CN105823765A - 可扩展荧光寿命探测范围的质心算法cmm - Google Patents

Abstract

本发明属电学领域，为扩展可探测的荧光寿命的范围，使可探测的荧光寿命的范围不受诱发荧光激光脉冲频率以及TDC量化范围的影响，本发明采取的技术方案是，可扩展荧光寿命探测范围的质心算法CMM，包括如下步骤：对于一个单指数响应的荧光寿命衰减曲线：f(t)＝Aexp(-t/τ)(1)CMM算法的精度及误差关系式定为：<maths num="0001"><math><![CDATA[ <mrow> <mfrac> <msub> <mi>&tau;</mi> <mrow> <mi>C</mi> <mi>M</mi> <mi>M</mi> </mrow> </msub> <mi>T</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mfrac> <mi>&tau;</mi> <mi>T</mi> </mfrac> <mo>-</mo> <mfrac> <msup> <mi>e</mi> <mrow> <mo>-</mo> <mi>T</mi> <mo>/</mo> <mi>&tau;</mi> </mrow> </msup> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>e</mi> <mrow> <mo>-</mo> <mi>T</mi> <mo>/</mo> <mi>&tau;</mi> </mrow> </msup> </mrow> </mfrac> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mn>2</mn> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>]]></math></maths><maths num="0002"><math><![CDATA[ <mrow> <msub> <mi>&tau;</mi> <mrow> <mi>C</mi> <mi>M</mi> <mi>M</mi> </mrow> </msub> <mo>=</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mfrac> <mrow> <munderover> <mo>&Sigma;</mo> <mrow> <mi>j</mi> <mo>=</mo> <mn>0</mn> </mrow> <mrow> <mi>M</mi> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> </munderover> <msub> <mi>jN</mi> <mi>j</mi> </msub> </mrow> <msub> <mi>N</mi> <mi>C</mi> </msub> </mfrac> <mo>+</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <mn>2</mn> </mfrac> <mo>)</mo> </mrow> <mi>h</mi> </mrow>]]></math></maths>修正后的荧光寿命的标准差为<maths num="0003"><math><![CDATA[ <mrow> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>&sigma;&tau;</mi> <mrow> <mi>C</mi> <mi>M</mi> <mi>M</mi> <mo>.</mo> <mi>C</mi> <mi>o</mi> <mi>r</mi> <mi>r</mi> </mrow> </msub> </mrow> <mi>&tau;</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>&sigma;&tau;</mi> <mrow> <mi>C</mi> <mi>M</mi> <mi>M</mi> </mrow> </msub> </mrow> <mi>&tau;</mi> </mfrac> <mrow> <mo>(</mo> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>d&tau;</mi> <mrow> <mi>C</mi> <mi>M</mi> <mi>M</mi> </mrow> </msub> </mrow> <mrow> <mi>d</mi> <mi>&tau;</mi> </mrow> </mfrac> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mfrac> <mi>h</mi> <mrow> <mi>&tau;</mi> <msqrt> <msub> <mi>N</mi> <mi>C</mi> </msub> </msqrt> </mrow> </mfrac> <mfrac> <mrow> <msqrt> <mrow> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>x</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> </msqrt> <mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>x</mi> <mi>M</mi> </msup> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> <mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <mi>x</mi> <mo>)</mo> <mo>&lsqb;</mo> <msup> <mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>x</mi> <mi>M</mi> </msup> <mo>)</mo> </mrow> <mn>2</mn> </msup> <mo>-</mo> <mfrac> <mrow> <msup> <mi>M</mi> <mn>2</mn> </msup> <msup> <mi>h</mi> <mn>2</mn> </msup> </mrow> <msup> <mi>&tau;</mi> <mn>2</mn> </msup> </mfrac> <msup> <mi>x</mi> <mi>M</mi> </msup> <mo>&rsqb;</mo> </mrow> </mfrac> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mo>(</mo> <mn>3</mn> <mo>)</mo> <mo>.</mo> </mrow>]]></math></maths>本发明主要应用于探测荧光寿命场合。

Description

可扩展荧光寿命探测范围的质心算法CMM

技术领域

本发明涉及生物成像芯片领域，尤其是实时荧光寿命成像领域。具体讲,涉及可扩展荧光寿命成像探测范围的质心算法(CMM)。

背景技术

荧光寿命成像是一种广泛应用于生物学、医学领域的生物分子识别方法。荧光寿命成像技术是利用合适波长的入射脉冲光对生物样品进行激发，通过测量生物组织中的自发荧光发光强度衰减过程时间的不同,来获得荧光团分子内部的能级结构,同时可用来区分样品中的不同分子种类的成像技术。荧光寿命成像广泛应用在生命科学、医学领域，如细胞生物学、癌症的诊断、器官组织分析、药品的传递和释放、血液病理学等领域。

在还原寿命的方法中，质心法(Center-of-massMethod，CMM)由于其利用光子效率高以及硬件易于实现，十分适合应用在目前上处于发展阶段的光子雪崩二极管(SinglePhotonAvalanchePhotoDiode，SPAD)图像传感器的后端数据处理中。传统的CMM方法的测量范围是与前级时间转化电路(TDC)的量化范围直接相关的，一般来说，若保持寿命估算误差保持在5％以内，CMM能测量的最大荧光寿命为TDC量化范围的1/7左右，超过此范围，误差将不容忽视；CMM算法能测算的最小荧光寿命则是由探测***的仪器响应函数决定的，而非由算法本身影响的。对于SPAD荧光寿命成像芯片，其诱发荧光的激光脉冲的频率(周期)一般为40MHz(25ns)、20MHz(50ns)、10MHz(100ns)，相应的能够测量的最大荧光寿命分别为3.6ns、7.1ns、14.3ns。

下面以单指数衰减情况为例以简化分析，对于一个单指数响应的荧光寿命衰减曲线，其荧光强度表达式为：

f(t)＝Aexp(-t/τ)(1)

其中，A为荧光强度的幅度，t为探测窗口所处的时刻点，τ为待测荧光的衰减寿命，若荧光激发的激光周期为Tl，则测量的时间长度是0＜t＜Tl，使用一个十位的TDC对光子达到时间进行量化。CMM算法能够测算出荧光衰减曲线的质心，样本的质心可以近似等于荧光寿命：

$CM=\frac{{\&Integral;}_0^{T}tf\left(t\right)dt}{{\&Integral;}_0^{T}f\left(t\right)dt}=\mathrm{\&tau;}-\frac{{\mathrm{Te}}^{-T/\mathrm{\&tau;}}}{1-e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}\&ap;{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}=(\frac{\underset{j=0}{\overset{M-1}{\&Sigma;}}{\mathrm{jN}}_j}{N_C}+\frac{1}{2})h---\left(2\right)$

其中CM为荧光强度曲线的质心，h为TDC的量化精度，也就是TDC的一个LSB，M为TDC时间窗口总数(十位精度)，T为TDC量程，Nj是第j个时间窗口内所记录的事件个数，N_C是TDC所记录的总的时间个数。CMM算法的精度及标准差关系式分别为:

$\frac{{\mathrm{\&Delta;\&tau;}}_{CMM}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}}G\left(x\right)-1---\left(3\right)$

$\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}\sqrt{N_C}}\frac{\sqrt{P\left(x\right)}}{(1-x)(1-x^M)}---\left(4\right)$

其中中间参变量x，P(x)和G(x)分别定义为

$G\left(x\right)=\frac{1+x}{2(1-x)}-\frac{{\mathrm{Mx}}^M}{1-x^M}---\left(5\right)$

P(x)＝x-M²x^M+(2M²-2)x^M+1-M²x^M+2+X^2M+1(6)

x＝exp(-h/τ)(7)。

发明内容

为克服现有技术的不足，扩展可探测的荧光寿命的范围，使可探测的荧光寿命的范围不受诱发荧光激光脉冲频率以及TDC量化范围的影响。为此，本发明采取的技术方案是，可扩展荧光寿命探测范围的质心算法CMM，包括如下步骤：

对于一个单指数响应的荧光寿命衰减曲线：

f(t)＝Aexp(-t/τ)(8)

CMM算法的精度及误差关系式定为：

$\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}{T}=\frac{\mathrm{\&tau;}}{T}-\frac{e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}{1-e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}---\left(9\right)$

${\mathrm{\&tau;}}_{CMM}=(\frac{\underset{j=0}{\overset{M-1}{\&Sigma;}}{\mathrm{jN}}_j}{N_C}+\frac{1}{2})h$

Nj是第j个时间窗口内所记录的事件个数，NC是TDC所记录的总的时间个数，h为TDC的量化精度；

使用下列方式进行递推近似来求解：

$\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{i+1}}{T}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}{T}-\frac{e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}{1-e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}---\left(10\right)$

其中i＝0,1,2,...,τ₀＝τ_CMM，当满足误差条件

|τ_i+1-τ_i|<ε(11)

时，递推过程停止；其中，根据公式(8)递推的结果通过向量使τ_CMM与τ对应；并使用内插技术进一步提高查找表的精度；从公式(1)、(2)、(4)得到，修正后的寿命信息的精度表示为

通过公式(9)，修正后的荧光寿命的标准差为

$\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM.Corr}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM}}{\mathrm{\&tau;}}\left(\frac{{\mathrm{d\&tau;}}_{CMM}}{d\mathrm{\&tau;}}\right)=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}\sqrt{N_C}}\frac{\sqrt{P\left(x\right)}(1-x^M)}{(1+x)\&lsqb;{(1-x^M)}^2-\frac{M^2{h}^2}{{\mathrm{\&tau;}}^2}{x}^M\&rsqb;}---\left(13\right)$

其中中间参变量x，P(x)和G(x)分别定义为

$G\left(x\right)=\frac{1+x}{2(1-x)}-\frac{{\mathrm{Mx}}^M}{1-x^M}---\left(14\right)$

P(x)＝x-M²x^M+(2M²-2)x^M+1-M²x^M+2+X^2M+1(15)

x＝exp(-h/τ)(16)

A为荧光强度的幅度，t为探测窗口所处的时刻点，τ为待测荧光的衰减寿命，h为TDC的量化精度，也就是TDC的一个LSB，M为TDC时间窗口总数，T为TDC量程。

根据公式(8)递推的结果通过向量使τ_CMM与τ对应；并使用内插技术进一步提高查找表的精度具体是，根据公式(8)递推的结果提前把所有情况计算出来并存储在软件中，通过查找表把初次计算得到的质心寿命和修正后寿命直接对应起来。

本发明的特点及有益效果是：

本发明在传统CMM算法的技术上通过引入查找表的方式，扩展了CMM算法对于荧光寿命的还原范围，使用本修正算法能准确估算的最大荧光寿命为2T，使量化范围扩大了14倍左右。

经过仿真，可以看出在荧光寿命等于TDC量化范围两倍的时候，传统CMM算法还原的寿命偏离了50％以上，而扩展CMM算法基本与实际寿命一致，出现的偏差主要由于随机过程中的方差引起。需要注意的是，当实际寿命远大于TDC量化范围时，扩展CMM算法还原寿命的方差将不容忽视，这也导致在实际的应用中，测量的寿命应小于两倍的量化范围。

附图说明：

图1：基于TCSPC的荧光寿命原理；

图2：Matlab模拟荧光光子的发射的模拟结果；

图3：查找表的实现方式；

具体实施方式

传统的CMM算法只有在T≥7τ时才可以使τ_CMM接近于实际τ，对于T<7τ的情况，公式(1)提供了一个有偏估计量，它可以快速的收敛到一个不确定的小于实际寿命的值。为了扩展可还原的荧光寿命范围，公式(1)需要被重新检验，当T<7τ时，公式(1)中的后一项不能被忽略，公式(1)重新写成

$\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}{T}=\frac{\mathrm{\&tau;}}{T}-\frac{e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}{1-e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}---\left(17\right)$

上式仍是不可解的，但可以使用下列方式进行递推近似：

${\mathrm{\&tau;}}_0={\mathrm{\&tau;}}_{CMM}=(\frac{\underset{j=0}{\overset{M-1}{\&Sigma;}}{\mathrm{jN}}_j}{N_C}+\frac{1}{2})h\frac{1}{2}$

$\begin{array}{c}\frac{{\mathrm{\&tau;}}_1}{T}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_0}{T}-\frac{e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}}{1-e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}}\\ \frac{{\mathrm{\&tau;}}_2}{T}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_0}{T}-\frac{e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_1}}{1-e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_1}}\\ \mathrm{...}\\ \frac{{\mathrm{\&tau;}}_{i+0}}{T}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_0}{T}-\frac{e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}{1-e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}\end{array}---\left(18\right)$

其中i＝0,1,2,...,τ₀＝τ_CMM为第一次估算得到的衰减寿命值，当满足误差条件

|τ_i+1-τ_i|<ε(19)

时，递推过程停止，ε为由应用环境决定的检验常量。每进行一次递推，τ_CMM所得到的寿命估算值就越接近理论衰减寿命值。但是当τ_CMM/T接近0.5时，求根过程收敛得速度较慢，为了提高成像速度，根据公式(8)递推的结果可以提前把所有情况计算出来并存储在软件中，通过查找表把初次计算得到的质心寿命和修正后寿命直接对应起来，节约硬件资源，简化计算过程。从公式(1)、(2)、(4)得到，修正后的寿命信息的准确度可以表示为

$\frac{{\mathrm{\&Delta;\&tau;}}_{CMM,corr}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}}G\left(x\right)-1+\frac{{\mathrm{Te}}^{-T/\mathrm{\&tau;}}}{\mathrm{\&tau;}(1-e^{-T/\mathrm{\&tau;}})}=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}}G\left(x\right)-1+\frac{h}{\mathrm{\&tau;}}\frac{{\mathrm{Me}}^{-Mh/\mathrm{\&tau;}}}{1-e^{-Mh/\mathrm{\&tau;}}}=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}}\frac{1+x}{2(1-x)}-1---\left(20\right)$

只有TDC引入的量化噪声得到了保留。通过公式(9)，荧光寿命的可解性得到了显著的提高。修正后的荧光寿命的精确度为

$\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM.Corr}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM}}{\mathrm{\&tau;}}\left(\frac{{\mathrm{d\&tau;}}_{CMM}}{d\mathrm{\&tau;}}\right)=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}\sqrt{N_C}}\frac{\sqrt{P\left(x\right)}(1-x^M)}{(1-x)\&lsqb;{(1-x^M)}^2-\frac{M^2{h}^2}{{\mathrm{\&tau;}}^2}{x}^M\&rsqb;}---\left(21\right)$

图3为查找表示意图，由原始数据得到的τ_CMM/T得到τ_CMM,corr/T，进而得到τ_CMM,corr，其中τCMM,corr/T的分辨率为0.0001。

以测量40ns寿命为例，TDC的量化范围为100ns，时间分辨率为100ps，使用3200个光子进行测量；使用扩展CMM算法得到的平均寿命为40.353ns，方差为1ns；使用传统CMM算法得到的平均寿命为31.2ns，方差为0.5ns。

Claims (2)

1.一种可扩展荧光寿命探测范围的质心算法CMM，其特征是，包括如下步骤：

对于一个单指数响应的荧光寿命衰减曲线：

f(t)＝Aexp(-t/τ)(1)

CMM算法的精度及误差关系式定为：

$\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}{T}=\frac{\mathrm{\&tau;}}{T}-\frac{e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}{1-e^{-T/\mathrm{\&tau;}}}---\left(2\right)$

${\mathrm{\&tau;}}_{CMM}=(\frac{\underset{j=0}{\overset{M-1}{\&Sigma;}}{\mathrm{jN}}_j}{N_C}+\frac{1}{2})h$

Nj是第j个时间窗口内所记录的事件个数，NC是TDC所记录的总的时间个数，h为TDC的量化精度；

使用下列方式进行递推近似来求解：

$\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{i+1}}{T}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{CMM}}{T}-\frac{e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}{1-e^{-T/{\mathrm{\&tau;}}_i}}---\left(3\right)$

其中i＝0,1,2,...,τ₀＝τ_CMM，当满足误差条件

|τ_i+1-τ_i|<ε(4)

时，递推过程停止；其中，根据公式(8)递推的结果通过向量使τ_CMM与τ对应；并使用内插技术进一步提高查找表的精度；从公式(1)、(2)、(4)得到，修正后的寿命信息的精度表示为通过公式(9)，修正后的荧光寿命的标准差为

$\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM.Corr}}{\mathrm{\&tau;}}=\frac{{\mathrm{\&sigma;\&tau;}}_{CMM}}{\mathrm{\&tau;}}\left(\frac{{\mathrm{d\&tau;}}_{CMM}}{d\mathrm{\&tau;}}\right)=\frac{h}{\mathrm{\&tau;}\sqrt{N_C}}\frac{\sqrt{P\left(x\right)}(1-x^M)}{(1-x)\&lsqb;{(1-x^M)}^2-\frac{M^2{h}^2}{{\mathrm{\&tau;}}^2}{x}^M\&rsqb;}---\left(6\right)$

其中中间参变量x，P(x)和G(x)分别定义为

$G\left(x\right)=\frac{1+x}{2(1-x)}-\frac{{\mathrm{Mx}}^M}{1-x^M}---\left(7\right)$

P(x)＝x-M²x^M+(2M²-2)x^M+1-M²x^M+2+X^2M+1(8)

x＝exp(-h/τ)(9)

A为荧光强度的幅度，t为探测窗口所处的时刻点，τ为待测荧光的衰减寿命，h为TDC的量化精度，也就是TDC的一个LSB，M为TDC时间窗口总数，T为TDC量程。

2.如权利要求1所述的可扩展荧光寿命探测范围的质心算法CMM，其特征是，根据公式(8)递推的结果通过向量使τ_CMM与τ对应；并使用内插技术进一步提高查找表的精度具体是，根据公式(8)递推的结果提前把所有情况计算出来并存储在软件中，通过查找表把初次计算得到的质心寿命和修正后寿命直接对应起来。