mPa·s

·Viscoat 4倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：3)粘度(25℃、剪切速度1/s＝2)：434mPa·s

·Viscoat 6倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：5)粘度(25℃、剪切速度1/s＝2)：56mPa·s·Viscoat 7倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：6)粘度(25℃、剪切速度1/s＝2)：32.3mPa·s

·Hyalein Mini粘度(30℃、剪切速度1/s＝2)：37mPa·s

与实施例2同样地，Viscoat 2倍稀释的粘度高，为在实施例1记载的移植方法中不易使用的评价结果。即，吸取视网膜片并在适宜的位置吐出这样的操作中，移植的滑动性并不良好，为滑动性稍微更好的情况下更易于移植的评价。另外，关于Viscoat 4倍稀释，为尽管比Viscoat 2倍稀释良好，但为同样地滑动性也需要改善的评价。

另一方面，使用Hyalein Mini、Viscoat 6倍稀释及Viscoat 7倍稀释实施猴移植，可知在评价者的手艺方面也能够毫无问题地进行移植。尤其是，Viscoat 6倍稀释下移植至2只猴，确认到可以良好地移植。

具体而言，可知可以将视网膜片缓慢地施予至猴视网膜下，在泡内的运动变得平缓，容易移植。

实施例4：使用离体猪眼的视网膜下施予中的移植用组合物的粘度的研究

使用离体猪眼进行视网膜下施予中的移植用组合物的研究。手术用实施例1记载的方法进行。作为移植用组合物，使用Viscoat 7倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：6、粘度(30℃、剪切速度1/s＝2)：32.3mPa·s)。

首先，根据实施例1可知，例如使用Viscoat的稀释介质的情况下，稀释率4倍～14倍左右、优选稀释率5倍～11倍是适宜的。即，可知7mPa·s～434mPa·s、优选11～200mPa·s的粘度(25℃、剪切速度1/s＝2)可带来良好的结果，使用Viscoat 7倍稀释，可以毫无问题地移植至猪眼的视网膜下。

至此反复进行了各种研究，可知作为粘弹性物质，Viscoat是优选的。认为这不仅关于粘度，也与Viscoat的物性(粘性、线的牵拉情况)有关系。作为对其物性进行物理化学分析的手段，考察了剪切速度与粘度的相关关系对视网膜片在泡中的行为带来的影响。即，如实施例2中所考察的，25℃时的剪切速度(1/S)为2的情况下的粘度为5～500mPa·s是适宜的。另外，剪切速度为1～10时的粘度的变化为500以下，优选为30以下，进一步优选为2以下，剪切速度为1000时的粘度为100以下，进一步优选为30以下。

本发明中，对称为视网膜片的全新剂型的细胞·组织的移植用介质进行了研究。将并未是视网膜片这样的二维而是三维的立体组织稳定地移植于人的视网膜下的手艺尚未建立。根据本发明，适于视网膜片的移植用介质的物性已解明。

＜参考例1包含神经视网膜的视网膜片的制造＞

根据Scientific Reports、4、3594(2014)中记载的方法对人iPS细胞(DSP-SQ株，由大日本住友制药株式会社建立)进行无饲养层培养。作为无饲养层培养基，使用StemFit培养基(AK03N、味之素公司制)，对于无饲养层支架，使用Laminin511-E8(Nippi公司制)。

作为分化诱导操作，将人iPS细胞(DSP-SQ株)使用StemFit培养基进行无饲养层培养直至亚汇合2天前(培养面积的3成被细胞覆盖的程度)。将该亚汇合2天前的人iPS细胞在SAG(300nM)存在下进行2天无饲养层培养(预处理)。

将预处理后的人iPS细胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司制)进行细胞分散液处理，进一步进行吹吸操作分散成单一细胞。然后，使上述分散成单一细胞的人iPS细胞以成为非细胞贴附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板，住友BAKELITE公司制)的每1孔为1.3×10⁴个细胞的方式悬浮于100μl的无血清培养基中，于37℃、5％CO2进行悬浮培养。对于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用在F-12培养基与IMDM培养基的1：1混合液中添加有10％KSR、450μM 1-硫代甘油、1×化学上确定的脂质浓缩液(Chemicallydefined lipid concentrate)的无血清培养基。悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天)，在无血清培养基中添加Y-27632(最终浓度20μM)及SAG(最终浓度10nM)。悬浮培养开始后第2天，用不含Y-27632及SAG、而含有人重组BMP4(R&D公司制)的培养基，以外源性人重组BMP4的最终浓度成为1.5nM(55ng/ml)的方式，添加新的上述无血清培养基50μl。

在4天后(悬浮培养开始6天后)，用不含Y-27632、SAG及人重组BMP4的上述无血清培养基进行培养基更换。作为培养基更换的操作，实施将培养器中的培养基弃去60μl，加入新的上述无血清培养基90μl的操作，使培养基量成为共计180μl。然后，每2～4天一次，用不含Y-27632、SAG及人重组BMP4的上述无血清培养基进行半量培养基更换。作为半量培养基更换操作，将培养器中的培养基弃去体积的一半量即90μl，加入新的上述无血清培养基90μl，使培养基量成为共计180μl。

将以此方式得到的悬浮培养开始后第13天的细胞团块在含有CHIR99021(3μM)及SU5402(5μM)的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加有1％N₂补充剂的培养基)中培养3天，即培养至悬浮培养开始后第16天为止。

对于所得到的悬浮培养开始后第16天的细胞聚集体，针对下述培养液使用下述[1]、[2]及[3]中示出的血清培养基，在5％CO₂条件下培养至悬浮培养开始后第75天为止。

[1]悬浮培养开始后第16天至第40天：在DMEM/F12培养基中添加有10％胎牛血清、1％N₂补充剂、及100μM牛磺酸的培养基(以下称为A培养基)。

[2]悬浮培养开始后第40天至第60天：A培养基、与在Neurobasal培养基中添加有10％胎牛血清、2％B27补充剂、2mM谷氨酰胺、60nM的T3及100μM牛磺酸的培养基(以下称为B培养基)按1：3的比率混合而得的培养基。

[3]悬浮培养开始后第60天以后：B培养基。

用倒置显微镜对悬浮培养开始后第75天的细胞团块进行观察，确认形态。可以此时已形成神经上皮结构。

将悬浮培养开始后第75天的细胞团块用4％多聚甲醛固定，制成冷冻切片。将其他冷冻切片针对作为神经视网膜标志物之一的Chx10(抗Chx10抗体，Exalpha公司，绵羊)、及作为视细胞前体细胞的标志物之一的Crx(抗Crx抗体，Takara公司，兔)对冷冻切片进行免疫染色(图4)。就作为神经视网膜标志物之一的Rx(抗Rx抗体，Takara公司，豚鼠)、及作为视细胞的标志物之一的恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体，Proteintech公司，兔)进行免疫染色(图5)。用DAPI对细胞核进行染色。

使用荧光显微镜(Keyence公司制)观察上述经染色的切片，获得免疫染色图像。将制得的细胞在荧光显微镜下观察而得的照片示于图4及图5。图4及图5的上段是低倍镜头下拍摄的图像，下段是高倍镜头下拍摄的图像。

根据图4及图5的DAPI的染色图像可知，在细胞团块的表面形成了细胞密集地铺满的神经组织，该神经组织形成连续上皮结构。对图4的图像进行分析，结果可知该神经组织中，在细胞团块的表面形成了厚度为2～5个细胞左右的Crx阳性层(视细胞层)，在Crx阳性层的内侧形成了厚度为5～20个细胞左右的Chx10阳性层，进而在其内侧形成了Crx阳性细胞稀疏地存在的层(图4)。可知该细胞团块的表面形态上为顶端面(apical surface)。此外，对图5的图像进行分析，结果可知该神经组织中形成了恢复蛋白阳性层(视细胞层)，也形成了Rx阳性层。根据上述结果可知，该神经组织在表面形成了包含Crx阳性细胞及恢复蛋白阳性细胞的视细胞层，在视细胞层的内侧形成了包含Chx10阳性细胞的视网膜前体细胞层，在视网膜前体细胞的内侧也形成了细胞层。即，可知通过该制备方法，可以由人iPS细胞制作包含视细胞层及视网膜前体细胞层的神经视网膜，该神经视网膜具有连续上皮结构。

＜参考例2移植片的制作及评价＞

由人iPS细胞制作的立体视网膜包含具有细胞的组成·分布存在连续性的神经上皮结构的神经视网膜。该具有神经上皮结构的神经视网膜具有由视细胞层和内层构成的层结构，具有特征性的外观·形态(图4)。

人立体视网膜的大小为1～2mm左右，各个形状不同。另外，根据使用自我组织化培养的制造方法的特性，虽然移植中使用的神经视网膜成为主生成物，但副生成了作为非神经视网膜的眼球相关组织(RPE、睫状体等)、脑脊髓组织(端脑、脊髓等)，因此将不含非神经视网膜的神经视网膜的中心部切出，由此获得视网膜片(移植片、Cap、帽)(图6及图7)。即，使用视网膜片(Cap)的周边部作为品质评价用样品(Ring、环)，进行分析(优选定量PCR)，由此仅使用与适合基准的Ring对应的Cap作为移植用神经视网膜。

需要说明的是，图6及图7为典型的细胞聚集体的概念图。将确认到可见视细胞层和内层分为2层的神经视网膜特有的神经上皮结构(优选连续上皮结构)的部位作为移植片(帽)，将帽的周边部位中可见与帽同样的神经上皮结构(优选连续上皮结构)的部位作为品质评价用样品(环)，将帽、环以外的部位称为根(root)。

由1个细胞聚集体中所含的神经上皮结构分离帽和环的手段如下所述。

＜参考例3移植片(帽)的形状＞

用以下方法制作移植片(帽)(图8)。首先，按照参考例1中记载的方法，用倒置显微镜(Olympus公司制)拍摄由人iPS细胞(DSP-SQ株)制作的悬浮培养开始后第99天的细胞聚集体的明视野图像(相位差图像)。确认到细胞聚集体上有神经视网膜之后，将细胞聚集体移至实体显微镜下，用以下方法将各种大小的神经视网膜切出作为移植片。另外，就移植片的大小对基于移植用设备的移植操作造成的影响进行了研究。

(神经视网膜的视网膜片的切出)

针对细胞聚集体，用倒置显微镜(Nikon公司制，ECLIPSE Ti)观察明视野图像(相位差图像)。尤其着眼于各个细胞的形态及细胞彼此的粘附状态的特征进行观察。并且，将细胞聚集体中具有连续的上皮结构、并可见外成神经细胞层(包括视细胞层及神经视网膜前体细胞层)和内成神经细胞层分为2层的部位判定为神经视网膜。另外，未确认到连续的上皮结构的组织、虽然观察到连续的上皮结构但外成神经细胞层和内成神经细胞层无法区分而显示为1层的部位设为副产物。然后，一边用实体显微镜进行观察，一边使用尖细镊子和剪刀在实体显微镜下从细胞聚集体切出神经视网膜，制作组织片。

(切出的视网膜片对移植操作的影响)

针对切出的移植片，用实体显微镜拍摄在将切割面朝向物镜侧的状态下拍摄的正面图像、和在切割面以从物镜观察呈垂直的方式倾斜的状态下拍摄的侧面图像。然后，根据拍摄的图像，测定移植片的长径、短径、及高度。进行测定时，长径是指正面图像中，连接视网膜片截面上的2个端点的线段之中最长的线段及其长度。短径是指在正面图像中，连接视网膜片截面上的2个端点的线段且与长径正交的线段之中最长的线段及其长度。高度是指在侧面图像中与视网膜片截面正交的线段且以与视网膜片截面的交点和视网膜片的表面为端点的线段之中最长的线段及其长度。此外，对于移植片的体积，将移植片近似为以截面穿过长径的方式对半切割后的椭圆体，按照以下的计算式算出。

体积＝2/3×圆周率π×(长径/2)×(短径/2)×高度

由其结果可知，移植片在移植用设备中的设置、移植片在移植用设备中的稳定性及移植片从移植用设备中的吐出受到移植片的大小的影响。另外，暗示了短径是特别有用的参数。针对基于移植用设备的移植操作良好的11个的移植片，分别计算长径、短径、高度及体积。将针对各个参数求出的平均值、最大值及最小值的结果归纳于表15中。根据其结果可知，移植片(帽)至少长径为0.8～1.7mm，短径为0.4～1.1mm，高度为0.2～0.7mm，表观体积为0.07～0.57mm³左右。

[表15]

＜参考例4移植片(帽)的细胞的组成＞

用以下方法制作移植片(帽)(编号：18001MF、d89、H5)。首先，从按照参考例1中记载的方法由人iPS细胞(DSP-SQ株)制作的悬浮培养开始后第89天的细胞聚集体中，用参考例2及3中记载的方法分离移植片(帽)。

用4％多聚甲醛固定移植片，制成冷冻切片。将冷冻切片针对作为神经视网膜标志物之一的Chx10(抗Chx10抗体，Exalpha公司，绵羊)、及、作为视细胞前体细胞的标志物之一的Crx(抗Crx抗体，Takara公司，兔)进行免疫染色(图9)。关于其他冷冻切片，对作为神经视网膜标志物之一的Rx(抗Rx抗体，Takara公司，豚鼠)、及作为视细胞的标志物之一的恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体，Proteintech公司，兔)进行免疫染色(图9)。用DAPI对细胞核进行染色。使用共聚焦激光显微镜(Olympus公司制)观察上述经染色的切片，获得免疫染色图像。

根据染色图像可知，在移植片(帽)的表面形成了(图中左侧)细胞密集地铺满的神经组织，该神经组织形成神经上皮结构(尤其是连续上皮结构)(图9)。进一步可知该神经组织中，在细胞团块的表面形成了厚度为2～10个细胞左右的Crx阳性层(视细胞层，图9)，在Crx阳性层的内侧形成了厚度为5～20个细胞左右的Chx10阳性层，进一步在其内侧形成了存在Crx阳性细胞的层(图9)。可知该移植片(帽)的表面形态上为顶端面(apicalsurface)。进一步可知，该神经组织中形成了恢复蛋白阳性层(视细胞层，图9箭头)，已形成了Rx阳性层。根据上述结果可知，该神经组织在表面形成了包含Crx阳性细胞及恢复蛋白阳性细胞的视细胞层，在视细胞层的内侧形成了包含Chx10阳性细胞的视网膜前体细胞层，在视网膜前体细胞的内侧也形成了细胞层。即，可知移植片(帽)可以制作包含视细胞层及视网膜前体细胞层的神经视网膜，该神经视网膜具有连续上皮结构。

＜参考例5帽与环的同等性的验证＞

用以下方法比较帽和环的基因表达。首先，按照参考例1中记载的方法，由人iPS细胞(DSP-SQ株)制作悬浮培养开始后第99天的细胞聚集体，作为批次1。进一步去，按照参考例1中记载的方法，由人iPS细胞(DSP-SQ株)制作悬浮培养开始后第82天的细胞聚集体，作为批次2。针对这2个批次，用参考例3中记载的方法，使用显微镜判定作为主产物的神经视网膜和副产物，分别分离神经视网膜的帽和副产物的帽。就环而言，与移植片同样地使用尖细镊子和剪刀在实体显微镜下切出并分离。使用核酸纯化柱(QIAGEN公司制，RNeasy Microkit)按试剂盒中附带的使用说明书中记载的方法，从神经视网膜及副产物中分离而得的帽和环中提取总RNA。

用测定器(Nanodrop，Thermo scientific公司制)测定总RNA的浓度之后，使用逆转录酶及引物(Reverse Transcription Master Mix Kit、Fluidigm公司制)逆转录为cDNA。使用用于验证的所有探针，使用PCR装置(Veriti 96孔热循环仪、AppliedBiosystems公司制)对cDNA实施多重PCR反应(Pre-Run)。然后，使用IFC控制器HX(Fluidigm公司制)将完成Pre-Run的反应液注入附带流路的多孔(96.96Dynamic Array IFC、Fluidigm公司制)，使用多检体实时PCR***(Biomark HD、Fluidigm公司制)，通过实时PCR测定神经视网膜及神经视网膜以外的副产物的标志物基因的表达量。将验证中使用的PCR用探针示于表16。

[表16]

将结果以热图示于图10A及图10B。基因表达量基于由目标基因的Ct值与用作内标的基因GAPDH的Ct值之差算出的ΔCt值进行评价。ΔCt值越低，基因表达量越高，ΔCt值越高，基因表达量越低。灰色表示基因表达量高，黑色表示基因表达量低(颜色较浅表示基因表达较高)。调查了各帽和环的基因表达，结果批次1及批次2中，神经视网膜标志物基因簇均在从神经视网膜中分离而得的帽和环中表达。另一方面，调查了从副产物中分离而得的帽和环中的基因表达，结果任一批次中，均与神经视网膜相反，神经视网膜标志物基因簇的表达量低，副产物的标志物基因簇的表达量高。进一步地，比较从相同细胞聚集体中分离而得的帽和环中的基因表达，结果从任一方的神经视网膜及副产物中分离而得的帽和环中，神经视网膜标志物基因的表达量与副产物的标志物基因的表达量均是同等的。

根据上述结果可以证实，若环是神经视网膜，则帽也是神经视网膜。另外，证实了帽和环中基因表达是同等的。

＜参考例6移植片的移植结果＞

用参考例5中记载的方法对环的基因表达进行分析之后，使用对应的帽(神经视网膜片)作为实施例1中记载的视网膜片。将视网膜片浸于作为移植用介质的“Viscoat 4倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：3)”，制备移植用组合物。将其移植至视网膜变性裸大鼠，对移植后的植活图像进行评价。

首先，按照参考例1中记载的方法由人iPS细胞(DSP-SQ株)制作细胞聚集体。然后，用参考例3记载的方法从悬浮培养开始后第75天以后的细胞聚集体中分离帽和环。分离而得的帽在实施环的基因分析期间使用市售的保存液进行保存。对于分离而得的环，通过参考例5记载的方法以使用Biomark HD(Fluidigm公司制)的实时PCR法实施基因表达分析。根据基因表达分析的结果，选择表达神经视网膜标志物基因、不表达副产物的标志物基因的环，选择与该环对应的帽作为移植片(供于移植的视网膜片)。移植片用缓冲液(ThermoFisher Scientific公司制)清洗后浸于实施例1中记载的介质，制备移植用组合物。将其使用已知文献(Shirai等，PNAS 113，E81-E90)记载的注入器移植至视网膜变性裸大鼠(视细胞变性模型，SD-Foxn1 Tg(S334ter)3LavRrrc nude rat)的视网膜下。

对相当于悬浮培养开始后230～240天的眼组织实施多聚甲醛固定(PFA固定)，并进行蔗糖置换。使用低温恒温器将经固定的眼组织制成冷冻切片。将上述冷冻切片针对人核(抗HuNu抗体、Millipore公司，小鼠，或抗HNA抗体)、作为视细胞的标志物之一的恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体，Proteintech公司，兔)、作为双极细胞的标志物之一的PKCα(抗PKCα抗体，R&D systems公司，山羊)进行免疫染色。

将基于环的基因表达分析的移植片的品质评价结果和移植结果汇总的结果示于表17。ΔCt值的算出方法使用参考例5中记载的方法。就环的基因表达分析而言，作为神经视网膜标志物基因之一的恢复蛋白的ΔCt值为10以下，作为副产物的标志物基因的FOXG1、HOXB2、ZIC1及OCT3/4的ΔCt值分别为5以上的情况下，设为品质评价试验(ring-PCR试验)合格。针对移植结果，视网膜下能够检测到人核阳性且恢复蛋白阳性的视细胞时，评价为植活良好。另外，移植部位没有显著大于合适的植活尺寸且变厚，则判定为未检测到肥大。

将代表性的植活图像示于图11。针对移植前的品质评价试验合格的14只眼评价移植后的植活图像，结果在14只眼中，全部检测到恢复蛋白阳性的视细胞，可知其良好地植活。上述细胞为HuNu阳性，因此可知恢复蛋白阳性的视细胞来源于所移植的帽。另外，14只眼中，全部未检测到肥大。

根据以上的结果，用环的基因表达分析在移植前调查神经视网膜和副产物的标志物基因的表达量，可以筛选出良好地植活于视网膜下、即视细胞植活且未发生肥大的移植片。

另外，可以证实作为移植用介质的“Viscoat 4倍稀释(Viscoat：OPEGUARD＝1：3)”的视网膜下施予中的安全性。即，Viscoat 4倍稀释时含有透明质酸及硫酸软骨素，可以证实使用了0.75w/v％透明质酸及1.00w/v％硫酸软骨素的介质中的视网膜下施予中的安全性。

[表17]

＜参考例7帽和环中的标志物的表达＞。

参考例5中，用PCR法证实了帽和环的细胞的组成是同等的。于是接着用免疫染色法调查了帽和环的细胞的组成与组织结构是否同等。

首先，用参考例1记载的制备方法使人iPS细胞(DSP-SQ株)分化为视网膜。然后，用参考例5记载的方法从悬浮培养开始后第120天的细胞聚集体中分离神经视网膜的帽和环。然后，将帽和环清洗之后，进行4％多聚甲醛固定(PFA固定)并进行蔗糖置换。使用低温恒温器将经固定的帽和环制成冷冻切片。关于上述冷冻切片，实施将核进行染色的DAPI，针对作为视细胞前体细胞的标志物之一的Crx(抗Crx抗体，Takara公司，兔)、作为神经视网膜标志物之一的Chx10(抗Chx10抗体，Exalpha公司，绵羊)、作为视杆细胞前体细胞标志物之一的NRL(抗NRL抗体、Bio-Techne公司，山羊)、作为端脑标志物之一的FOXG1(抗FOXG1抗体，TAKARA BIO公司，兔)、作为视柄标志物之一的PAX2(抗PAX2抗体、Thermo FisherScientific社、兔)、以及作为未分化的多能干细胞标志物之一的NANOG(抗NANOG抗体、MERCK公司，小鼠)进行免疫染色。

将免疫染色后的结果示于图12。针对从相同细胞聚集体中切出的帽和环，将环的免疫染色结果示于上段，将帽的免疫染色结果示于下段。根据上述结果可知，Crx阳性的视细胞前体细胞、Chx10阳性的神经视网膜、及NRL阳性的杆体视细胞前体细胞均在帽和环中连续而呈层状地表达。另外，在帽和环中均未检测到FOXG1阳性的端脑、PAX2阳性的视柄、及NANOG阳性的多能干细胞。进一步地，将Crx、Chx10及NRL的染色图像进行比较时，确认到上述神经视网膜标志物在帽和环中显示出几乎同等的分布。

＜参考例8构成移植用神经视网膜片的视细胞前体细胞及神经视网膜前体细胞的比例＞

用作为免疫染色法之一的免疫组织染色(Immunohistochemistry；IHC)对由分化自多能干细胞的细胞聚集体制作的神经视网膜片的构成细胞之中、视细胞前体细胞及神经视网膜前体细胞的比例进行分析·定量。

用参考例1记载的制备方法使人iPS细胞(DSP-SQ株)分化为视网膜。然后，用参考例3中记载的方法从悬浮培养开始后第84天、第92天、第93天的细胞聚集体中分离帽和环。用参考例6记载的方法实施分离而得的环的基因表达分析。用参考例6记载的方法，选择表达神经视网膜标志物基因、不表达副产物的标志物基因的环，将与该环对应的帽作为移植用神经视网膜片。如此，由悬浮培养开始后第84天的细胞聚集体制作1个移植用神经视网膜片，由悬浮培养开始后第92天的细胞聚集体制作2个移植用神经视网膜片，由悬浮培养开始后第93天的细胞聚集体制作1个移植用神经视网膜片。即制作共计4片移植用神经视网膜片。

为了进行分析，将所得到的移植用神经视网膜片用B培养基进行7天培养。将培养后的移植用神经视网膜片用4％多聚甲醛固定，制成冷冻切片。关于冷冻切片，针对作为神经视网膜前体细胞标志物之一的Chx10(抗Chx10抗体，Exalpha公司，绵羊)、及作为视细胞前体细胞的标志物之一的Crx(抗Crx抗体，Takara公司，兔)进行免疫染色。将其他冷冻切片针对作为神经视网膜标志物之一的Rx(抗Rx抗体，Takara公司，豚鼠)、及作为视细胞的标志物之一的恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体，Proteintech公司，兔)进行免疫染色。用DAPI对细胞核进行染色。使用荧光显微镜(Keyence公司制)观察上述经染色的切片，获得免疫染色图像。将其一个例子(D3)示于图13。

用ImageJ(version 1.52a，NIH制)对免疫染色图像进行分析，分别针对4片移植用神经视网膜片分析DAPI阳性细胞数、DAPI阳性且Chx10阳性细胞数、及DAPI阳性且Crx阳性细胞数。同样地对免疫染色图像进行分析，分析DAPI阳性细胞数、及DAPI阳性且Rx阳性细胞数。根据上述数值，计算Chx10阳性细胞的比例、Crx阳性细胞的比例、及Rx阳性细胞的比例。将所得到的结果记载于表18。

[表18]

根据以上的结果可知，从细胞聚集体切出的移植用神经视网膜片中所含的Chx10阳性细胞的比例为23～45％左右，Crx阳性细胞的比例为30～56％左右，Rx阳性细胞的比例为40～54％左右。

即，暗示了移植用神经视网膜片中包含约34％左右(23～45％左右)的Chx10阳性的神经视网膜前体细胞、约40％(30～56％)的Crx阳性的视细胞前体细胞、约47％(40～54％)的Rx阳性细胞。

＜参考例9构成移植用神经视网膜片的视细胞前体细胞及神经视网膜前体细胞的比例＞

通过作为免疫染色法之一的流式细胞术法(也称为FACS)调查由分化自各种多能干细胞的细胞聚集体制作的移植用神经视网膜片的构成细胞的组成。

用参考例1记载的制备方法使人iPS细胞(QHJI01s04株)分化为视网膜。然后，用参考例3中记载的方法从悬浮培养开始后第88天的细胞聚集体中分离帽和环。并且，将帽作为移植用神经视网膜片。将移植用神经视网膜片于17℃低温保存2天。将5片所得到的移植用神经视网膜片合并为1个样品，用PBS进行洗涤，使用神经细胞分散液(WAKO公司制，含有木瓜蛋白酶)于37℃进行30分钟左右酶处理，通过吹吸分散为单一细胞，得到单一细胞悬浮液。使用固定液(BD公司制、CytoFix)对所得到的单一细胞悬浮液进行固定，得到FACS用样品。使用包含血清的Perm/Wash液(BD公司制)对FACS用样品进行封闭及透过处理(细胞膜的开孔)。然后，用经荧光标记的以下的抗体进行免疫染色：抗Chx10抗体(Santa Cruz公司制)及抗Pax6抗体(BD公司制)、抗Crx抗体(Santa Cruz公司制)。然后。使用分析仪(BD公司制)，通过流式细胞术进行分析。

其结果可知，Chx10阳性且Pax6阳性级分(神经视网膜前体细胞级分)为11.5％，Chx10阳性且Pax6阴性级分(偏向双极细胞的前体细胞级分)为23.4％，Chx10阴性且Pax6阳性级分(神经节细胞及无长突细胞级分)为10.7％，Crx阳性细胞级分(视细胞前体细胞级分)为17.4％。

进一步地，用参考例1记载的制备方法使人iPS细胞(DSP-SQ株)分化为视网膜。然后，制作11个悬浮培养开始后第88天的细胞聚集体，用参考例3中记载的方法从各个细胞聚集体中分离各11个帽和环。将11个帽合并为1个帽样品。同样地，将11个环合并为1个环样品。将帽样品和环样品分别用PBS进行洗涤，使用神经细胞分散液(WAKO公司制，含有木瓜蛋白酶)于37℃进行30分钟左右酶处理，得到帽和环各自的单一细胞悬浮液。使用固定液(BD公司制、CytoFix)对所得到的帽和环各自的单一细胞悬浮液进行固定，得到FACS用样品。使用包含血清的Perm/Wash液(BD公司制)对FACS用样品进行封闭和开孔，用经荧光标记的以下抗体进行免疫染色：抗Chx10抗体(Santa Cruz公司制)、抗Crx抗体(Santa Cruz公司制)、抗SSEA-4抗体。作为免疫染色的阴性对照，使用同型对照(Isotype control)。然后使用分析仪(BD公司制)，通过流式细胞术进行分析。Chx10阳性细胞的比例、Crx阳性细胞、SSEA-4阳性细胞的比例通过各自与Isotype control的差量而算出。将其结果记载于表19。

[表19]

帽样品中，神经视网膜前体细胞标志物Chx10阳性细胞的比例为29.4％，视细胞前体细胞标志物Crx阳性细胞的比例为15.8％，多能干细胞标志物(目标外细胞)SSEA-4阳性细胞的比例低于1％。环样品中，神经视网膜前体细胞标志物Chx10阳性细胞的比例为28.1％，视细胞前体细胞标志物Crx阳性细胞的比例为21.7％，多能干细胞标志物(目标外细胞)SSEA-4阳性细胞的比例低于1％。

根据上述结果可知，首先，该帽样品及环样品为包含Chx10阳性细胞和Crx阳性细胞的神经视网膜，实质上不含未分化iPS细胞。并且证实了帽样品中所含的Chx10阳性细胞和Crx阳性细胞的比例与环样品中所含的Chx10阳性细胞和Crx阳性细胞的比例是同等的。并且证实了若环样品为神经视网膜，则帽也为神经视网膜。

进而可知使用上述帽、环(优选帽)作为移植用神经视网膜片的情况下，该移植用神经视网膜片中所含的Chx10阳性级分(神经视网膜前体细胞级分)为约30％左右(20～40％左右)，Crx阳性细胞级分(视细胞前体细胞级分)为约17％左右(10～30％左右)。

产业上的可利用性

本发明的介质、以及包含视网膜组织及该介质的移植用组合物在用于治疗视网膜色素变性症(RP:retinitis pigmentosa)等视网膜变性疾病的视网膜组织向视网膜下的移植中是极有用的。

Claims

1.用于将视网膜组织向视网膜下移植的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为5～500mPa·s，所述移植用介质包含透明质酸及制药学上可接受的水性液体。

2.如权利要求1所述的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为2(1/s)时的粘度为10～100mPa·s。

3.如权利要求1或2所述的移植用介质，其中，25℃条件下剪切速率为1000(1/s)时的粘度为100mPa·s以下，且剪切速率为1(1/s)时的粘度与剪切速率为10(1/s)时的粘度之粘度差为100mPa·s以下。

4.如权利要求1～3中任一项所述的移植用介质，其pH为7.0～7.5。

5.如权利要求1～4中任一项所述的移植用介质，其中，制药学上可接受的水性液体为平衡盐类溶液。

6.如权利要求1～5中任一项所述的移植用介质，其包含0.15w/v％～1.50w/v％的平均分子量50万～390万的透明质酸。

7.如权利要求1～6中任一项所述的移植用介质，其还包含硫酸软骨素。

8.如权利要求7所述的移植用介质，其包含0.3w/v％～1.0w/v％的硫酸软骨素。

9.如权利要求1～8中任一项所述的移植用介质，其不含抗菌剂及防腐剂。

10.移植用组合物，其包含移植用视网膜组织及权利要求1～9中任一项所述的移植用介质。

11.如权利要求10所述的移植用组合物，其中，所述移植用视网膜组织为包含神经视网膜层的移植用神经视网膜片。

12.如权利要求11所述的移植用组合物，其中，所述移植用神经视网膜片具有表面和背面，所述表面构成包含神经视网膜层的顶端面，所述背面构成包含基底膜成分的基底面，所述移植用神经视网膜片的自基底面起至顶端面的厚度为100μm～1000μm，所述移植用神经视网膜片的长径为600μm～2500μm，所述移植用神经视网膜片的短径为200μm～1500μm。

13.如权利要求12所述的移植用组合物，其中，所述表面呈曲率变化小的平滑的形状，所述背面具有曲率变化大的不规则形状。

14.如权利要求11～13中任一项所述的移植用组合物，其包含1个～30个的所述移植用神经视网膜片及5～500μl的所述移植用介质。

15.如权利要求11～14中任一项所述的移植用组合物，其中，所述移植用神经视网膜片为特征如下的神经视网膜片

(1)来源于多能干细胞，

(2)具有三维结构，

(4)所述视细胞层包含选自由视细胞前体细胞及视细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(5)所述内层包含选自由视网膜前体细胞、神经节细胞、无长突细胞及双极细胞组成的组中的1个以上的细胞，

(6)所述神经视网膜层的表面具有顶端面，

(7)所述内层存在于沿所述顶端面存在的视细胞层的内侧，

(8)相对于所述神经视网膜片的表面的总面积，所述神经视网膜层的顶端面的面积为50％以上，

(9)相对于所述神经视网膜层的顶端面的总面积，连续上皮结构的面积为80％以上，

(10)确认到所述移植用神经视网膜片中的神经视网膜谱系细胞相关基因的表达，且未确认到非神经视网膜谱系细胞相关基因的表达，所述非神经视网膜谱系细胞相关基因包含选自由脑脊髓组织标志物基因及眼球相关组织标志物基因组成的组中的1个以上的基因。

16.如权利要求11～15中任一项所述的移植用组合物，其中，所述移植用神经视网膜片为

(1)从包含神经视网膜层的细胞聚集体分离而得的，

(2)包含该细胞聚集体中的连续上皮组织的中心附近区域，且

17.如权利要求11～16中任一项所述的移植用组合物，所述移植用神经视网膜片为

所述第一上皮组织包含人神经视网膜，所述第二上皮组织具有与所述第一上皮组织的表面中的切线斜率的连续性不同的表面的切线斜率的连续性、且包含非神经视网膜谱系细胞，

(2)包含距所述第二上皮组织最远的所述第一上皮组织上的区域，且

所述第二上皮组织为选自由眼球相关组织、脑脊髓组织及其他的与所述第一上皮组织的神经视网膜不同的组织组成的组中的组织。

18.如权利要求11～17中任一项所述的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Rx阳性细胞的比例为30％以上80％以下、40％以上70％以下、45％以上60％以下、或50％以上60％以下。

19.如权利要求11～18中任一项所述的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Chx10阳性细胞的比例为10％以上80％以下、20％以上70％以下、30％以上60％以下、或40％以上50％以下。

20.如权利要求11～19中任一项所述的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Pax6阳性细胞的比例为10％以上80％以下、20％以上70％以下、30％以上60％以下、或40％以上50％以下。

21.如权利要求11～20中任一项所述的移植用组合物，其中，相对于移植用神经视网膜片中的总细胞数而言的Crx阳性细胞的比例为10％以上70％以下、10％以上60％以下、20％以上60％以下、30％以上60％以下、40％以上60％以下、或50％以上60％以下。

22.基于神经视网膜谱系细胞或神经视网膜的障碍或者神经视网膜的损伤的疾病的治疗方法，所述方法包括：将权利要求11～21中任一项所述的移植用组合物移植至需要移植的对象的视网膜下。