CN110573610A - 视网膜色素上皮细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备视网膜色素上皮细胞的方法,包括以下步骤:(1)第一步,在含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞不超过30天的期间,和(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。使用该方法,以更高效和便捷的方式从多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞是可能的。
Description
技术领域
本发明涉及视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备方法等。
背景技术
视网膜色素上皮细胞是存在于视网膜最外层的色素上皮细胞,且在诸如感光细胞的外节的吞噬、视觉物质的再循环等感光细胞的维持中起重要作用。由年龄增长等引起的视网膜色素上皮细胞的异常所引起的年龄相关性黄斑变性是一种引起中央视觉丧失或失明的眼科疾病,并且期望开发一种治疗该疾病的有效方法。最近,作为年龄相关性黄斑变性的新型治疗方法,补充或替代视网膜色素上皮细胞的细胞移植疗法引起了大量关注,并且期待将视网膜色素上皮细胞用作用于细胞治疗的移植材料。迄今为止,虽然已经有一些关于使用人多能干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的方法的报道(非专利文献1和2,专利文献1、2、3和4),但是由于在再生医学产业中需要稳定地大量制备高品质视网膜色素上皮细胞的技术,因此期望更高效和便捷的制备方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO 2012/173207
专利文献2:国际公开WO 2015/053375
专利文献3:国际公开WO 2015/053376
专利文献4:美国公开US 2013/0224156
非专利文献
非专利文献1:Stem Cell Reports,2(2),205-218(2014)
非专利文献2:Cell Stem Cell,10(6),771-785(2012)
发明内容
本发明所要解决的技术问题
为了在再生医疗等中使用多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞时稳定地制备大量的该细胞,迫切需要开发一种更高效和便捷的制备方法。
解决问题的手段
鉴于上述情况,本发明的发明人进行了深入的研究,结果完成了本发明。
即,本发明涉及以下内容。
[1]一种视网膜色素上皮细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)第一步,在包含选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞不超过30天的期间,和
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
[2]根据上述[1]所述的方法,其中所述第一步在无血清条件下进行。
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法,其中所述第一步在不存在饲养细胞的情况下进行。
[4]根据上述[1]-[3]中任一项所述的制备方法,其中所述第一步中的培养基还包含用于维持未分化状态的因子。
[5]根据上述[4]所述的制备方法,其中所述用于维持未分化状态的因子是FGF信号转导途径激动剂。
[6]根据上述[5]所述的方法,其中所述FGF信号转导途径激动剂是bFGF。
[7]根据上述[1]-[6]中任一项所述的方法,其中所述FGF受体抑制剂是选自由PD173074和SU5402组成的组中的至少一种。
[8]根据上述[1]-[7]中任一项所述的方法,其中所述MEK抑制剂是选自由PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733和AZD-8330组成的组中的至少一种。
[9]根据上述[1]-[8]中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有外源Nodal信号转导途径抑制剂或外源Wnt信号转导途径抑制剂。
[10]根据上述[1]-[8]中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有除了Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂以外的影响多能干细胞分化诱导的外源性物质。
[11]根据上述[1]-[8]中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有除了Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂以外的影响多能干细胞分化诱导成外胚层细胞的外源性物质。
[12]根据上述[1]-[11]中任一项所述的方法,其中所述Rho信号转导途径抑制剂是选自由Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂和肌球蛋白抑制剂组成的组中的至少一种。
[13]根据上述[12]所述的方法,其中所述Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂选自由Y27632和法舒地尔组成的组中的至少一种。
[14]根据上述[1]-[13]中任一项所述的方法,其中所述细胞凋亡抑制剂是胱天蛋白酶抑制剂。
[15]根据上述[14]所述的方法,其中所述胱天蛋白酶抑制剂是Z-VAD-FMK。
[16]根据上述[1]-[15]中任一项所述的制备方法,其中所述多能干细胞为灵长类动物多能干细胞。
[17]根据上述[1]-[16]中任一项所述的制备方法,其中所述多能干细胞为人多能干细胞。
[18’]根据上述[1]-[17]中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期足以诱导至少一种眼区转录因子的基因表达。
[19’]根据上述[1]-[17]中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期为足以诱导PAX6、LHX2和SIX3中的至少一种的基因表达的期间。
[18]根据上述[1]-[17]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期为2天-13天。
[19]根据上述[1]-[18]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期为4天-6天。
[20]一种评价测试物质的毒性或药效的试剂,其包含通过根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞。
[21]一种评价测试物质的毒性或功效的方法,其包括使根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞与所述物质接触,并测定所述物质对所述细胞的作用。
[22]一种治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病的治疗剂,其包含通过根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞。
[23]一种治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病的方法,其包括将有效量的通过根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞移植给需要治疗的受试者。
[24]通过根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞,其用于治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病。
[25]一种药物组合物,其包含通过根据上述[1]-[19]、[18’]和[19’]中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞作为活性成分。
发明效果
本发明使得提供一种比现有的分化诱导方法更高效和便捷的制备视网膜色素上皮细胞的方法成为可能。因此,本发明的方法在有效制备视网膜色素上皮细胞方面是有用的,所述视网膜色素上皮细胞可以是用于细胞治疗的移植材料,或者用于评价化学物质的毒性或功效的试剂或材料等。
附图简述
[图1]显示含有iPS细胞(1231A3系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第42天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在FGF受体抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在ROCK抑制剂Y-27632存在下制备(10μM Y-27632),以及含有iPS细胞(1231A3系)衍生的分化细胞在培养第42天的6孔培养板的照片,所述分化细胞在不存在Y-27632(未处理)的情况下制备。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图2-1]显示含有iPS细胞(1231A3系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第48天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在FGF受体抑制剂或MEK抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在ROCK抑制剂Y-27632的存在下制备(1μM、3μM、10μM、30μM、100μMY-27632),以及含有iPS细胞(1231A3系)衍生的分化细胞在培养第48天6孔培养板的照片,所述分化细胞在不存在Y-27632(未处理)的情况下制备。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nMPD173074),MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901)。
[图2-2]显示含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第50天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在FGF受体抑制剂或MEK抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在ROCK抑制剂Y-27632的存在下制备(1μM、3μM、10μM、30μM、100μMY-27632),以及含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的分化细胞在培养第50天的6孔培养板的照片,所述分化细胞在不存在Y-27632(未处理)的情况下制备。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nMPD173074),MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901)。
[图3]显示含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第50天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在FGF受体抑制剂或MEK抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在10倍于接种细胞总数的条件下通过暴露于低浓度(1μM)ROCK抑制剂Y-27632而制备(1μM Y-27632),以及含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的分化细胞在培养第50天的6孔培养板的照片,所述分化细胞在不存在Y-27632(未处理)的情况下制备。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074),MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901)。
[图4]显示含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的视网膜色素上皮细胞的12孔培养板在培养第49天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在MEK抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,通过暴露于ROCK抑制剂Y-276323天至20天(3天、6天、9天、12天、16天、20天)而制备。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901)。
[图5]显示含有iPS细胞(1231A3系,QHJI01系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第41天或第48天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在FGF受体抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在10倍或5倍于接种细胞总数的条件下通过暴露于ROCK抑制剂法舒地尔而制备(10μM、30μM、100μM法舒地尔),以及含有iPS细胞(1231A3系,QHJI01系)衍生的分化细胞的6孔培养板在培养第41天或第48天的照片,所述分化细胞在不存在法舒地尔(未处理)的情况下制备。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图6]显示含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的视网膜色素上皮细胞的6孔培养板在培养第67天的照片,所述视网膜色素上皮细胞在MEK抑制剂处理步骤(第一步)之后的第二步中,在10倍于接种细胞总数的条件下通过暴露于胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK而制备(20μMZ-VAD-FMK),以及含有iPS细胞(QHJI01系)衍生的分化细胞在培养第65天6孔培养板的照片,所述分化细胞在不存在Z-VAD-FMK(未处理)的情况下制备。MEKi:MEK抑制剂(1μMPD0325901)。
[图7]显示含有iPS细胞(201B7或1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养38-42天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例1的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03培养基或Essential 8培养基的MEK抑制剂处理的步骤。MEKi:MEK抑制剂(当使用AK03培养基时为1μM PD0325901;当使用Essential 8培养基时为0.03μM PD0325901)。
[图8]显示含有iPS细胞(201B7)衍生的RPE细胞6孔培养板在培养55天后的(a)照片,(b)低放大倍数相差显微图像和(c)高放大倍数明视野显微图像,所述RPE细胞通过参考例1的制备方法制备,所述制备方法包括MEK抑制剂处理的步骤。MEKi:MEK抑制剂(1μMPD0325901)。
[图9]显示含有iPS细胞(201B7或1231A3)衍生的分化细胞的6孔培养板在培养38-42天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不包括使用AK03培养基或Essential 8培养基的MEK抑制剂处理的步骤。
[图10]显示含有iPS细胞(201B7或1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养38-42天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例2的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03培养基、Essential 8培养基或StemSurehPSC培养基Δw/o bFGF的FGF受体抑制剂处理的步骤。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nMPD173074)。
[图11]显示含有iPS细胞(201B7)衍生的RPE细胞的6孔培养板在培养55天后的(a)照片,(b)低放大倍数相差显微图像和(c)高放大倍数明视野显微图像,所述RPE细胞通过参考例2的制备方法制备,所述制备方法包括FGF受体抑制剂处理的步骤。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图12]显示含有iPS细胞(201B7或1231A3)衍生的分化细胞的6孔培养板在培养38-42天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例2的制备方法制备,所述制备方法不包括使用AK03培养基、Essential8培养基或StemSure hPSC培养基Δw/o bFGF的FGF受体抑制剂处理的步骤。
[图13]显示含有iPS细胞(201B7或123lA3)衍生的RPE细胞的6孔培养板在培养38-47天后的照片,所述RPE细胞通过参考例3的制备方法制备,所述制备方法包括以MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂与各种抑制剂、信号转导途径抑制剂或信号转导途径激动剂的组合进行处理的步骤。为了比较,还显示含有iPS细胞衍生的RPE细胞的6孔培养板的照片,所述RPE细胞通过不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的制备方法和包括MEK抑制剂处理的步骤的参考例1的制备方法制备(“未处理”和“MEKi”在该图的上图),以及也显示含有iPS细胞衍生的RPE细胞的6孔培养板的照片,所述RPE细胞通过不包括FGF受体抑制剂处理步骤的参考比较例2的制备方法和包括FGF受体抑制剂处理步骤的参考例2的制备方法制备(“未处理”和“FGFRi”在该图的下图)。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074),BMPRi:BMP受体抑制剂(100nM LDN193189),Shh ag:Shh信号转导途径激动剂(30nM SAG),PKCi:PKC抑制剂(2μM Go6983)。
[图14]显示(A)当根据RPE细胞在整个孔中的百分比将结果分类为0至5的6点量表时,每个量表的6孔培养板的代表性照片,(B)通过不包括MEK抑制剂处理步骤(未处理)的参考比较例1的制备方法、包括MEK抑制剂处理步骤(MEKi)的参考例1的制备方法以及包括以MEK抑制剂和各种抑制剂或信号转导途径抑制剂的组合(MEKi+PKCi、MEKi+PKCi+BMPRi、MEKi+FGFRi、MEKi+FGFRi+BMPRi、MEKi+FGFRi+PKCi、MEKi+FGFRi+PKCi+BMPRi)进行处理的步骤的参考例3的制备方法制备的结果总结,以及(C)通过不包括FGF受体抑制剂处理步骤(未处理)的参考比较例2的制备方法、包括FGF受体抑制剂处理步骤(FGFRi)的参考例2的制备方法以及包括以FGF受体抑制剂和各种抑制剂或信号转导途径抑制剂的组合(FGFRi+PKCi、FGFRi+PKCi+BMPRi、FGFRi+MEKi、FGFRi+MEKi+BMPRi、FGFRi+MEKi+PKCi、FGFRi+MEKi+PKCi+BMPRi)进行处理的步骤的参考例3的制备方法制备的结果总结。图表的纵轴以6点量表显示RPE细胞在整个孔中的百分比。这些值以平均值±标准偏差表示,n表示实验的次数。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074),BMPRi:BMP受体抑制剂(100nM LDN193189),PKCi:PKC抑制剂(2μM Go6983)。
[图15]显示含有iPS细胞(Ff-I01或QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养43天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例4的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤(MEKi或FGFRi)。为了比较,还显示含有iPS细胞衍生的分化细胞的6孔培养板在培养43天后的照片,所述分化细胞通过不包括MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂处理步骤(未处理)的参考比较例1和参考比较例2的制备方法制备。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图16]显示含有iPS细胞(QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养48天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例5的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤(MEKi(PD0325901)或FGFRi(PD173074))。检测暴露于抑制剂1天至6天的效果。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图17]显示含有iPS细胞(1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养37天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例6的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂处理步骤(MEKi(PD0325901))。为了比较,还显示含有iPS细胞衍生的分化细胞的6孔培养板在培养37天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不包括MEK抑制剂处理步骤(未处理)。检测暴露于抑制剂1天、3天、6天和13天的效果。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901)。
[图18]显示iPS细胞(Ff-I01或QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞在培养43天后在整个孔中的百分比,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例7的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤,所述百分比是根据图14A通过视觉判断的结果,以及显示在第一步(MEKi或FGFRi)结束时PAX6、LHX2和SIX3的表达值(信号)和标志(检测)。为了比较,显示iPS细胞衍生的分化细胞在整个孔中RPE细胞的视觉判断的百分比结果,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不包括MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂处理步骤(未处理),以及显示对应于第一步结束时PAX6、LHX2和SIX3的表达值(信号)和标志(检测)。MEKi:MEK抑制剂(1μMPD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074)。
[图19]显示含有iPS细胞(QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养36天或49天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例8的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤(MEKi(PD0325901)或FGFRi(PD173074))。为了比较,还显示含有iPS细胞衍生的分化细胞的6孔培养板在培养49天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例1和参考比较例2的制备方法制备,所述制备方法不包括MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂处理步骤(未处理)。检测了浓度为0.25μM-4μM的MEK抑制剂或浓度为25nM-400nM的FGF受体抑制剂的影响。MEKi:MEK抑制剂(PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(PD173074)。
[图20]显示含有iPS细胞(QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养49天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例9的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤(MEKi(PD0325901)或FGFRi(PD173074))。检测了在第二步开始时接种的细胞数(0.2×104-4.0×104细胞/cm2)的影响。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901),FGFRi:FGF受体抑制剂(100nMPD173074)。
[图21]显示含有iPS细胞(QHJI01或1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养49天或50天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例10的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂处理步骤(MEKi(PD0325901)、MEKi(PD184352)、MEKi(U0126)、MEKi(TAK-733)或MEKi(AZD-8330))。为了比较,还显示了含有iPS细胞衍生的分化细胞在培养49天后6孔培养板的照片,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不包括MEK抑制剂处理步骤(未处理)。MEKi:MEK抑制剂(1μM PD0325901,1.5μM、3μM或6μM PD184352,5μM或10μM U0126,0.3μMTAK-733,0.3μM AZD-8330)。
[图22]显示了含有iPS细胞(QHJI01或1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养49天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例11的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基(FGFRi(PD173074)或FGFRi(SU5402))的FGF受体抑制剂处理步骤。为了比较,还显示了含有iPS细胞衍生的分化细胞的6孔培养板在培养49天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例2的制备方法制备,所述制备方法不包括FGF受体抑制剂处理步骤(未处理)。FGFRi:FGF受体抑制剂(100nM PD173074,5μM、10μM或20μMSU5402)。
[图23]显示了含有iPS细胞(QHJI01)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的12孔培养板在培养43天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例12的制备方法制备,所述制备方法包括在使用含有MEK抑制剂(NODALi+WNTI,NODALi或WNTI)的AK03N培养基的第一步之后,在第二步中,在存在Nodal信号转导途径抑制剂和/或Wnt信号转导途径抑制剂的条件下培养。检测了在第二步中单独暴露于Nodal信号转导途径抑制剂或Wnt信号转导途径抑制剂的分化诱导效果。NODALi:Nodal信号转导途径抑制剂(5μM SB431542),WNTi:Wnt信号转导途径抑制剂(3μM CKI-7)。
[图24]显示了iPS细胞(201B7)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞在培养39天后在整个孔中的百分比,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例13的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂和BMP受体抑制剂处理步骤,所述百分比是根据图14A(在该图中的上部,MEKi 6天+BMPRi 1天,或MEKi 6天+BMPRi 6天)通过视觉判断的结果,并且显示了在培养39天之后通过实时RT-PCR方法视网膜色素上皮标记物BEST1和MITF以及在眼形成早期标记物RAX的表达水平的比较结果(在该图中的下部,在整个孔中RPE细胞的百分比(6点量表的“3”和“5”))。为了比较,还显示了iPS细胞衍生的分化细胞在培养39天后的整个孔中RPE的视觉判断的百分比结果,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不包括MEK抑制剂和/或BMP受体抑制剂处理步骤(在该图中的上部,“未处理”),以及显示BEST1、MITF和RAX的表达水平(在该图的下部,在整个孔中RPE细胞的百分比(6点量表的“1”))。将各样品中的基因表达水平用GAPDH的表达水平标准化,并在将维持未分化状态的条件下培养的iPS细胞中的表达水平限定为1时以相对量显示用于BEST1、MITF或RAX的表达量的比较(该图中下方,“未分化”)。
[图25]显示含有iPS细胞(1231A3)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的6孔培养板在培养43天后的照片,所述视网膜色素上皮细胞通过参考例14的制备方法制备,所述制备方法包括使用AK03N培养基的MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤(该图中右侧,MEKi(PD0325901)和FGFRi(PD173074)),并且显示了培养43天后通过RT-PCR方法,视网膜色素上皮标记物RPE65、BEST1和CRALBP以及内源性对照GAPDH的表达的确认结果(在该图的左侧,MEKi(PD0325901)和FGFRi(PD173074))。为了比较,还显示了含有iPS细胞衍生的分化细胞的6孔培养板在培养43天后的照片,所述分化细胞通过参考比较例1的制备方法制备,所述制备方法不具有MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂处理步骤(在该图中的右侧,未处理),以及针对RPE65、BEST1、CRALBP和GAPDH的RT-PCR的结果(在该图的左侧,未处理)。使用原代人RPE作为阳性对照(在该图中的左侧,hRPE),并且使用在用于维持未分化状态的条件下培养的iPS细胞作为阴性对照(在该图中的左侧,未分化的iPSC),以用于RT-PCR方法。
发明详述
1.定义
在本说明书中,“多能干细胞”意指具有自我更新能力和多能性的细胞,即能够在体外培养并且具有分化为属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的所有细胞谱系的能力(多能性)的干细胞。
多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导的多能干细胞(iPS细胞)等。在本发明中要使用的多能干细胞是哺乳动物多能干细胞,优选啮齿动物或灵长类动物的多能干细胞,更优选人多能干细胞。作为这里的哺乳动物,可以提及灵长类动物如人、猴等,啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等,以及其他犬、猫、猪、牛、山羊、马、绵羊、兔等。
胚胎干细胞可以,例如通过在饲养细胞上或在含有LIF的培养基中植入之前培养存在于囊胚期胚胎中的内部细胞团,来制备。例如,胚胎干细胞的具体制备方法描述于WO96/22362、WO 02/101057、US 5,843,780、US 6,200,806和US 6,280,718等。人胚胎干细胞也可以在不破坏人胚胎的情况下制备,例如通过WO2003/046141和Chung等(Cell StemCell,2008年2月,第2卷,第113-117页)中描述的方法。胚胎干细胞可从指定的机构获得,或者可以购买商业上可获得的产品。例如,人胚胎干细胞KhES-1、KhES-2和KhES-3可从京都大学前沿医学研究所(Kyoto University’s Institute for Frontier Medical Sciences)获得。EB5细胞(其是小鼠胚胎干细胞)可从国立研究开发法人理化学研究所(IncorporatedAdministrative Agency RIKEN)获得,且D3细胞系(其是小鼠胚胎干细胞)可从ATCC获得。
核移植ES细胞(ntES细胞)是ES细胞之一,可以从通过将体细胞的细胞核移植到去核卵中而产生的克隆胚胎建立。
“诱导的多能干细胞”是通过已知方法等将体细胞重编程而被诱导为具有多能性的细胞。具体地,可以提及通过引入选自诸如Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28及Esrrb等基因的多种重编程因子的任意组合,将体细胞(如成纤维细胞、皮肤细胞、外周血单核细胞等)重编程而被诱导为具有多能性的细胞。重编程因子的优选组合的实例可以包括(1)Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc(c-Myc或L-Myc)和(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc(Stem Cells,2013;31:458-466)。
诱导的多能干细胞由Yamanaka等在小鼠细胞中于2006年首次建立(Cell,2006,126(4),pp.663-676),并且还于2007年在人成纤维细胞中建立(Cell,2007,131(5)pp.861-872;Science,2007,318(5858)pp.1917-1920;Nat.Biotechnol.,2008,26(1)pp.101-106)。之后在诱导的多能干细胞的诱导方法方面已经做出了多种改进,并且在Cell.2006年8月25日;126(4):663-76中描述了例如小鼠诱导的多能干细胞的具体制备方法,并且在Cell.2007年11月30日;131(5):861-72中描述了人诱导的多能干细胞的具体制备方法,等等。
除了基于通过基因表达的直接重编程的制备方法以外,还可以通过加入化合物等从体细胞获得诱导的多能干细胞(Science,2013,341,pp.651-654)。
还可以获得已建立的诱导的多能干细胞,例如,由京都大学建立的人诱导的多能细胞系如201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞或1231A3细胞等可从京都大学和iPS Academia Japan,Inc.获得。作为已建立的诱导的多能干细胞,例如由京都大学建立的Ff-I01细胞和Ff-I14细胞和QHJI01细胞可从京都大学获得。
尽管对用于获得诱导的多能干细胞的体细胞没有特别限制,可以具体提及成纤维细胞、血液谱系细胞(例如,外周血单核细胞或T细胞、脐带血衍生细胞)等。作为成纤维细胞,可以提及衍生自真皮等的那些。
当通过几种类型重编程因子的表达进行重编程以制备诱导的多能干细胞时,对用于基因表达的手段没有特别限制。可以使用对本领域普通技术人员来说公知的基因转移法或蛋白质的直接注入法。前述基因转移法的具体实例包括使用病毒载体(例如,逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendaivirus)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染方法、磷酸钙方法、脂质转染方法、RetroNectin方法、电穿孔方法,其各自使用质粒载体(例如,质粒载体、游离型载体)或RNA载体等。
诱导的多能干细胞可以在存在饲养细胞的情况下或者在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的情况下制备。当在存在饲养细胞的情况下制备诱导的多能干细胞时,诱导的多能干细胞可以在存在用于维持未分化状态的因子的情况下通过已知方法制备。虽然对用于在不存在饲养细胞的情况下制备诱导的多能干细胞的培养基没有特别限制,可以使用用于胚胎干细胞和/或诱导的多能干细胞的已知维持培养基,以及在无饲养细胞条件下用于建立诱导的多能干细胞的培养基。在无饲养细胞条件下用于建立诱导的多能干细胞的培养基的实例可以包括无饲养细胞培养基,如Essential 8培养基(E8培养基)、Essential 6培养基、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、稳定的Essential 8培养基及StemFit(注册商标)等。当制备诱导的多能干细胞时,例如,其可以在不存在饲养细胞的情况下,通过使用仙台病毒载体将Oct3/4、Sox2、Klf4、和Myc 4个因子基因转入体细胞中制备。
在本发明中所使用的多能干细胞优选为啮齿动物或灵长类动物的诱导的多能干细胞,更优选人诱导的多能干细胞。
尽管本领域普通技术人员可以通过公知方法进行多能干细胞的维持培养或扩大培养,从移植细胞制备的安全性等方面来看,多能干细胞优选在无血清条件下和不存在饲养细胞的情况下经历维持培养或扩大培养。
遗传修饰的多能干细胞可以通过使用例如同源重组技术来制备。在染色体上待修饰的基因的实例包括细胞标记基因、组织相容性抗原基因、与由于色素上皮细胞障碍的疾病相关的基因等。在染色体上的靶基因可以使用以下各项中描述的方法修饰:Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press(1994);Gene Targeting,A PracticalApproach,IRL Press at OxfordUniversity Press(1993);Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of MutantMouse using ES cell,YODOSHACO.,LTD.(1995);Nature,478:391-394(2011);PNAS,111:1461-17466(2014);Nat Methods,8:753-755(2011)等等。
具体地,例如,分离包含待修饰的靶基因(例如,细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关基因等)的基因组DNA,并且使用分离的基因组DNA制备用于靶基因的同源重组的靶向载体。将制备的靶向载体引入干细胞中,并且选择显示出在靶基因和靶向载体之间的同源重组的细胞,由此可以制备在染色体上具有修饰基因的干细胞。
用于分离包含靶基因的基因组DNA的方法的实例包括在以下各项中描述的已知方法:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor LaboratoryPress(1989),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)等等。包含靶基因的基因组DNA还可以使用基因组DNA文库筛选***(由Genome Systems制)、Universal GenomeWalker Kits(由CLONTECH制)等分离。还可以使用编码靶蛋白的多核苷酸代替基因组DNA。所述多核苷酸可以通过PCR方法扩增相应多核苷酸而得到。
用于靶基因的同源重组的靶向载体的制备以及同源重组体的高效选择可以根据以下各项中描述的方法进行:Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press atOxford University Press(1993);Biomanual Series 8,GeneTargeting,Making ofMutant Mouse using ES cell,YODOSHACO.,LTD.(1995)等等。作为靶向载体,可以使用替换类型或***类型中的任一种。作为选择方法,可以使用如阳性选择、启动子选择、阴性选择及polyA选择等的方法。
从所选细胞系中选择所需同源重组体的方法的实例包括用于基因组DNA的Southern杂交方法、PCR方法等。
在本说明书中的“眼区转录因子”是在早期发育阶段中的眼区区域中表达的基因,并且已经确定了ET(Tbx3)、Rx1(Rax)、Pax6、Six3、Lhx2、Tlx(Nr2e1)及Optx2(Six6)等。可以使用这些眼区转录因子作为早期眼形成阶段的标记物。
在本说明书中的“视网膜色素上皮细胞”意指在体内视网膜中神经视网膜组织的外侧上存在的上皮细胞。细胞是否为视网膜色素上皮细胞可以由本领域普通技术人员基于例如细胞标记物(RPE65、Mitf、CRALBP、MERTK及BEST1等)的表达、黑色素粒(褐黑色)的存在、细胞间紧密结合、典型的多边形、鹅卵石样细胞形态等容易地确认。细胞是否具有视网膜色素上皮细胞的功能可以通过细胞因子(如VEGF和PEDF等)的分泌能力等容易地确认。
在本说明书中的“悬浮培养”是指在用于维持使细胞或细胞聚集体在培养基中悬浮的状态的条件下培养。也就是说,培养在细胞或细胞聚集体和培养容器等之间未形成强细胞-基质(substratum)连接的条件下进行。
“黏附培养”是指在使细胞或细胞聚集体黏附至培养容器材料等的条件下培养。在这种情况下,细胞的黏附意指在细胞或细胞聚集体和培养容器材料之间形成强细胞-基质结合。也就是说,黏附培养是指在细胞或细胞聚集体和培养容器材料等之间形成强细胞-基质连接的条件下培养。
在悬浮培养物中的细胞聚集体中,形成平面细胞-细胞黏附(平面附着)。在悬浮培养的细胞聚集体中,几乎不与培养容器等形成细胞-基质结合,即使其形成,其贡献也很小。在一些实施方案中,在悬浮培养的细胞聚集体中,在聚集体内部存在内源性细胞-基质连接,但是几乎不与培养容器等形成细胞-基质结合,即使其形成,其贡献也很小。平面细胞-细胞黏附意指细胞通过平面附着至另一个细胞。更具体地,平面细胞-细胞黏附意指,例如细胞的表面积的不小于1%、优选不小于3%、更优选不小于5%黏附至另一个细胞的表面。细胞的表面可以通过用染膜的试剂(例如,DiI)进行染色、细胞黏附分子(例如,E-钙粘着蛋白和N-钙粘着蛋白)的免疫染色来观察。
对用于黏附培养的培养容器没有特别限制,只要可以进行“黏附培养”即可,并且本领域普通技术人员可以根据培养的培养规模、培养条件和培养期适当地选择适合的培养容器。这样的培养容器的实例包括组织培养瓶、培养皿、组织培养皿、多层平皿(multidish)、微量板、微孔板、多层板(multiplate)、多孔板、细胞培养载玻片(chamberslide)、盘(schale)、试管、托盘、培养袋、微载体、珠子、旋转瓶和滚瓶。为了实现黏附培养,这些培养容器优选是细胞黏附的。细胞黏附的培养容器包括其表面已经人工处理以提高细胞黏附性的培养容器,并且具体地,可以提及其内部涂布有涂布剂的培养容器。涂布剂的实例包括细胞外基质,如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(下文称层粘连蛋白511)、层粘连蛋白α1β1γ1(下文称层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白、Synthemax(康宁公司(Corning Incorporated))、基质胶等,或聚合物如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等,等等。还可以使用其表面通过正电荷处理等进行处理的培养容器。更优选地,使用涂布有层粘连蛋白511E8的培养容器,因为可以进行视网膜色素上皮细胞的稳定和高效的诱导(WO 2015/053375)。作为层粘连蛋白511E8,可以使用商业上可获得的产品(例如,iMatrix-511,Nippi)。
对用于在进行悬浮培养时使用的培养容器没有特别限制,只要其能够“悬浮培养”即可,并且本领域普通技术人员可以对其进行适当地选择。这样的培养容器的实例包括烧瓶、组织培养烧瓶、培养皿、皮氏培养皿(petri dish)、组织培养皿、多层平皿(multidish)、微量板、微孔板、微孔、多层板(multiplate)、多孔板、细胞培养载玻片(chamber slide)、盘(schale)、试管、托盘、培养袋、旋转烧瓶、滚瓶等。为了能够进行悬浮培养,这些培养容器优选是非细胞黏附的。非细胞黏附培养容器包括其表面尚未经历用于提高细胞黏附性的人工处理(例如,利用细胞外基质如层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、明胶等的涂布处理,或利用聚合物如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等的涂布处理或如正电荷处理等的表面处理)的培养容器等。作为非细胞黏附培养容器,可以使用其表面已经被人工处理以降低对细胞的黏附性(例如,利用MPC聚合物等的超亲水处理、蛋白质低吸附处理等)等的培养容器。
在本说明书中用于培养细胞的培养基可以由通常作为基础培养基用于培养动物细胞的培养基制备。商业上可获得的基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的培养基,如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、改良MEMZinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F-12培养基、IMDM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer培养基等。可以使用单一培养基或其两种或更多种的组合,但培养基不限于此。
如本文所用,前述基础培养基可含有一种或更多种添加剂,所述添加剂适当地选自调节剂(如缓冲剂(例如HEPES))、盐(例如无机盐如氯化钠、碳酸氢钠等)、抗氧化剂(例如,2-巯基乙醇)等、营养补充剂(如氨基酸(例如非必需氨基酸)、脂肪酸、糖、维生素、脂质或丙酮酸等)、抗生素(例如青霉素、链霉素)、细胞外基质(例如基质胶、层粘连蛋白、层粘连蛋白片段、层粘连蛋白511-E8片段)和染料(例如,酚红)等,但添加剂不限于这些。另外,上述基础培养基中可以含有细胞因子或生长因子作为添加剂至不影响从多能干细胞向RPE细胞的诱导分化的程度。
当基础培养基中不含上述添加剂时,可将它们适当地加入基础培养基中。
在本说明书中的“血清培养基”意指含有未调整或未纯化的血清的培养基。尽管可以使用来源于任何动物的血清,可以优选使用来源于哺乳动物(如牛、人等)的血清。当进行旨在自体移植的细胞培养时,也可以使用患者自身的血清。
对血清的浓度没有特别地限制,只要其可以高效地诱导视网膜色素上皮细胞的分化即可。例如,可以将其适当地设定在约0.5%-30%(v/v)的范围内。浓度可以是恒定的或者可以在各个步骤中变化。
“无血清培养基”意指不含未调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中,在无血清培养基中还包括含有纯化的血液来源组分和动物组织来源组分(例如,生长因子)的培养基,除非在其中含有未调整或未纯化的血清。
“无血清条件”意指不含未调整或未纯化血清的条件,特别是使用无血清培养基的条件。
无血清培养基可以含有血清替代物。血清替代物的实例包括适当地含有白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫代甘油或这些的等效物等的血清替代物。这样的血清替代物可以通过例如在WO 98/30679中描述的方法制备。血清替代物可以是商业上可获得的产品。这样的商业上可获得的血清替代物的实例包括KnockoutTM血清替代物(Life Technologies,在下文中有时表示为KSR)、化学成分明确的脂质浓缩物(由Life Technologies制)和GlutamaxTM(由Life Technologies制)、B27(由LifeTechnologies制)、N2(由Life Technologies制)。
为了避免复杂的制备,可以使用加入了适量(例如,约0.5%至约30%,优选约5%至约20%)的商业上可获得的KSR(由Life Technologies制)(例如,加入了上述浓度范围内的KSR的Glasgow MEM培养基)的无血清培养基作为这样的无血清培养基。
为了避免被化学上不明确的组分的污染,本发明中待使用的培养基优选其组分是化学上明确的培养基(化学上明确的培养基;CDM)。
在本发明中,优选在无异源条件下进行培养。“无异源”意指消除来源于不同于要培养的细胞的物种的组分(蛋白质等)的条件。
在本说明书中,“含有物质X的培养基”和“在存在物质X的情况下”分别指补充有外源性物质X的培养基或含有外源性物质X的培养基,或在存在外源性物质X的情况下,和在存在外源性物质X的情况下。另一方面,“不含物质X的培养基”和“不存在物质X的情况下”分别指未补充外源性物质X的培养基或不含外源性物质X的培养基,或不存在外源性物质X的情况下。也就是说,当存在于培养基中的细胞内源性表达、分泌或制备物质X时,将内源性物质X与外源性物质X进行区分,并且不含外源性物质X的培养基被认为落在“含有物质X的培养基”的范畴之外,(即使当其含有内源性物质X时),而是落在“不含物质X的培养基”的范畴之内。
例如,“含有FGF信号转导途径激动剂的培养基”是补充有外源性FGF信号转导途径激动剂的培养基或含有外源性FGF信号转导途径激动剂的培养基。
在本说明书中,“饲养细胞”是指培养干细胞时共存的多能干细胞以外的细胞。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞(MEF)、人成纤维细胞、SNL细胞等。作为饲养细胞,优选经历生长抑制处理的饲养细胞。生长抑制处理的实例包括用生长抑制剂(例如,丝裂霉素C)、γ辐照等处理。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞通过分泌体液因子(优选用于维持未分化状态的因子)或制备细胞黏附用支架(细胞外基质)而有助于维持多能干细胞的未分化状态。
在本说明书中,在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的情况下意指在不存在饲养细胞的情况下培养。作为不存在饲养细胞的情况,例如,可以提及不添加饲养细胞或基本不含饲养细胞的情况(例如,饲养细胞的数量相对于细胞的总数量的比率不大于3%)。
在本说明书中,“Rho信号转导途径”意指由Rho(其是一种低分子量G蛋白)介导的上游和下游信号转导途径。具体的,它是由构成Rho信号转导途径的因子介导的信号转导途径,所述因子例如位于Rho上游的GDP-GTP交换因子(GEF;鸟嘌呤核苷酸交换因子,例如abr(ActiveBcr相关的))、Rho(例如,RhoA、RhoB、RhoC)、位于Rho下游的ROCK(Rho-相关的卷曲螺旋形成激酶/Rho-结合激酶)、位于ROCK下游的肌球蛋白轻链等(有时称为Rho信号转导途径组分)。
在本说明书中,“细胞凋亡”是一种受控的细胞***机制,也称为程序性细胞死亡。它与细胞坏死不同之处在于它是由决定细胞死亡或存活的基因调控的。细胞凋亡可以通过膜联蛋白V染色等与细胞坏死区分开。
在本说明书中,“胱天蛋白酶(caspase)”是一组构成引起细胞经历细胞凋亡的信号转导途径的胱天蛋白酶。迄今为止,在哺乳动物中已经鉴定了至少18种,并且已经鉴定了至少12种(胱天蛋白酶-1至-10、-12、-14)在人中。其中,已知至少胱天蛋白酶-2、-3、-6、-7、-8、-9、-10、-12参与细胞凋亡的进行。
存在多种诱导细胞凋亡的途径。例如,存在经由线粒体的途径、经由内质网的途径、经由死亡配体(如Fas配体等)的途径等,并且在所有途径中细胞凋亡均由胱天蛋白酶的激活诱导。已知细胞凋亡在人多能干细胞中通过分散培养激活Rho信号转导途径后,通过经由线粒体的途径激活胱天蛋白酶来诱导(Ohgushi等,Cell Stem Cell7,225-39(2010))。
在本说明书中,各种化学物质如ROCK抑制剂、FGF受体抑制剂、MEK抑制剂等各自包括游离形式、盐等。例如,Y-27632包括游离形式的Y-27632及其盐酸盐、Y-27632二盐酸盐等。
2.视网膜色素上皮细胞的制备方法
本发明的制备方法是一种视网膜色素上皮细胞的制备方法,包括以下步骤(1)-(2):
(1)第一步,在包含选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞不超过30天的期间,和
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
(1)第一步
作为第一步中优选的多能干细胞,可以提及胚胎干细胞(也称为ES细胞)或预处理的多能干细胞,例如诱导的多能干细胞(也称为iPS细胞)等,优选人预处理的多能干细胞。作为多能干细胞,可以提及优选诱导的多能干细胞,更优选人诱导的多能干细胞。诱导的多能干细胞的制备方法没有特别限制,可以采用上述本领域普通技术人员公知的方法制备。还希望在无饲养细胞条件下进行制备诱导的多能干细胞的步骤(即,将体细胞重编程以建立多能干细胞的步骤)。
多能干细胞通常在维持培养或扩大培养后进行第一步。多能干细胞的维持培养或扩大培养可以通过本领域普通技术人员公知的方法进行,优选在不存在饲养细胞的情况下进行。尽管多能干细胞的维持和扩大培养可以通过黏附培养或悬浮培养进行,但优选通过黏附培养进行。
在不存在饲养细胞的情况下,多能干细胞的维持培养或扩大培养可以在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中进行。用于维持未分化状态的因子没有特别限制,只要是具有抑制多能干细胞分化的作用的物质即可。其通常是源自哺乳动物的用于维持未分化状态的因子。由于用于维持未分化状态的因子在哺乳动物物种间可能具有交叉反应性,所以只要可以维持要培养的多能干细胞的未分化状态,也可以使用任一种哺乳动物的用于维持未分化状态的因子。优选使用与要培养细胞同种的哺乳动物的用于维持未分化状态的因子。
在预处理的多能干细胞的情况下,本领域普通技术人员广泛使用的用于维持未分化状态的因子的实例包括FGF信号转导途径激动剂、TGFβ家族信号转导途径激动剂等。作为FGF信号转导途径激动剂,可以具体提及成纤维细胞生长因子(例如bFGF、FGF4、FGF8)。作为TGFβ家族信号转导途径激动剂,可以提及TGFβ信号转导途径激动剂(例如TGFβ1、TGFβ2)、Nodal/活化素信号转导途径激动剂(例如Nodal、活化素A、活化素B)。培养人多能干细胞(人ES细胞、人iPS细胞)时,用于维持未分化状态的因子优选bFGF和TGFβ。
在多能干细胞的维持培养或扩大培养中要使用的培养基中的用于维持未分化状态的因子的浓度是能够维持要培养的多能干细胞的未分化状态的浓度,并且可以由本领域普通技术人员适当地确定。例如,具体地,当使用bFGF作为用于维持未分化状态的因子时,其浓度通常是约4-500ng/mL,优选10-200ng/mL,更优选约30-150ng/mL。
作为含有用于维持未分化状态的因子的培养基(在下文中有时表示为无饲养细胞培养基),还可以酌情使用商业上可获得的培养基作为用于干细胞的培养基。例如,Essential 8(由Life Technologies制)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008年9月9日;105(36):13409-14)、S-培养基(由DS Pharma Biomedical制)、StemPro(由LifeTechnologies制)、mTeSR1(由STEMCELL Technologies制)、mTeSR2(由STEMCELLTechnologies制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies制)、(Ajinomoto Co.,Inc.制)等在商业上可获得。使用这些培养基,可以进行多能干细胞的维持培养或扩大培养。
当回收经历维持培养或扩大培养的多能干细胞时,通过分散操作制备分散的多能干细胞。多能干细胞的分散操作可以包括机械分散处理、细胞分散溶液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以组合进行。优选地,细胞分散溶液处理与细胞保护剂添加处理同时进行,之后进行机械分散处理。
作为要用于细胞保护剂添加处理的细胞保护剂,可以提及肝素、血清、或血清替代物。
作为要用于细胞分散处理的细胞分散溶液,可以提及含有诸如胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNase、木瓜蛋白酶等的酶中的任一种,以及螯合剂(如乙二胺四乙酸等)的溶液。也可以使用商业上可获得的细胞分散溶液,如TrypLE Select(由Life Technologies制)和TrypLE Express(由Life Technologies制)。
作为机械分散处理的方法,可以提及移液处理或通过刮刀刮擦。
可以将分散的多能干细胞接种在新的培养容器中并进行第一步。
为了抑制由分散诱导的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡),可以将多能干细胞接种在新的培养容器中,可以在ROCK抑制剂的存在下连续进行维持培养,并且此后可以开始第一步。尽管对用ROCK抑制剂处理的期间没有特别地限制,只要可以抑制由分散诱导的细胞死亡即可,其通常约12-24小时。
本领域普通技术人员可以适当地设定第一步开始时多能干细胞的浓度。在黏附培养中,例如为1.0×102细胞/cm2至1×106细胞/cm2,优选2.0×102细胞/cm2至2×105细胞/cm2,更优选5×102细胞/cm2至1×105细胞/cm2或1×103细胞/cm2至1×104细胞/cm2。
为了避免被化学上不明确的成分污染,在第一步中所使用的培养基优选为其成分为化学上明确的培养基。
将要在第一步中使用的培养基可以是血清培养基或无血清培养基。为了避免被化学上不明确的成分污染,其优选为无血清培养基。
在第一步中使用的培养基任选含有ROCK(Rho-相关的卷曲螺旋形成激酶/Rho-相关的激酶)抑制剂以抑制细胞死亡(细胞凋亡)。作为ROCK抑制剂,可以提及Y-27632、法舒地尔或H-1152等。可以使用仅一种ROCK抑制剂,或者可以组合使用其两种或更多种。而ROCK抑制剂的浓度可以由本领域普通技术人员适当地设定,例如,可以将其设定在显示出对应于约50nM-200μM的Y-27632的ROCK抑制活性的浓度范围内。
在第一步中的培养可以在存在饲养细胞的情况下进行。为了避免化学上不明确的成分的污染,培养优选在不含饲养细胞的条件下进行。
在第一步中使用的培养基可以含有或可以不含有用于维持未分化状态的外源因子,不论其是在不存在饲养细胞的情况下或在存在饲养细胞的情况下培养。在本发明中的第一步中更优选在不存在饲养细胞的情况下在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中进行。用于维持未分化状态的因子没有特别限制,只要其是具有抑制多能干细胞的分化的作用的物质即可。优选地,其含有FGF信号转导途径激动剂,更优选含有bFGF。
要在第一步中使用的培养基中的用于维持未分化状态的因子的浓度可以在用于多能干细胞的维持培养或扩大在用于维持未分化状态的培养下的因子的浓度范围内。例如,当在不存在饲养细胞的情况下使用bFGF作为用于维持未分化状态的因子时,其浓度通常是约4-500ng/mL,优选10-200ng/mL,更优选约30-150ng/mL。
要在第一步中使用的培养基含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种。培养基可以含有另外的组分(例如,信号转导通路的任何激动剂或抑制剂),只要通过本发明的制备方法的视网膜色素上皮细胞的制备效率不降低即可(例如,与不具有第一步的效率水平相同或不大于该效率水平的水平)。例如,培养基还可单独含有BMP受体抑制剂、Sonic Hedgehog信号转导途径激动剂或PKC抑制剂,或含有下列(1)-(4)中任一种的组合:(1)BMP受体抑制剂和Sonic hedgehog信号转导途径激动剂;(2)BMP受体抑制剂和PKC抑制剂;(3)Sonic hedgehog信号转导途径激动剂和PKC抑制剂;(4)BMP受体抑制剂、Sonic hedgehog信号转导途径激动剂和PKC抑制剂。备选地,培养基可以不含BMP受体抑制剂、Sonic Hedgehog信号转导途径激动剂和PKC抑制剂中的任一种。
在本发明中,对FGF受体抑制剂没有特别限制,只要其为能够抑制由FGF介导的信号转导的物质即可,并且其可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任一种。在这里FGF形成含有至少22个种的家族。作为代表性的FGF受体,可以提及FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等,并且FGF受体抑制剂是抑制这些中的一种、多种或全部的物质。该物质的实例包括但不限于,直接作用于FGF或FGF受体的物质(例如,抗体、适配体等),抑制编码FGF或FGF受体的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制FGF受体和FGF的结合的物质(例如,可溶性FGF受体、FGF拮抗剂等),抑制藉由FGF受体的信号转导引起的生理活性的物质[例如,低分子量化合物,如PD173074(N-[2-[[4-(二乙氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N’-(1,1-二甲基乙基)脲)、SU5402(2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸)或PD161570(1-叔丁基-3-[6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-(二乙氨基)丁基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]脲)等],其通过ATP竞争抑制FGF受体的酪氨酸激酶活性。可以使用仅一种该物质或者可以组合使用两种或更多种该物质。PD173074和SU5402是已知的FGF受体抑制剂,并且可以酌情得到商业上可获得的产品等。作为FGF受体抑制剂,优选的是,例如PD173074或SU5402。
在本发明中,对在第一步中的培养基中含有的FGF受体抑制剂的浓度没有特别限制,只要可以通过本发明的方法制备视网膜色素上皮细胞即可,并且其可以根据FGF受体抑制剂的种类由本领域普通技术人员适当地确定。例如,FGF受体抑制剂的浓度在显示出FGF受体抑制活性的浓度范围内,对应于1-1000nM,优选10-500nM、更优选25-400nM,特别优选30-300nM的PD173074。例如,可以提及0.1-500μM、优选1-100μM、更优选5-20μM的SU5402的浓度范围。浓度可以在整个第一步中恒定,或者可以在各个步骤中变化,只要可以通过本发明的方法制备视网膜色素上皮细胞即可。
在本发明中,对MEK抑制剂没有特别限制,只要其为抑制MEK家族激酶的表达或活性的物质即可,并且其可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任一种。作为代表性的MEK家族激酶,可以提及MEK1、MEK2、MEK3等,并且MEK抑制剂是抑制这些MEK家族激酶中的一种、多种或全部的表达或活性的物质。该物质的实例包括但不限于,抑制编码多种MEK的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制多种MEK的酶活性的物质[低分子量化合物如PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺)、PD184352((2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺)、PD98059(2’-氨基3’-甲氧基黄酮)、U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫基]丁二烯)、MEK162(5-[(4-溴-2-氟苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺)、SL327(α-[氨基[(4-氨基苯基)硫代]亚甲基]-2-(三氟甲基)苯乙腈)、TAK-733((R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮)或AZD-8330(2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺)等]等。可以使用仅一种该物质或者可以组合使用两种或更多种该物质。PD0325901、PD184352、PD98059、U0126、MEK162、SL327、TAK-733和AZD-8330是已知的MEK抑制剂,并且可以酌情得到商业上可获得的产品等。作为MEK抑制剂,优选的是,例如PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733或AZD-8330。
在本发明中,对在第一步中的培养基中含有的MEK抑制剂的浓度没有特别限制,只要可以通过本发明的方法制备视网膜色素上皮细胞即可,并且其可以由本领域普通技术人员根据MEK抑制剂的种类适当地确定。例如,MEK抑制剂的浓度在显示出MEK抑制活性的浓度范围内,对应于0.001-10μM,优选0.005-5μM、更优选0.1-4μM,更优选0.25-4μM,特别优选0.25-2μM的PD0325901。例如,可以提及0.01-20μM,优选0.1-10μM,更优选1.5-6μM的PD184352的浓度范围。浓度可以在整个第一步中恒定,或者可以在各个步骤中变化,只要可以通过本发明的方法制备视网膜色素上皮细胞即可。
在本发明中,对BMP受体抑制剂没有特别限制,只要其为能够抑制由BMP介导的信号转导的物质即可,并且其可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任一种。作为代表性的BMP,可以提及BMP2、BMP4、BMP7、GDF7等。在这里的BMP受体(BMPR)作为TYPE I受体(ALK(活化素受体样激酶)-1、ALK-2、ALK-3、ALK-6)和TYPE II受体(ActRII、BMPRII)的异源二聚体存在。BMP受体抑制剂的实例包括但不限于,直接作用于BMP或BMP受体的物质(例如,抗体、适配体等),抑制编码BMP或BMP受体的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制BMP受体和BMP的结合的物质(例如,可溶性BMP受体、BMP拮抗剂等),抑制藉由BMP受体的信号转导引起的生理活性的物质[低分子量化合物如LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)或Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶)等,等等]等。可以使用仅一种该物质或者可以组合使用两种或更多种该物质。LDN193189和Dorsomorphin是已知的BMP I型受体抑制剂,并且可以酌情得到商业上可获得的产品等。作为BMP受体抑制剂,优选的是,例如,LDN193189。
对在本发明中的Sonic hedgehog(在下文中有时表示为Shh)信号转导途径激动剂没有特别限制,只要其为能够增强由Shh介导的信号转导的物质即可,并且其可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任一种。Shh信号转导途径激动剂的实例包括但不限于,属于Hedgehog家族的蛋白质(例如,Shh和Ihh)、Shh受体、Shh受体激动剂[低分子量化合物如Purmorphamine(9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘基氧基)-9H-嘌呤-6-胺)或SAG(平和化激动剂(SmoothenedAgonist);N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷)等,等等]等。可以使用仅一种该物质或者可以组合使用两种或更多种该物质。Purmorphamine和SAG是已知的Shh信号转导途径激动剂,并且可以酌情得到商业上可获得的产品等。作为Shh信号转导途径激动剂,优选的是,例如,SAG。
在本发明中,对PKC抑制剂没有特别限制,只要其为能够抑制蛋白激酶C(PKC)的表达或活性的物质即可,并且其可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任一种。在这里的PKC是由至少10种的同工酶构成的蛋白家族,并且PKC抑制剂是抑制这些PKC家族中的一种、多种或全部的表达或活性的物质。该物质的实例包括但不限于,抑制编码PKC的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制PKC的酶活性的物质[例如,低分子量化合物如Go6983(3-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)等,等等]等。可以使用仅一种该物质或者可以组合使用两种或更多种该物质。Go6983是已知的PKC抑制剂,且可以酌情得到商业上可获得的产品等。作为PKC抑制剂,优选的是,例如,Go6983。
在本发明中,在第一步中的培养基中含有的BMP受体抑制剂、Sonic hedgehog信号转导途径激动剂和PKC抑制剂的浓度可以由本领域普通技术人员适当地确定,以落在通过本发明的方法能够获得视网膜色素上皮细胞的范围内。例如,BMP受体抑制剂的浓度在显示出BMP受体抑制活性的浓度范围内,对应于1-1000nM,优选10-500nM,更优选30-300nM的LDN193189。Shh信号转导途径激动剂的浓度在显示出Shh信号转导作用的浓度范围内,对应于1-2000nM,优选3-1000nM,更优选10-500nM的SAG。PKC抑制剂的浓度为显示出PKC抑制活性的浓度范围内,对应于0.05-20μM,优选0.2-10μM,更优选0.5-5μM的Go6983。
浓度可以在整个第一步中恒定,或者可以在各个步骤中变化,只要可以通过本发明的方法制备视网膜色素上皮细胞即可。
在第一步中,可以在悬浮培养和黏附培养(优选黏附培养)的任何条件下培养多能干细胞。
对要用于黏附培养多能干细胞的培养容器没有特别限制,只要其能够进行细胞的黏附培养即可。其优选为细胞黏附性培养容器。作为细胞黏附性培养容器,可以使用人工处理以提高细胞黏附性的培养容器,并且具体地,可以提及其内部涂布有涂布剂的前述培养容器。优选的涂布剂的实例包括细胞外基质,如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(层粘连蛋白511)、层粘连蛋白α1β1γ1(层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白、Synthemax(康宁公司,Corning Incorporated)、基质胶等,等等,或如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等聚合物等,并且层粘连蛋白511E8是更优选的(WO 2015/053375)。层粘连蛋白511E8可以是商业上可获得的产品(例如,iMatrix-511,Nippi)。
对要用于悬浮培养多能干细胞的培养容器没有特别限制,只要其能够悬浮培养细胞即可。其优选非细胞黏附性的。
在第一步中的培养条件(如培养温度和CO2浓度)可以适当地确定。尽管对培养温度没有特别限制,其为,例如,约30℃至40℃,优选约37℃。CO2浓度是,例如,约1%至约10%,优选约5%。
培养基可以在第一步的中间更换。对培养基更换的方法没有特别限制,并且可以用新鲜培养基更换全部量的初始培养基,或者可以用新鲜培养基更换仅一部分初始培养基。当用新鲜培养基更换一部分初始培养基时,首先计算在第一步的培养基中含有的物质(MEK抑制剂、FGF受体抑制剂等)的最终浓度,之后制备含有在对应于待更换的培养基的比率的浓度下的物质的新鲜培养基并用该培养基更换。在第一步的培养基中含有的物质的最终浓度可以在培养期间变化。
而对用于培养基更换操作的工具没有特别限制,可以提及例如移液器、微量移液器、多通道微量移液器、连续分配器等。例如,当使用96孔板作为培养容器时,可以使用多通道Pipetman。
对第一步的天数没有特别限制,只要其在通过将多能干细胞暴露于上述FGF受体抑制剂和/或MEK抑制剂等制备的细胞维持向视网膜色素上皮细胞的分化潜能的期间内即可。在第一步中的多能干细胞培养不超过30天的期间。该期间可以根据将要使用的多能干细胞的品系(line)等变化。其通常不少于2天,优选不少于3天,更优选不少于4天。在第一步中,多能干细胞更优选培养2-13天或2-6天,进一步优选4-6天。
第一步的天数也可以使用在选自由上述FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种处理的多能干细胞中表达的特定标记物作为指标来确定。具体地,例如,在足以诱导眼形成早期标记物(如PAX6(成对盒蛋白6)、LHX2(LIM同源盒2)和SIX3(SIX同源盒3)等,具体地,眼区转录因子的至少一种基因)的表达的期间内,进行第一步的培养,之后可以进行第二步。也就是说,在第一步中的“不超过30天的期间”的实例包括“足够诱导至少一种眼形成早期标记物(具体地,眼区转录因子)的表达并且不多于30天的期间”和“足够诱导PAX6、LHX2和SIX3中的至少一种的基因表达并且不多于30天的期间”。在这些实施方案中,培养期的上限是,例如,不超过30天的期间,不超过13天的期间,或不超过6天的期间等。
在给定培养条件下的给定培养期是否是“足够诱导至少一种眼形成早期标记物(具体地,眼区转录因子)的表达的期间”或“足够诱导PAX6、LHX2和SIX3中的至少一种的基因表达的期间”可以通过确认在所述条件下培养所述期间之后的细胞群体中,与未处理的对照相比是否可以显著地检测到这些基因中的至少一种的表达来确定。本领域普通技术人员可以通过如Northern blot、RT-PCR、微阵列等方法检测这些基因的表达。
PAX6、LHX2和SIX3是编码在早期发育阶段中的眼区区域中表达的眼区转录因子的基因,并且分别指定为作为人基因的Genbank登记号:NM_001127612、Genbank登记号:NM_004789、Genbank登记号:NM_005413。在其他动物物种如小鼠等中的这些基因可以由本领域普通技术人员容易地指定,并且可以由例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov中所述的基因的碱基序列指定。
也就是说,在本发明的一个实施方案中,提供了包括以下步骤的视网膜色素上皮细胞的制备方法:
(1)第一步,在含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞足以诱导至少一种眼区转录因子的基因表达的期间,和
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
也就是说,在本发明的另一个实施方案中,提供了包括以下步骤的视网膜色素上皮细胞的制备方法:
(1)第一步,在含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞足以诱导PAX6、LHX2和SIX3中的至少一种的基因表达的期间,和
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
当通过黏附培养进行第一步时,也可以通过将细胞与培养容器解离来回收细胞。
对用于将细胞与培养容器解离的方法没有特别限制,只要其通常已知作为用于解离细胞的方法即可。可以使用含有酶(如胰蛋白酶等)的细胞解离溶液。此外,也可以使用商业上可获得的细胞解离溶液[TrypLE select(Life Technologies)等]。解离和回收的细胞通常用PBS(磷酸盐缓冲盐水)和/或在第二步中使用的培养基洗涤,之后在第二步中使用。
第一步中获得的细胞可以传代(维持培养),作为制备视网膜色素上皮细胞的中间产物储存,或进行其它处理,只要维持它们的分化状态和存活状态即可。对用于冷藏在第一步中得到的细胞的方法没有特别限制,只要其通常已知作为用于冷藏细胞的方法即可。例如,可以将在第一步中得到的细胞悬浮在含有冷藏剂(如DMSO或甘油等)的培养基中并且冷藏。此外,也可以使用商业上可获得的细胞冷藏溶液[StemCellBanker(Zenoaq)]。
(2)第二步
以下解释第二步,其在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
本领域普通技术人员可以适当地设定第二步开始时细胞的浓度。其在黏附培养的情况中,例如为1×102细胞/cm2至2×107细胞/cm2,优选1×103细胞/cm2至5×106细胞/cm2,更优选1×104细胞/cm2至1×106细胞/cm2,进一步优选2×104细胞/cm2至2×105细胞/cm2。
在第二步中使用的培养基没有特别限制,只要其能诱导多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞即可。具体地,其可以由上述定义中所述的基础培养基制备。要在第二步中使用的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。为了避免化学上不明确的组分的污染,优选在本发明中使用无血清培养基。为了避免复杂的制备,例如,可以使用补充有适量的商业上可获得的血清代替物(如KSR等)(例如,补充有在0.5%至30%的浓度范围的KSR的Glasgow MEM培养基)的基础培养基的无血清培养基。作为第二步中使用的培养基,可以使用不含用于维持未分化状态的因子的培养基。
在本发明的方法中,Rho信号转导途径抑制剂没有特别限制,只要其能够抑制任何Rho信号转导途径组分(例如GEF(例如Abr)、Rho、ROCK和肌球蛋白轻链)的表达或活性,并且可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任何一种。实例包括针对Rho信号转导途径组分的抗体,抑制编码Rho信号转导途径组分的基因表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制Rho信号转导途径组分的生理活性的低分子量化合物等。作为Rho信号转导途径抑制剂,例如,可以提及ROCK抑制剂或肌球蛋白抑制剂。
ROCK抑制剂的具体实例包括但不限于,Y-27632(反式-4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-4-吡啶基环己烷甲酰胺)、法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、H-1152((S)-(+)-4-甘氨酰基-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂卓)等。Y-27632、法舒地尔和H-1152是已知的ROCK抑制剂,并且可以作为商业上可获得的产品等适当地获得。作为ROCK抑制剂,优选是Y-27632和法舒地尔,更优选是Y-27632。
ROCK抑制剂的浓度可以由本领域普通技术人员根据细胞的种类和细胞的数目来适当地设定。例如,对于Y-27632,其为50nM-200μM,优选为100nM-200μM,更优选为500nM-200μM,进一步优选为1-200μM;对于法舒地尔,其为100nM-200μM,更优选为500nM-200μM,进一步优选为1-200μM。在其它ROCK抑制剂的情况下,可以将其设定在显示与上述相应的ROCK抑制活性的浓度范围内。在整个第二步中,浓度可以是恒定的或逐渐变化的,只要通过本发明的方法可以制备视网膜色素上皮细胞即可。
作为抑制肌球蛋白轻链活性的物质(肌球蛋白抑制剂),可具体提及Blebbistatin((3aS)-3a-羟基-6-甲基-1-苯基-1,2,3,3a-四氢-4H-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮)等。
在本发明的方法中,对细胞凋亡抑制剂没有特别限制,只要其能抑制细胞凋亡即可,并且可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任何一种。细胞凋亡抑制剂的实例包括,但不限于,胱天蛋白酶抑制剂、抑制与细胞凋亡相关的线粒体功能的物质等。
与细胞凋亡相关的线粒体功能的实例包括但不限于线粒体膜的电化学梯度塌陷(electrochemical gradient collapse)、随后的细胞色素C从线粒体释放等。
胱天蛋白酶抑制剂的实例包括针对胱天蛋白酶的抗体,抑制编码胱天蛋白酶基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等),抑制胱天蛋白酶生理活性的低分子量化合物等。具体地,可以作为商业上可获得的产品获得广泛抑制胱天蛋白酶的pan-胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(aka:Z-VAD(OMe)-FMK、Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮、苄氧基羰基-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮)、Emricasan(3-[2-(2-叔丁基-苯基氨基草酰基)-氨基]-丙酰基氨基]-4-氧代-5-(2,3,5,6-四氟-苯氧基)-戊酸)、Z-DEVD-FMK(aka:Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK)、胱天蛋白酶3特异性抑制剂PAC-1(4-(苯基甲基)-[[2-羟基-3-(2-丙烯基)苯基]亚甲基]酰肼、1-哌嗪乙酸)、胱天蛋白酶8特异性抑制剂Z-IETD-FMK(aka:Z-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-FMK)、胱天蛋白酶9特异性抑制剂Z-LEHD-FMK(aka:Z-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-FMK)。作为胱天蛋白酶抑制剂,优选参与进行细胞凋亡的胱天蛋白酶-2、-3、-6、-7、-8、-9、-12的抑制剂,更优选pan-胱天蛋白酶抑制剂,进一步优选Z-VAD-FMK。
本领域普通技术人员可根据细胞的种类和细胞的数目适当地设定胱天蛋白酶抑制剂的浓度。例如,对于Z-VAD-FMK,该浓度为100nM-200μM,优选500nM-100μM,更优选1-50μM。在其它胱天蛋白酶抑制剂的情况下,其可从显示与上述相应的胱天蛋白酶抑制活性的浓度范围设定。
抑制与细胞凋亡相关的线粒体功能的物质的具体实例包括但不限于抑制细胞色素c从线粒体释放的Bcl-2蛋白和Bcl-XL蛋白、防止线粒体膜的电化学梯度塌陷的S-15176(N-[(3,5-二叔丁基-4-羟基-1-苯硫基)]-3-丙基-N’-(2,3,4-三甲氧基苄基)哌嗪)、线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的选择性抑制剂的UCF-101(二氢-5-[[5-(2-硝基苯基)-2-呋喃基]亚甲基]-1,3-二苯基-2-硫代-4,6(1H,5H)-嘧啶二酮)等。
本领域的普通技术人员可以根据细胞的种类、细胞的数目、操作方法等适当地设定适当的细胞凋亡抑制剂的种类和细胞凋亡抑制剂的浓度。例如,本领域的普通技术人员可以通过已知方法(AnnexinV染色法、DNA梯度检测法等)检测细胞凋亡。利用这些细胞凋亡检测方法,可以确定合适的细胞凋亡抑制剂的种类和细胞凋亡抑制剂的浓度。在整个第二步中,浓度可以是恒定的或逐渐变化的,只要通过本发明的方法可以制备视网膜色素上皮细胞即可。
Rho信号转导途径抑制剂还包括能够增强负调节Rho信号转导途径或Rho信号转导途径组分的因子(例如,Rho的GTP酶活化剂(GAP;GTP酶活化蛋白)、Rac(一种低分子量G蛋白)、肌球蛋白轻链磷酸酶等)的活性的那些,并且可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任何一种。
在本发明的一个实施方案中,第二步的培养基是不含外源Nodal信号转导途径抑制剂或Wnt信号转导途径抑制剂的培养基。
在本说明书中,对Nodal信号转导途径抑制剂没有特别限制,只要其能抑制由Nodal介导的信号转导即可,并且可以是蛋白质、核酸和低分子量化合物中的任何一种。由Nodal介导的信号通过Nodal受体转导。Nodal受体作为TYPE I受体(ALK(活化素受体样激酶)-4、ALK-5、ALK-7)和TYPE II受体(ActRII)的异二聚体存在。Nodal信号转导途径抑制剂的实例包括但不限于直接作用于Nodal或Nodal受体的物质(抗Nodal抗体、抗Nodal受体抗体等),抑制编码Nodal或Nodal受体的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制Nodal受体与Nodal的结合的物质(Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、可溶性Nodal受体等),抑制藉由Nodal受体的信号转导引起的生理活性的物质[低分子量化合物,例如TGFβ抑制剂等,例如通过ATP竞争抑制TYPE I受体的激酶活性的SB-431542(SB431542)(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)等,等等]等等。作为典型的Nodal信号抑制剂,例如,可以提及SB-431542。
在本说明书中,Wnt信号转导途径抑制剂没有特别限定,只要能够抑制Wnt介导的信号转导即可,可以是蛋白质、核酸、低分子化合物等中的任一种。Wnt介导的信号通过以Frizzled(Fz)和LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6)的异源二聚体存在的Wnt受体转导。Wnt信号转导途径抑制剂的实例包括但不限于直接作用于Wnt或Wnt受体的物质(抗Wnt抗体、抗Wnt受体抗体等),抑制编码Wnt或Wnt受体的基因表达的物质(例如,反义寡核苷酸、siRNA等),抑制Wnt受体与Wnt结合的物质(可溶性Wnt受体、显性负性Wnt受体等、Wnt拮抗剂、Dkk1、Cerberus蛋白等),抑制藉由Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质[低分子量化合物,例如酪蛋白激酶I抑制剂CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺)和D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺),通过抑制Axin的代谢转换稳定β-连环蛋白破坏复合物的IWR-1-内(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺),和灭活作为膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)的Porcupine(Porcn)并抑制Wnt蛋白等的棕榈酰化的IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代乙酰胺)等]等。CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等是已知的Wnt信号抑制剂。典型的Wnt信号抑制剂是CKI-7。
在本发明的一个实施方案中,第二步中的培养基不含有影响多能干细胞的分化诱导,特别是多能干细胞向外胚层[例如,神经细胞、视网膜色素上皮细胞或其祖细胞等]、中胚层或内胚层细胞的分化诱导的外源性物质,优选促进分化诱导,该物质不是Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂。对该物质没有特别限制,只要其影响多能干细胞的分化诱导,优选促进分化诱导。该物质的实例包括包含在以下物质组中的那些。
在本发明的一个实施方案中,第二步中的培养基不含一种或更多种选自影响多能干细胞分化诱导,特别是多能干细胞向外胚层[例如,神经细胞、视网膜色素上皮细胞或其祖细胞等]、中胚层或内胚层细胞的分化诱导的物质的组的外源性物质,优选其促进分化诱导的外源性物质。
更具体地说,该物质的组中包括的物质的实例包括,除了上述Nodal信号转导途径抑制剂和Wnt信号转导途径抑制剂外,FGF受体抑制剂(PD173074、SU5402等)、MEK抑制剂(PD0325901、PD184352、PD98059、U0126、MEK162、SL327、TAK-733、AZD-8330等)、BMP受体抑制剂(LDN193189、Dorsomorphin等)、Sonic hedgehog信号转导途径激动剂(Purmorphamine、SAG、shh等)、PKC抑制剂(Go6983等)、BMP信号转导途径激动剂(BMP2、BMP4、BMP7、GDF7等)、活化素信号转导途径激动剂(活化素A、活化素B等)、活化素信号转导途径抑制剂(卵泡抑素等)、TGFβ信号转导途径激动剂(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等)、TGFβ信号转导途径抑制剂(Lefty、SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等)、Wnt信号转导途径激动剂[Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt8、R-spondin1、GSK3β抑制剂(CHIR99021、SB216763等)]、PPA受体信号转导途径激动剂(曲格列酮等)、PPA受体信号转导途径抑制剂(环格列酮等)、sonichedgehog信号转导途径抑制剂(Vismodegib、Cyclopamine、LDE225等)、Notch信号转导途径抑制剂(DAPT、IMR-1等)、视黄酸受体激动剂(视黄酸、Isotretinoin、TTNPB、Am580等)、视黄酸受体抑制剂(BMS493、AGS193109等)、趋化因子受体抑制剂(AMD3100Octahhydrochloride、SCH527123等)、LPA受体抑制剂(Ki16425)、PDK1抑制剂(PS48等)、RasGAP抑制剂(SC-1等)、Src抑制剂(A419259、达沙替尼、Sarataniib、Bostinib、WH-4-023等)、磷酸二酯酶抑制剂(EHNA盐酸盐等)、腺苷酸环化酶活化剂(Forskolin等)、PI3K抑制剂(LY294002、BKM120、Pictilisib等)、AMPK活化剂(AICAR、A-769662等)、腺苷受体抑制剂(逆转素(Reversine)、伊曲茶碱(Istratefylline)等)、组蛋白乙酰化转移酶抑制剂(C646、MG149等)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(曲古抑菌素A、丙戊酸、丁酸钠等)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(BIX01294、EPZ5676、GSK343等)、组蛋白脱甲基酶抑制剂(GSK-J4盐酸盐、SP2509等)、DNA甲基化抑制剂(阿扎胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷等)和DNA甲基转移酶抑制剂(RG108、地西他滨等)。
此外,在本发明的一个实施方案中,第二步中的培养基不含抑制诱导分化成外胚层细胞(例如,神经细胞、视网膜色素上皮细胞或其前体等),更具体的,抑制诱导分化成视网膜色素上皮细胞的物质。
第二步的培养可以在悬浮培养和黏附培养的任何条件下进行,优选黏附培养。
第二步中的黏附培养中使用的培养容器没有特别的限制,只要是可以进行细胞的黏附培养即可,优选为细胞黏附性培养容器。作为细胞黏附性培养容器,可以使用人工处理以提高细胞黏附性的培养容器,并且具体地,可以提及其内部涂布有涂布剂的前述培养容器。优选的涂布剂的实例包括细胞外基质,如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(层粘连蛋白511)、层粘连蛋白α1β1γ1(层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白、Synthemax(康宁公司,Corning Incorporated)、基质胶等细胞外基质,或者如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等聚合物等。更优选层粘连蛋白511E8(WO2015/053375)。作为层粘连蛋白511E8,可以使用商业上可获得的产品(例如,iMatrix-511、Nippi)。
对在第二步用于悬浮培养的培养容器没有特别限制,只要其能够悬浮培养细胞即可。其优选是非细胞黏附性的。
在第二步中的培养条件(如培养温度、CO2浓度等)可以适当地确定。培养温度是,例如,约30℃至约40℃,优选约37℃。CO2浓度是,例如,约1%至约10%,优选约5%。
培养基可以在第二步的中间酌情更换。对培养基更换的方法没有特别限制,并且可以用新鲜培养基更换全部量的初始培养基,或者可以用新鲜培养基更换仅一部分初始培养基。当用新鲜培养基更换一部分初始培养基时,首先计算在第二步的培养基中含有的物质(Rho信号转导途径抑制剂、细胞凋亡抑制剂、KSR等)的最终浓度,之后可以制备含有在对应于待更换的培养基的比率的浓度下的物质的新鲜培养基并且用该培养基更换。在第二步的培养基中含有的物质的最终浓度可以在培养期间变化。
而对用于培养基更换操作的工具没有特别限制,例如可以提及移液器、微量移液器、多通道微量移液器、连续分配器等。例如,当使用96孔板作为培养容器时,可以使用多通道移液管。
对第二步的培养期没有特别限制,只要其是能够诱导目的视网膜色素上皮细胞的期间即可。作为这样的培养期的实例,通常可以在从第二步开始计算的第2-40天时制备视网膜色素上皮细胞。
本领域普通技术人员可以基于细胞标记物(RPE65(视网膜色素上皮细胞)、Mitf(视网膜色素上皮细胞)BEST1(视网膜色素上皮细胞)、CRALBP(视网膜色素上皮细胞)等)的表达、黑色素粒(褐黑色)的存在、细胞间紧密结合、特征多边形或鹅卵石样细胞形态等来确认视网膜色素上皮细胞的生成,并且也可以通过确认它们来确定培养期。
在第二步完成之后,也可以使用得到的RPE细胞。但是,优选将培养基更换为用于视网膜色素上皮细胞的维持培养基(在下文中有时表示为RPE维持培养基)后进一步对其培养。作为结果,可以更清楚地观察到黑色素染料沉积的细胞群体和黏附至基底膜的多边形扁平细胞群体。对在RPE维持培养基中的培养没有限制,只要可以形成视网膜色素上皮细胞的集落即可。例如,在以不少于每3天1次的频率更换全部量的培养基的同时,将细胞进一步培养约5-20天。
也就是说,本发明的制备方法可以在第二步完成后,包含进一步培养视网膜色素上皮细胞的步骤。例如,视网膜色素上皮细胞可以通过WO2015/053375中描述的方法培养和扩增。根据WO2015/053375中描述的培养方法,可以将培养细胞中所含的诱导分化不充分的细胞等通过选择除去,并且可以相对减少视网膜色素上皮细胞以外的副产物。因此,培养步骤也可以是视网膜色素上皮细胞的扩增步骤和纯化步骤。因此,作为本发明的RPE细胞的制备方法的一个实施方案,可以提及下述方法:
(1)第一步,在含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞不超过30天的期间,
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞,和
(3)第三步,培养第二步中获得的视网膜色素上皮细胞。
另外,作为本发明的RPE细胞的制备方法的一个实施方式,可以提及下述方法:
(1)第一步,在含有选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞足以诱导PAX6、LHX2和SIX3中的至少一种的基因表达的期间,
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞,和
(3)第三步,培养第二步中获得的视网膜色素上皮细胞。
作为用于视网膜色素上皮细胞的维持培养基,例如,可以使用在IOVS,2004年3月,第45卷,第3期,Masatoshi Haruta等,IOVS,2011年11月,第52卷,第12期,Okamoto和Takahashi,J.Cell Science122(17),Fumitaka Osakada等,IOVS,2008年2月,第49卷,第2期,Gamm等中描述的那些,其由基础培养基、血清和/或血清代替物和其他组分构成。
对基础培养基没有特别限制,只要其为如在上述定义部分中描述的即可。作为血清,可以使用来源于哺乳动物如牛、人等的血清。在本发明中,优选使用血清代替物,并且从目的细胞的质量管理方面来看,作为用于神经细胞的血清代替物的B27是特别优选的。其他组分的实例包括L-谷氨酰胺、青霉素钠、硫酸链霉素等。
可以在第二步完成之后通过浓缩或纯化操作得到高纯的视网膜色素上皮细胞。对浓缩或纯化方法没有特别限制,只要其通常已知作为浓缩/纯化细胞的方法即可,并且例如,可以使用如过滤(例如,WO2015/053376)、离心、灌注分离、流式细胞仪分离、通过抗体固定化的载体的捕获分离(trap separation)等方法。
当在第二步中通过悬浮培养制备视网膜色素上皮细胞时,视网膜色素上皮细胞可以作为单细胞回收并且可以在制备之后作为悬浮液使用。
当在第二步中通过黏附培养制备视网膜色素上皮细胞时,视网膜色素上皮细胞可以彼此黏附以形成片状结构。因此,可以制备可移植至患者的视网膜色素上皮细胞的片。视网膜色素上皮细胞的片作为用于治疗视网膜疾病的细胞移植治疗药物使用的细胞群体特别有用。也可以将通过上述方法通过黏附培养制备的视网膜色素上皮细胞解离,回收作为独立单细胞的视网膜色素上皮细胞,并且将它们在生理水性溶剂(盐水、缓冲液、无血清培养基等)中悬浮以得到悬浮液。
3.毒性、功效评价方法
通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞,可用作正常或疾病模型细胞,用于视网膜疾病的治疗药和如糖尿痫等其它并发症疾病的治疗药、或其预防药的筛选和功效评价、化学物质等的安全性试验、胁迫试验、毒性试验、副作用试验、感染/污染试验。另一方面,它们也可以用于对视网膜细胞独特的光毒性、视网膜兴奋毒性等的毒性研究、毒性试验等。其评价方法包括刺激和毒性试验如细胞凋亡评价等,以及用于评价对从祖细胞向视网膜色素上皮细胞和光感受器的正常分化的影响的试验(各种基因标记物的RT-PCR、细胞因子藉由ELISA的蛋白质表达的分析、吞噬能力试验等)、光毒性等的毒性试验、关于视觉功能的视网膜电势和经上皮阻抗、由自身免疫反应导致的细胞毒性试验等。作为用于这些试验的细胞材料,不仅可以使用视网膜色素上皮细胞,而且还可以使用其祖细胞,并且例如,可以提供在其上细胞通过接种而黏附的平板、细胞悬浮液、其片或坯块(compact)。可以使用它们作为人和动物试验的外推试验。
4.药物组合物
本发明提供药物组合物,其含有有效量的通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞。
该药物组合物含有有效量的通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞和药学上可接受载体。
作为药学上可接受载体,可以使用生理水性溶剂(盐水、缓冲液、无血清培养基等)。在需要的情况下,在移植治疗中,含有待移植的组织或细胞的药物可以含有常规使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
本发明的药物组合物可以作为悬浮液通过使通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞悬浮在适当的生理水性溶剂中而制备。在需要的情况下,组合物可以添加有冷藏剂,用液氮等冷藏,在使用时解冻,用缓冲液洗涤,并且用于移植治疗。
也可以用镊子等以适当尺寸切割通过本发明的制备方法获得的视网膜色素上皮细胞,以得到片制剂。
通过本发明的制备方法得到的细胞也可以在第二步中经历黏附培养以用于分化诱导,得到片形式的细胞,以提供片制剂。
本发明的药物组合物可用作用于基于视网膜色素上皮细胞障碍(或由其导致)的疾病的治疗药物。
5.用于视网膜疾病的治疗药物和治疗方法
通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞(包括经历上述浓缩和扩增操作等的视网膜色素上皮细胞)可以用作以悬浮液或片形式移植至活体生物以用于治疗视网膜疾病的细胞移植治疗药物。本发明还提供治疗方法,其包含向患者施用治疗药物。在这里的视网膜疾病是与视网膜相关的眼科疾病并且还包括伴随其他疾病如糖尿病等的并发症。在本发明中的视网膜疾病包括,例如基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病,如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或视网膜脱落等。也就是说,通过本发明的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞可以用于补充患者中视网膜色素上皮细胞的受损部位。
在移植治疗中,由于组织相容性抗原的差异的排斥通常成为问题。该问题可以通过使用从与受体免疫学相容(例如,部分或全部HLA型和MHC型相容)的其他人的体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导的多能干细胞)、或由移植受体的体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导的多能干细胞)来解决。
也就是说,在优选的实施方案中,作为在本发明的方法中的多能干细胞,同种异体视网膜色素上皮细胞或含有其的组织由多能干细胞制备,所述多能干细胞由免疫性与受体的免疫性相容的其他人的体细胞建立,并且将它们移植至受体。备选地,使用由受体的体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导的多能干细胞)来制备视网膜色素上皮细胞,其对于受体是免疫自身的,或者含有其的组织,并且将其移植到受体。
本发明中使用的物质(特别是低分子量化合物等)包括该物质的水合物、盐等。
本说明书中引用的所有参考文献,包括出版物、专利文献、专利申请的描述等,在此通过引用将其全部内容并入本文,达到它们在本文公开的程度。
下面通过参考例详细解释本发明,但不应将所述实施例解释为限制于此。
在以下实施例中,使用了来自京都大学从Cellular Technology Limited的建立的人外周血来源的单核细胞的iPS细胞(1231A3,QHJI01)。
实施例1:第二步中ROCK抑制剂Y-27632的作用的研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月8日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔3.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将FGF受体抑制剂PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基中(第一步开始),每隔一天用添加了FGF受体抑制剂的AK03N培养基更换培养基,并将细胞暴露于FGF受体抑制剂总共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以2.0×105细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第一天,使用添加Y-27632(终浓度10μM)的AK03N培养基或使用没有添加Y-27632的AK03N培养基作为比较对象。培养2-13天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)]或使用只添加10%KSR而不添加Y-27632的基础培养基作为比较对象。培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;且从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养第42天观察培养板。结果,当在第二步中加入Y-27632时,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图1:10μM Y-27632)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入Y-27632时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图1:未处理)。
实施例2:第二步中Y-27632浓度的研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(1231A3系和QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔3.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将FGF受体抑制剂PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)或MEK抑制剂PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03N培养基(第一步开始),每隔一天用添加了FGF受体抑制剂或MEK抑制剂的AK03N培养基更换该培养基,并将细胞暴露于FGF受体抑制剂或MEK抑制剂总共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLEselect处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以2.0×105细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在1231A3系的情况下,在培养的第一天,使用添加Y-27632至终浓度为1μM、3μM、10μM、30μM或100μM的AK03N培养基,或作为比较对象,使用没有添加Y-27632的AK03N培养基。培养2-13天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度1μM、3μM、10μM、30μM或100μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)]或使用只添加了10%KSR而不添加Y-27632的基础培养基作为比较对象。培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;且从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。在QHJI01系的情况下,培养1-12天,使用添加10%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度1μM、3μM、10μM、30μM或100μM)的基础培养基或使用仅添加10%KSR而不添加Y-27632的基础培养基作为比较对象。培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基。每天更换全部量的培养基。
在1231A3系的情况下,在培养第48天观察培养板。结果,在第一步中暴露于FGF受体抑制剂或MEK抑制剂的两种情况下,在不低于10μM的Y-27632浓度下,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图2-1,1231A3:10μM、30μM、100μM Y-27632)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入Y-27632时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图2-1,1231A3:未处理)。在QHJI01系的情况下,在培养的第50天观察培养平板。结果,在第一步中暴露于FGF受体抑制剂或MEK抑制剂的两种情况下,在不低于3μM的Y-27632浓度下,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图2-2,QHJI01:3μM、10μM、30μM、100μM Y-27632)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入Y-27632时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图2-2,QHJI01:未处理)。
实施例3:在第二步中通过用低浓度Y-27632处理铺板细胞的数目的研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔3.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(WakoPure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将FGF受体抑制剂PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)或MEK抑制剂PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03N培养基(第一步开始),每隔一天用添加FGF受体抑制剂或MEK抑制剂的AK03N培养基更换培养基,并将细胞暴露于FGF受体抑制剂或MEK抑制剂共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以2.0×106个细胞将其接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,每孔为铺板细胞总数的10倍(2.0×105),并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。培养1-12天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mML-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)]或使用只添加10%KSR而不添加Y-27632的基础培养基作为比较对象。培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;且从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
在培养第50天观察培养板。结果,在第一步中暴露于FGF受体抑制剂或MEK抑制剂的两种情况下,通过用低浓度(1μM)Y-27632处理,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图3:1μM Y-27632)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入Y-27632时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图3:未处理)。
实施例4:第二步中Y-27632的暴露期间的研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将MEK抑制剂PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03N培养基中(第一步开始),每隔一天用添加了MEK抑制剂的AK03N培养基更换培养基,并且将细胞暴露于MEK抑制剂总共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以0.8×105细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2的12孔培养板中,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。培养的第1天到第30天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mMMEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)],并且将细胞从培养的第1天开始暴露于Y-27632(终浓度10μM)3天、6天、9天、12天、16天或20天。从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mML-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养第49天观察培养板。结果,通过暴露于Y-27632不少于6天的期间,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图4:6天、9天、12天、16天,20天)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,在第二步中暴露于Y-276323天的期间内,仅确认了轻微的黑褐色细胞群的出现(图4:3天)。
实施例5:第二步中ROCK抑制剂法舒地尔的作用研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,在无饲养细胞条件下进行培养以维持人iPS细胞(,1231A3系和QHJI01系)的未分化状态。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔3.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将FGF受体抑制剂PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基中(第一步开始),每隔一天用添加了FGF受体抑制剂的AK03N培养基更换培养基,并将细胞暴露于FGF受体抑制剂总共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,在1231A3系的情况下以2.0×106细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,其为每孔铺板细胞总数(2.0×105)的10倍,在QHJI01系的情况下,以1.0×106细胞/孔接种,其为每孔铺板细胞总数(2.0×105)的5倍,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在1231A3系的情况下,在培养的第一天,使用添加了终浓度为10μM、30μM或100μM的ROCK抑制剂法舒地尔(Wako PureChemical Industries,Ltd.)的AK03N培养基,或者使用没有添加法舒地尔的AK03N培养基作为比较对象。培养2-13天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、法舒地尔(终浓度10μM、30μM或100μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)]或使用只添加10%KSR而不添加法舒地尔的基础培养基作为比较对象。培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;且从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。在QHJI01系的情况下,培养1-12天,使用添加10%KSR(Life Technologies)、法舒地尔(终浓度10μM)的基础培养基或使用仅添加10%KSR而不添加法舒地尔的基础培养基作为比较对象。培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基。每天更换全部量的培养基。
在1231A3系的情况下,在培养第41天观察培养板。结果,在法舒地尔浓度不低于10μM时,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图5,1231A3:10μM、30μM、100μM法舒地尔)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入法舒地尔时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图5,1231A3:未处理)。在QHJI01系的情况下,在培养第48天观察培养平板。结果,当在第二步中加入法舒地尔时,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图5,QHJI01:10μM法舒地尔)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入法舒地尔时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图5,QHJI01:未处理)。
实施例6:第二步中胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK的作用研究
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mMEDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔3.0×104个细胞,在含有ROCK抑制剂Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)的AK03N培养基中在37℃,5%CO2条件下培养。在接种的第二天,将MEK抑制剂PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03N培养基中(第一步开始),每隔一天用添加了MEK抑制剂的AK03N培养基更换培养基,并且将细胞暴露于MEK抑制剂总共6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以2.0×106个细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,其为每孔铺板细胞总数(2.0×105)的10倍,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。培养1-12天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度20μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)]或使用只添加了10%KSR而不添加Z-VAD-FMK的基础培养基作为比较对象。培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
在培养的第65天或第67天观察培养板。结果,当在第二步中加入Z-VAD-FMK时,可以在视觉上确认黑褐色细胞群的出现(图6:20μM Z-VAD-FMK)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态。另一方面,当在第二步中没有加入Z-VAD-FMK时,未能确认到黑褐色细胞群的出现(图6:未处理)。
(参考例和参考比较例)
在以下的参考例和参考比较例中,使用了源自人真皮成纤维细胞的iPS细胞(201B7,京都大学)和源自由京都大学从Cellular Technology Limited的建立的人外周血来源的单核细胞的iPS细胞(1231A3、Ff-I01、QHJI01)。
参考例1:包括MEK抑制剂处理步骤和使用人iPS细胞的视网膜色素上皮细胞的高
效制备
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)或Essential 8培养基(Life Technologies)。
包括MEK抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(LifeTechnologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)]的AK03培养基或Essential 8培养基中培养。接种第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)以1μM的终浓度加入AK03培养基或以0.03μM的终浓度加入Essential 8培养基(第一步开始),并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,当使用AK03培养基时,2.0×105个细胞/孔,当使用Essential 8培养基时,5×105个细胞/孔,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第一天,使用AK03培养基或Essential 8培养基,其中添加Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM),以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM);培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14至30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养38-42天观察培养板。结果,当使用AK03培养基和Essential 8培养基的两种培养基时,在201B7系和1231A3系的两种系中,可以在宽的区域上确认出现了黑褐色细胞群(图7)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图8)。
参考比较例1:不包括MEK抑制剂处理步骤和使用人iPS细胞的视网膜色素上皮细
胞的制各
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)或Essential 8培养基(Life Technologies)。
不包括MEK抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单细胞,当使用AK03培养基时以2.0×105个细胞/孔接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,当使用Essential 8时以5.0×105细胞/孔接种,在37℃,5%CO2条件下培养。在培养的第一天,使用AK03培养基或Essential 8培养基,其中添加作为ROCK抑制剂的Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd3(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd3(终浓度5μM)以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM);培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养38-42天观察培养板。结果,仅有少数细胞可以被确认表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图9)。
参考例2:包括FGF受体抑制剂处理步骤和使用人iPS细胞的视网膜色素上皮细胞
的高效制各
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)或Essential 8培养基(Life Technologies)。
包括FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)]的AK03培养基或Essential 8培养基中培养。接种的第二天,将作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)以终浓度100nM加入AK03培养基或Essential 8中(第一步开始),并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。在一个实施方案中,为了研究FGF受体抑制剂在不含用于维持未分化状态的因子(bFGF)的培养基中的作用,使用了未添加bFGF的StemSurehPSC MediumΔ(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(下文中称为StemSurehPSC MediumΔw/o bFGF)。也就是说,将作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)以终浓度100nM加入StemSure hPSC MediumΔw/o bFGF(第一步开始),并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,当使用AK03培养基或StemSure hPSC MediumΔw/o bFGF时,以2.0×105个细胞/孔接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,当使用Essential 8培养基时,以5.0×105个细胞/孔接种,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第一天,使用AK03培养基、Essential 8培养基或StemSure hPSC MediumΔw/o bFGF,其中添加作为ROCK抑制剂的Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM),以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM);培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养38-42天观察培养板。结果,当使用AK03培养基、Essential 8或StemSurehPSC MediumΔw/o bFGF时,可以在201B7系和/或1231A3系中在宽的区域里确认黑褐色细胞群的出现(图10)。通过显微镜观察,细胞表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图11)。
参考比较例2:不包括FGF受体抑制剂处理步骤和使用人iPS细胞的视网膜色素上
皮细胞的制备
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系和1231A3系)的未分化状态的培养。使用AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)或Essential 8培养基(Life Technologies)。
不包括FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞或在StemSurehPSC MediumΔw/o bFGF(WakoPure Chemical Industries,Ltd.)中培养6天的iPS细胞用0.5×TrypLE select处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,当使用AK03培养基或StemSure hPSC MediumΔw/obFGF时以2.0×105细胞/孔接种在涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,当使用Essential 8时以5.0×105细胞/孔接种,并在37℃,5%CO2条件下培养。在培养的第一天,使用AK03培养基、Essential 8培养基或StemSure hPSC MediumΔw/o bFGF,添加作为ROCK抑制剂的Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM);培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养38-42天观察培养板。结果,仅有少数细胞可以被确认表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图12)。
参考例3:包括MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂和各种抑制剂、信号转导途径抑制
剂或信号转导途径激动剂的组合处理步骤和使用人iPS细胞的视网膜色素上皮细胞的高效
制各
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)。
包括MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂和各种抑制剂、信号转导途径抑制剂或信号转导途径激动剂的组合处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03培养基中培养。在细胞接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)、作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)、作为BMP受体抑制剂的LDN193189(STEMGENT)(终浓度100nM)、作为Shh信号转导途径激动剂的SAG(Enzo Life Sciences)(终浓度30nM)以及作为PKC抑制剂的Go6983(SIGMA)(终浓度2μM)以图13所示的组合加入培养基中(第一步开始),并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第一天,使用添加了作为ROCK抑制剂的Y-27632(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)以及作为Wnt信号转导径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的AK03培养基;培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0,1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,该实验也在含有MEK抑制剂处理步骤的参考例1、不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1、含有FGF受体抑制剂处理步骤的参考例2和不包括FGF受体抑制剂处理步骤的参考比较例2的条件下进行。
培养38-47天观察培养板。结果,在参考比较例1和参考比较例2的条件下,仅发现少数细胞显示RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图13,未处理)。相反,在含有MEK抑制剂处理步骤的参考例1的制备条件、含有FGF受体抑制剂处理步骤的参考例2的生产条件、以及含有MEK抑制剂和/或FGF受体抑制剂与各种抑制剂、信号转导途径抑制剂或信号转导途径激动剂的组合处理步骤的制备条件下,可以确认表现出RPE细胞的典型特征如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的RPE细胞的出现(图13)。通过视觉观察判断RPE细胞在整个孔中的比例,并根据该比例进行0-5的6级分类(图14A)。在图14B和14C所示的所有化合物组合处理条件下,可以确认到比未处理条件下更高比例的RPE细胞出现(图14B和14C)。
参考例4:包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤和使用人iPS细胞Ff-I01、
QHJI01的视网膜色素上皮细胞的高效制备
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,在无饲养细胞条件下进行培养以维持人iPS细胞(Ff-I01系和QHJI01系)的未分化状态。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)或作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)(终浓度5μM),和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养第9天到第12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mML-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1(条件是将AK03培养基变为AK03N培养基)和不包括FGF受体抑制剂处理步骤的参考比较例2(条件是将AK03培养基变为AK03N培养基)的条件下也进行了实验。
培养第43天观察培养板。结果,在参考比较例1和参考比较例2的条件下,几乎没有发现表现出RPE细胞的典型特征如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞(图15,未处理)。另一方面,当暴露于MEK抑制剂和FGF受体抑制剂时,在Ff-I01系和QHJI01系这两系中,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图15,MEKi,FGFRi)。
参考例5:考虑MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤中每种抑制剂的暴露于天数
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBs(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,2天后、3天后、4天后、5天后或6天后,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)或作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天、5天、4天、3天、2天或1天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM),和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(LifeTechnologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养第48天观察培养板。结果,在用MEK抑制剂和FGF受体抑制剂的两种处理中,通过暴露不少于2天的褐黑色细胞群增加,并且随着暴露于天数增加直到暴露至6天,在整个孔中显色的细胞比例增加(图16)。特别是,在暴露于4天-6天中观察到黑褐色细胞群的显著增加。
参考例6:MEK抑制剂处理步骤中MEK抑制剂暴露的期间的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)。
包括MEK抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(LifeTechnologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)]的AK03培养基中培养。在接种的第二天,4天后或6天后,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天、3天或1天(第一步完成)。此外,将暴露于MEK抑制剂6天的细胞用0.5×TrypLEselect处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔0.8×104个细胞,并且在含有Y-27632(终浓度10μM)和PD0325901(终浓度1μM)的AK03培养基中,在37℃,5%CO2条件下培养7天,从而使细胞暴露于MEK抑制剂13天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×106个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第1天,使用添加了Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)(终浓度5μM)以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的AK03培养基;培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(LifeTechnologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,RPE细胞也在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件下制备。
培养第37天观察培养板。结果,在参考比较例1和暴露于MEK抑制剂一天的条件下,几乎没有发现表现出RPE细胞的典型特征如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞(图17,未处理,MEKi 1天)。另一方面,通过暴露于MEK抑制剂3天和6天,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图17,MEKi 3天、6天),并且通过暴露于13天,也类似地确认有色细胞群的充分出现(图17,MEKi 13天)。
参考例7:MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤完成时的基因表达
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(Ff-I01系和QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。在接种的次日或4天后,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)或作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天或3天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,将除了要转移到第二步的细胞以外的细胞用于RNA提取作为用于微阵列的样品,将要转移到第二步的细胞以2.0×105细胞/孔接种到涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第1天,使用添加了Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)以及作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的AK03培养基,或添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(Wako PureChemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)和CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)]。当AK03培养基(含有Y-27632、SB-431542和CKI-7)在培养第1天使用时,培养2-5天使用添加了20%KSR(LifeTechnologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)和CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mMMEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(LifeTechnologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。当在培养的第1天使用基础培养基(含有20%KSR、Y-27632、SB-431542和CKI-7)时,培养的2-4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养5-8天,使用添加15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基。每天更换全部量的培养基。同时,在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件下(将AK03培养基变为AK03N培养基),也进行了用于微阵列的样品的回收和RPE细胞的制备。
使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取RNA,用GeneChip Human Genome U133Plus2.0 Array (Affymetrix)进行微阵列分析。为了进行微阵列分析,使用通过KURABOINDUSTRIES LTD.的委托分析。
基于在培养的第43天观察到的培养板的图像和根据图14A,通过视觉观察确定的RPE细胞在整个孔中的比例的结果(根据RPE细胞的比例以0-5的6级评分)和在第一步完成时在眼形成早期标记物PAX6、LHX2、SIX3的表达值(信号)和标志(检测),其是微阵列分析结果,总结在表中(图18)。标志表示表达值的可信度,P表示高可信度,A表示低可信度。从这些结果中,发现了在第一步完成时,RPE细胞在整个孔中的比例与PAX6、LHX2和SIX3的表达值之间的相关性。因此,发现到第二步的转变时间可以基于这些基因的表达来确定。
参考例8:在MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤中各种抑制剂浓度的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的终浓度为0.25μM、0.5μM、1μM、2μM或4μM的PD0325901(SIGMA)和作为FGF受体抑制剂的终浓度为25nM、50nM、100nM、200nM或400nM的PD173074(SIGMA)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,以2.0×105细胞/孔接种到涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,并在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养的第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(LifeTechnologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,也在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件(将AK03培养基变为AK03N培养基)和不含FGF受体抑制剂处理步骤的参考比较例2的条件(将AK03培养基变为AK03N培养基)下进行RPE细胞的制备。
在培养的第36天和第49天观察培养板。结果,在参考比较例1和参考比较例2的条件下,几乎没有发现表现出RPE细胞的典型特征如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞(图19,未处理)。另一方面,在所有MEK抑制剂浓度(0.25-4μM)和FGF受体抑制剂浓度(25-400nM)研究下,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图19,MEKi:0.25-4μM,FGFRi:25-400nM)。
参考例9:第一步到第二步的转换中的接种细胞数的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,且在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd3]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)或作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔0.2、0.4、0.6、1.0、2.0或4.0×105个细胞(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0或4.0×105细胞/cm2),且在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM),和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养第49天观察培养板。结果,在所有研究的接种细胞数(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0或4.0×104细胞/cm2)下,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图20)。
参考例10:第一步中MEK抑制剂PD184352、U0126、TAK-733、AZD-8330的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(LifeTechnologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)、PD184352(SIGMA)(终浓度1.5μM、3μM、6μM)、U0126(SIGMA)(终浓度5μM、10μM)、TAK-733(Selleck)(终浓度0.3μM)或AZD-8330(Selleck)(终浓度0.3μM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2×105个细胞,且在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)(终浓度5μM),和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,也在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件下(将AK03培养基变为AK03N培养基)制备RPE细胞。
在培养的第49天和第50天观察培养板。结果,在参考比较例1的条件下,几乎没有发现表现出RPE细胞的典型特征例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞(图21,未处理)。另一方面,在所有研究的MEK抑制剂(PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733、AZD-8330)中,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图21,PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733、AZD-8330)。
参考例11:第一步中FGF受体抑制剂SU5402的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系和1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。接种的第二天,将作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)或SU5402(SIGMA)(终浓度5μM、10μM、20μM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,且在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM),和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,也在不包括FGF受体抑制剂处理步骤的参考比较例2的条件下(将AK03培养基变为AK03N培养基)制备RPE细胞。
培养第49天观察培养板。结果,在参考比较例2的条件下,几乎没有发现表现出RPE细胞的典型特征例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞(图22,未处理)。另一方面,在所有研究的FGF受体抑制剂(PD173074、SU5402)中,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图22,PD173074、SU5402)。
参考例12:第二步中单独暴露于Nodal信号转导途径抑制剂和Wnt信号转导途径抑
制剂的分化诱导作用的考虑
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(QHJI01系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLE select(LifeTechnologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd3]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)加入AK03培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的12孔培养板中,每孔0.8×105个细胞,并且在37℃、5%CO2条件下培养(第二步开始)。在第二步中,使用下列3种培养基。培养第1至第12天,使用添加了10%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(终浓度5μM)和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mMMEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Life Technologies)](图23,NODALi+WNTi),添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)(图23,NODALi)的基础培养基,或者使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)和CKI-7(终浓度3μM)(图23,WNTi)。培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;且从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。
培养第43天观察培养板。结果,在Nodal信号转导途径抑制剂和Wnt信号转导途径抑制剂(NODALi+WNTi)两种处理条件下以及在Nodal信号转导途径抑制剂(NODALi)的单一试剂处理条件下,可以确认显现相同水平的RPE细胞典型特征如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态的细胞的出现(图23,NODALi+WNTi,NODALi)。通过单一试剂处理Wnt信号转导途径抑制剂(WNTi),整个孔中的黑褐色区域减少;然而,可以确认出现了足够数量的细胞展现RPE细胞的典型特征(图23,WNTi)。从上述结果可以确认,在第二步中Nodal信号转导途径抑制剂或Wnt信号转导途径抑制剂的存在都是足够的。
参考例13:黑褐色细胞在整个孔中的面积比与视网膜色素上皮细胞标记基因表达
的关系
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(201B7系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03培养基)。
包括MEK抑制剂和BMP受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔1.2×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03培养基中培养。当MEK抑制剂要暴露6天,BMP受体抑制剂要暴露1天时,作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)在接种的第二天(第一步开始)加入AK03培养基,且作为BMP受体抑制剂的LDN193189(STEMGENT)(终浓度100nM)在接种后6天加入AK03培养基,由此使细胞分别暴露于MEK抑制剂和BMP受体抑制剂6天和1天(第一步完成)。当MEK抑制剂和BMP受体抑制剂要暴露6天时,PD0325901(终浓度1μM)和LDN193189(终浓度100nM)在接种的第二天(第一步开始)加入AK03培养基,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种在涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6-孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。在培养的第一天,使用AK03培养基,其中添加Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd3(终浓度5μM),以及CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM);培养2-5天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养6-9天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养10-13天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养14至30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,也在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件下制备RPE细胞。
在培养第39天的观察后,收集细胞,提取RNA并进行实时RT-PCR。RNeasy Mini Kit(QIAGEN)用于RNA提取,QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒(QIAGEN)用于实时RT-PCR。BEST1(Hs00188249_m1)、MITF(Hs01117294_m1)、RAX(Hs00429459_m1)、GAPDH(Hs02758991_g1)的引物和探针购自Applied Biosystems。将每个样品的BEST1、MITF和RAX的表达水平用GAPDH的表达水平标准化,并表示为相对于在维持未分化状态(为1)的条件下培养的iPS细胞(未分化)的表达水平的相对值。
基于培养第39天观察到的培养板的图像和根据图14A,通过视觉观察确定RPE细胞在整个孔中的比例。结果,未处理的情况为“1”,MEK抑制剂6天+BMP受体抑制剂1天暴露为“3”,MEK抑制剂6天+BMP受体抑制剂6天暴露为“5”(图24,上侧,细胞照片)。通过实时RT-PCR方法比较这些样品和在用于维持未分化状态的连续培养下的iPS细胞(未分化)样品之间的作为视网膜色素上皮细胞标记物的BEST1、MITF和作为早期眼形成阶段的标记物的RAX的表达水平。结果,发现了黑褐色细胞的面积与上述标记基因的表达水平之间的相关性(图24,下侧,图表)。根据以上结果,表明黑褐色细胞表达视网膜色素上皮细胞标记基因和早期眼形成阶段的标记基因。另外,通过检测这些基因表达水平也证实了通过该制备方法制备RPE细胞。
参考例14:通过包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的制备方法制备的RPE
细胞的标记基因的表达的确认
根据“Nakagawa,M.等人,Sci.Rep.2014年1月18日;4∶3594”中描述的方法,进行在无饲养细胞条件下维持人iPS细胞(1231A3系)的未分化状态的培养。所用培养基为AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.)(下文称AK03N培养基)。
包括MEK抑制剂或FGF受体抑制剂处理步骤的视网膜色素上皮(RPE)细胞的制备如下进行。将在用于维持未分化状态的培养下的iPS细胞用0.5×TrypLE select(等量TrypLEselect(Life Technologies)和0.5mM EDTA/PBS(-)的混合物)处理,使用细胞刮刀解离,通过移液分散为单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(Nippi)(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下在含有ROCK抑制剂[10μM Y-27632(Wako PureChemical Industries,Ltd.)]的AK03N培养基中培养。在接种的第二天,将作为MEK抑制剂的PD0325901(SIGMA)(终浓度1μM)或作为FGF受体抑制剂的PD173074(SIGMA)(终浓度100nM)加入AK03N培养基(第一步开始)中,并将细胞暴露于其中6天(第一步完成)。然后,用0.5×TrypLE select处理细胞,用细胞刮刀解离,通过移液分散成单个细胞,接种于涂有iMatrix-511(0.5μg/cm2)的6孔培养板中,每孔2.0×105个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养(第二步开始)。从培养第1天到第4天,使用添加了20%KSR(Life Technologies)、Y-27632(终浓度10μM)、作为Nodal信号转导途径抑制剂的SB-431542(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)(终浓度5μM)和作为Wnt信号转导途径抑制剂的CKI-7(SIGMA)(终浓度3μM)的基础培养基[GMEM培养基(SIGMA)、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)、0.1mM 2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)、2mM L-谷氨酰胺(SIGMA)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)];培养5-8天,使用添加了15%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)和CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养9-12天,使用添加了10%KSR、Y-27632(终浓度10μM)、SB-431542(终浓度5μM)、CKI-7(终浓度3μM)的基础培养基;培养13-30天,使用只添加了10%KSR的基础培养基;从培养开始31天起,使用RPE维持培养基[67%DMEM低葡萄糖(SIGMA)、29%F12(SIGMA)、1.9%B-27补充剂(Life Technologies)、1.9mM L-谷氨酰胺、96U/ml青霉素-96μg/ml链霉素]。每天更换全部量的培养基。同时,也在不包括MEK抑制剂处理步骤的参考比较例1的条件下进行了实验(将AK03培养基变为AK03N培养基)。
在培养第43天的观察后,收集细胞,提取RNA并进行RT-PCR。RNeasy Micro Kit(QIAGEN)用于RNA提取,Oligo(dT)12-18Primer(Invitrogen)、SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)用于逆转录反应,Blend Taq-Plus-(TOYOBO)用于PCR。RPE65、BEST1、CRLBP、GAPDH的引物序列如下所述。RPE65-F:TCCCCAATACAACTGCCACT(SEQ ID NO:1);RPE65-R:CCTTGGCATTCAGAATCAGG(SEQ ID NO:2);BEST1-F:TAGAACCATCAGCGCCGTC(SEQ ID NO:3);BEST1-R:TGAGTGTAGTGTGTATGTTGG(SEQ ID NO:4);CRALBP-F:GAGGGTGCAAGAGAAGGACA(SEQID NO:5);CRALBP-R:TGCAGAAGCCATTGATTTGA(SEQ ID NO:6);GAPDH-F:ACCACAGTCCATGCCATCAC(SEQ ID NO:7);GAPDH-R:TCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO:8)。对于RPE65、BEST1、GAPDH,PCR反应的循环数为30个循环,对于CRALPP,PCR反应的循环数为35个循环。通过琼脂糖凝胶电泳,针对RPE65在369bp附近、针对BEST1在261bp附近、针对CRALBP在341bp附近和针对GAPDH在452bp附近检测到PCR产物的单一条带。作为阳性对照,使用原代人RPE(hRPE),作为阴性对照,使用在维持未分化状态的条件下培养的iPS细胞(未分化iPSC)。
培养第43天观察培养板。结果,在参考比较例1的条件下,仅有少数细胞可以确认表现出RPE细胞的典型特征,例如黑褐色、多边形、鹅卵石样形态(图25,右侧,细胞照片,未处理)。另一方面,当暴露于MEK抑制剂和FGF受体抑制剂时,可以在宽的区域上确认黑褐色细胞群的出现(图25,右侧,细胞照片,MEKi,FGFRi)。作为RT-PCR的结果,在参考比较例1的条件下,视网膜色素上皮细胞标记物RPE65、BEST1、CRALPP的条带非常细(图25,左侧,电泳图,未处理)。另一方面,在暴露于MEK抑制剂和FGF受体抑制剂的样品中可以确认清晰的条带(图25,左侧,电泳图,MEKi,FGFRi)。从上述结果,通过包括MEK抑制剂和FGF受体抑制剂处理步骤的制备方法的RPE细胞的高效制备也通过检测这些基因表达水平而得到证实。
工业实用性
本发明的制备方法能够高效和方便地从多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞。
(相关申请的说明)
本申请基于在日本提交的专利申请No.2017-44431(申请日:2017年3月8日),其内容在此全部引入作为参考。
Claims (25)
1.一种视网膜色素上皮细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)第一步,在包含选自由FGF受体抑制剂和MEK抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养多能干细胞不超过30天的期间,和
(2)第二步,在含有选自由Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂组成的组中的至少一种的培养基中培养第一步中获得的细胞,以形成视网膜色素上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一步在无血清条件下进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述第一步在不存在饲养细胞的情况下进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法,其中所述第一步中的培养基还包含用于维持未分化状态的因子。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其中所述用于维持未分化状态的因子是FGF信号转导途径激动剂。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述FGF信号转导途径激动剂是bFGF。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述FGF受体抑制剂是选自由PD173074和SU5402组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述MEK抑制剂是选自由PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733和AZD-8330组成的组中的至少一种。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有外源Nodal信号转导途径抑制剂或外源Wnt信号转导途径抑制剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有除了Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂以外的影响多能干细胞分化诱导的外源性物质。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述第二步中的培养基不含有除了Rho信号转导途径抑制剂和细胞凋亡抑制剂以外的影响多能干细胞分化诱导成外胚层细胞的外源性物质。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述Rho信号转导途径抑制剂是选自由Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂和肌球蛋白抑制剂组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂选自由Y27632和法舒地尔组成的组中的至少一种。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述细胞凋亡抑制剂是胱天蛋白酶抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述胱天蛋白酶抑制剂是Z-VAD-FMK。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的制备方法,其中所述多能干细胞为灵长类动物多能干细胞。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的制备方法,其中所述多能干细胞为人多能干细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期为2天-13天。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述第一步中的培养期为4天-6天。
20.一种评价测试物质的毒性或药效的试剂,其包含通过根据权利要求1-19中任一项所述的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞。
21.一种评价测试物质的毒性或功效的方法,其包括使根据权利要求1-19中任一项所述的制备方法制备的视网膜色素上皮细胞与所述物质接触,并测定所述物质对所述细胞的作用。
22.一种治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病的治疗剂,其包含通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞。
23.一种治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病的方法,其包括将有效量的通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞移植给需要治疗的受试者。
24.通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞,其用于治疗基于视网膜色素上皮细胞障碍的疾病。
25.一种药物组合物,其包含通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备的视网膜色素上皮细胞作为活性成分。
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