CN105821072A - 用于DNA组装的CRISPR-Cas9***及DNA组装方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于DNA组装的CRISPR-Cas9***及DNA组装方法，所述CRISPR-Cas9***包括如下组成部分：用于表达Cas9基因的质粒；和第一向导RNA和/或用于表达所述第一向导RNA的质粒，其中所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合用于组装的半合成染色体所携带的第一报告基因。本发明的CRISPR-Cas9***具有同源重组替换成功率高、需要设计和使用的向导RNA种类少、基因组序列受到的有害影响少、脱靶率低的优势。

Description

用于DNA组装的CRISPR-Cas9***及DNA组装方法
技术领域
本发明涉及合成生物学领域的合成基因组技术，尤其涉及一种用于DNA组装的CRISPR-Cas9***及DNA组装方法。
背景技术
CRISPR-Cas9是细菌和古生菌的自我防御***，能够通过单链RNA识别外来双链DNA，并借助Cas9核酸酶在其上产生双键断裂，消除外来DNA侵染。CRISPR-Cas9***具有可移植性，经过改造后可以在包括酿酒酵母等真核生物在内的细胞中行驶DNA识别和切除功能，目前已被改造成优秀的基因组编辑工具。相比于Zinc-Finger和TALE技术，CRISPR-Cas9因其简单的DNA识别原理(利用RNA结合识别，而不像前两者利用能够结合DNA的蛋白)而成为目前最热门的研究领域之一。CRISPR-Cas9的一个研究方向是利用其识别特定DNA并在其上产生双键断裂的特性，增强同源重组时外源DNA重组的效率。
目前合成生物学领域的合成基因组需要多种DNA组装技术的配合，才能使得合成基因组能够逐渐从oligo组装起来，而这些技术中最重要的是基于同源重组的替换组装(即将合成片段替换在野生染色体上替换野生部分，逐渐形成合成染色体)。然而同源重组在自然状态下发生率很低，使得导致替换的成功率较低，正确克隆的筛选率往往不能达到实验人员的要求。早在1997年[1]和2011年[2]，Zinc-Finger和TALE就已经用于产生双键断裂而增加同源重组的效率，但是由于其自身的劣势(如Zinc-Finger并不能对任意DNA进行识别，Zinc-Finger和TALE制备和使用繁琐等)，往往使得实验人员消耗过多的资源在实验物料准备当中。相比之下，CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，规律间隔性成簇短回文重复序列)能够识别所有的DNA，物料制备、使用也很简单，使其成为优秀的替代品。
但是，由于CRISPR***仅靠很短的RNA(称为guideRNA，简称向导RNA、gRNA，由20bp的RNA-DNA结合位点+3bp的PAM位点+RNA结构臂组成，其中20bp的结合位点也称为CRISPR位点)对目标片段进行识别，脱靶的情况较Zinc-Finger和TALE技术严重。因此，对CRISPR位点进行严格的设计，从而降低其脱靶效率是重中之重，目前已有多篇文献[3]对CRISPR的脱靶效应进行了研究，出现了多个CRISPR设计的工具[4-7]。
目前国内的CRISPR相关的专利技术集中在基因敲除、构建敲除文库上，如“利用CRISPR/Cas9***构建真核基因敲除文库的方法”(CN103668472A，2014.03.26)，还没有利用CRISPR技术增强同源重组率从而提高合成基因组组装效率相关的专利技术报道。
英美两国的CRISPR相关的专利技术主要由MIT的张锋申请，其专利对CRISPR***各子部件的散布、改造、优化限制得比较紧，如DELIVERY,ENGINEERINGANDOPTIMIZATIONOFSYSTEMS,METHODSANDCOMPOSITIONSFORSEQUENCEMANIPULATIONANDTHERAPEUTICAPPLICATIONS(US2014242699(A1)，2014-08-28)。
发明内容
本发明提供一种用于DNA组装的CRISPR-Cas9***及DNA组装方法，能够提高通过同源重组进行DNA组装时的同源重组率，满足增加阳性克隆率的要求。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，包括如下组成部分：
用于表达Cas9基因的质粒；和
第一向导RNA和/或用于表达所述第一向导RNA的质粒，其中所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合用于组装的半合成染色体所携带的第一报告基因。
作为本发明的优选方案，所述CRISPR-Cas9***还包括如下组成部分：
宿主细胞，所述宿主细胞携带所述半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的所述第一报告基因；
待组装片段，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源。
作为本发明的优选方案，所述CRISPR-Cas9***还包括如下组成部分：
第二向导RNA和/或用于表达所述第二向导RNA的质粒，其中所述第二向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第二报告基因。
作为本发明的优选方案，所述第一报告基因和第二报告基因为酵母中的报告基因，优选为LEU2、URA3、HIS3、TRP1、MET17和LYS2中的两种，更优选为LEU2和URA3。
优选地，结合报告基因LEU2的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQIDNO：1)；
优选地，结合报告基因URA3的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQIDNO：2)。
作为本发明的优选方案，所述待组装片段为合成的基因组片段，所述CRISPR位点在其对应的报告基因的所有潜在位点中具有最高的可靠性分数。
作为本发明的优选方案，所述可靠性分数通过如下公式(1)计算得到：
S g u i d e = 100 100 + Σ i = 1 n o f f S h i t ( i ) - - - ( 1 ) ;
其中，i表示所述基因组上的每个脱靶位点，Shit表示每个脱靶位点的脱靶可能性分数，noff表示脱靶位点总数，Sguide表示每个CRISPR位点的可靠性分数；
所述每个脱靶位点的脱靶可能性分数Shit通过如下公式(2)计算得到：
S h i t = Π e ∈ M ( 1 - W [ e ] ) × 1 ( ( 19 - d ) ‾ 19 × 4 + 1 ) × 1 n m m 2 - - - ( 2 ) ;
其中，e表示所述CRISPR位点与对应的脱靶位点的实际错配位置，M指理论错配位置的集合，W[e]表示不同错配位置对脱靶的贡献值，d表示错配位置两两之间的平均距离，nmm表示错配位置的总数；其中，W[e]按照错配位置顺序，满足如下： W [ e ] = [ 0 , 0 , 0.014 , 0 , 0 , 0.395 , 0.317 , 0 , 0.389 , 0.079 , 0.445 , 0.508 , 0.613 , 0.851 , 0.732 , 0.828 , 0.615 , 0.804 , 0.685 , 0.583 ] .
根据本发明的第二方面，本发明提供一种DNA组装方法，所述方法包括：
将用于表达Cas9基因的质粒、用于表达第一向导RNA的质粒以及待组装片段转入宿主细胞内，所述宿主细胞携带有半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的第一报告基因，所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第一报告基因，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，所述待组装片段的另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源；
所述Cas9基因和所述第一向导RNA表达，产生Cas9核酸酶和所述第一向导RNA，以使所述第一向导RNA结合到所述第一报告基因上，并介导所述Cas9核酸酶使所述半合成染色体产生双键断裂，使得断裂的半合成染色体更倾向于与所述待组装片段同源重组，从而将所述待组装片段组装到所述半合成染色体上。
根据本发明的第二方面，本发明还提供一种DNA组装方法，所述方法包括：
将用于表达Cas9基因的质粒、包含第一向导RNA的产物以及待组装片段转入宿主细胞内，所述宿主细胞携带有半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的第一报告基因，所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第一报告基因，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，所述待组装片段的另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源；
所述Cas9基因表达，产生Cas9核酸酶，以使所述第一向导RNA结合到所述第一报告基因上，并介导所述Cas9核酸酶使所述半合成染色体产生双键断裂，使得断裂的半合成染色体更倾向于与所述待组装片段同源重组，从而将所述待组装片段组装到所述半合成染色体上。
优选地，所述包含第一向导RNA的产物通过PCR方法产生。
作为本发明的优选方案，所述第一报告基因和第二报告基因分别选自LEU2和URA3中的一个；
优选地，结合报告基因LEU2的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQIDNO：1)；
优选地，结合报告基因URA3的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQIDNO：2)。
作为本发明的优选方案，所述CRISPR位点在其对应的报告基因的所有潜在位点中具有最高的可靠性分数；
优选地，所述可靠性分数通过如下公式(1)计算得到：
S g u i d e = 100 100 + Σ i = 1 n o f f S h i t ( i ) - - - ( 1 ) ;
其中，i表示所述基因组上的每个脱靶位点，Shit表示每个脱靶位点的脱靶可能性分数，noff表示脱靶位点总数，Sguide表示每个CRISPR位点的可靠性分数；
所述每个脱靶位点的脱靶可能性分数Shit通过如下公式(2)计算得到：
S h i t = Π e ∈ M ( 1 - W [ e ] ) × 1 ( ( 19 - d ) ‾ 19 × 4 + 1 ) × 1 n m m 2 - - - ( 2 ) ;
其中，e表示所述CRISPR位点与对应的脱靶位点的实际错配位置，M指理论错配位置的集合，W[e]表示不同错配位置对脱靶的贡献值，d表示错配位置两两之间的平均距离，nmm表示错配位置的总数；其中，W[e]按照错配位置顺序，满足如下： W [ e ] = [ 0 , 0 , 0.014 , 0 , 0 , 0.395 , 0.317 , 0 , 0.389 , 0.079 , 0.445 , 0.508 , 0.613 , 0.851 , 0.732 , 0.828 , 0.615 , 0.804 , 0.685 , 0.583 ] .
根据本发明的第三方面，本发明提供一种第二方面所述的DNA组装方法构建而成的人工合成染色体或人工合成基因组。
根据本发明的第四方面，本发明提供一种人工合成微生物，所述人工合成微生物的染色体或基因组通过第二方面所述的DNA组装方法构建而成。
优选地，所述微生物为真核微生物，更优选为酵母。
本发明的DNA组装方法具有可重复操作性，并且普适于一切微生物的染色体或基因组的人工合成，因此按照本发明的DNA组装方法必然可以得到含有人工合成染色体或人工合成基因组的微生物。根据需要可以进一步提取出人工合成染色体或人工合成基因组；而从微生物中提取染色体或基因组的方法是本领域技术人员能够实现的。本发明一个实施例中成功地合成了人工酵母。
本发明利用CRISPR-Cas9***对同源重组替换进行优化，其有益效果体现在：基于同源重组的替换成功率高、需要设计和使用的向导RNA种类少、基因组序列受到的有害影响少、脱靶率低。
(1)理论上，在酿酒酵母中产生双键断裂能够使得同源重组率增加4000倍[11]。另有文献证明，使用CRISPR***对双链DNA产生双键断裂，断裂点临近同源重组区，能够使得双链DNA的同源重组效率至少增大130倍[10]，从而使得阳性克隆的筛选率大大提升；
(2)由于报告基因有特定的数目，如本发明中使用2个报告基因即可，所以只需要设计和使用两种向导RNA即可；
(3)由于向导RNA的设计数目少，使得在CRISPR位点脱靶效应的测试更为简单，从而对其有害性有更好的控制。另外，将CRISPR位点的结合点设计在报告基因(包含启动子、CDS和终止子三部分)内，由于报告基因不是基因组合成区的内容，在组装过程中会替换掉，因此即便同源重组中意外引入了有害的突变(双键断裂在细胞中主要是通过同源重组和非同源末端连接两种方式来修复，而非同源末端连接会引入突变)，也不会影响获得最终的合成基因组；
(4)此外，由于CRISPR位点的设计考虑因素全面，对所有CRISPR位点的特定数目的错配位点以内(如5个以内，含5个)的所有错配位置进行评分，最终获得每个CRISPR位置的可靠性分数，依靠此可靠性分数选择出来的位点可靠性高，脱靶效应小，从而降低合成基因组出错的概率。
附图说明
图1为本发明在DNA组装的同源重组替换中使用CRISPR-Cas9***增加同源重组率的原理示意图。
图2为pYP003质粒酶切验证电泳图。
图3为pRS413_Cas9质粒NotI酶切验证电泳图。
图4为pRS413_ADH1_Cas9质粒BsrGI酶切验证电泳图。
图5为pRS411_gRNA系列质粒NheI和BsaI酶切验证电泳图；其中，带“*”标记为错误单克隆。
图6为CRISPR活性测试菌落生长平板图；其中，圆圈标出菌落为粉红色菌落。
图7为CRISPR***1K-40片段替换效率测试菌落生长平板图。
图8为在BY4741_synchr07G菌株中同源重组替换H片段的示意图。
图9为在BY4741_synchr07H菌株中同源重组替换I片段的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
本发明中，任何情况下使用的“第一”、“第二”等概念都不应当理解为具有顺序和技术的含义，其作用仅在于将其与其它对象区别开来。
请参考图1，在同源重组替换中使用CRISPR-Cas9***增加同源重组率的原理示意图。在合成基因组的过程中，在进行megachunk片段B(称为“待组装片段”)的同源重组替换时，Cas9核酸酶通过设计好的向导RNA(即anti-LEU2，称为“第一向导RNA”)对进行megachunk片段A同源重组时引入的报告基因LEU2(称为“第一报告基因”；也可以是URA3，相应的向导RNA为anti-URA3)进行识别，产生双键断裂，由于产生双键断裂的位置在megachunk片段B同源重组替换的同源区附近，从而加大同源重组效率。图1中，半合成染色体指的是经过一次或者多次megachunk片段同源重组的野生染色体[8]，半合成染色体上含有合成染色体序列和野生染色体序列。每个megachunk指的是一次同源重组替换的DNA单元，约50kb长，具体可以是全长的完整片段，也可以是分成多个相互之间有同源区的亚片段(在本发明的一个实施例中，megachunk片段B指的是5个相互之间有约1kb同源区的亚片段)，每个megachunk均带有交替使用的报告基因，如交替使用的LEU2和URA3。在同源重组替换中，megachunk进行一次同源重组替换时引入报告基因来帮助筛选阳性克隆，在下一次同源重组替换时又将其替换掉。
本发明中同源重组替换方案包括两部分内容：一是设计严格的CRISPR位点以降低潜在的脱靶效应；二是根据设计的CRISPR位点进行基于CRISPR***的同源重组替换。
一.CRISPR位点设计：
首先，通过能够允许固定错配数目的短序列比对软件(如Batmis[9])来获取报告基因上的每个潜在位点(20nt+NGG)以及所有潜在位点的脱靶位点(即与潜在位点相比，在基因组DNA上错配数目小于等于5的匹配位点)。然后，对其脱靶位点进行评分，并选择出脱靶效应小的位点作为最佳候选位点。
可能的脱靶位点有以下几种性质[3](具备其中之一即可能是脱靶位点)：
(1)相同的20nt加上NGG或者NAG；
(2)与潜在位点有少于等于3个错配；
(3)与潜在位点有少于等于2个错配出现在PAM附近8-12bp的范围内；
(4)错配是不连续的而且间隔大于等于4bp。
为了对脱靶效应进行定量，引进评分***。考虑的因素有：设计的CIRPSR位点与脱靶位点序列的错配总数，错配的绝对位置，错配两两之间的平均距离[3]。每个脱靶位点的脱靶可能性分数Shit通过如下公式计算得到：
S h i t = Π e ∈ M ( 1 - W [ e ] ) × 1 ( ( 19 - d ) ‾ 19 × 4 + 1 ) × 1 n m m 2 ; 其中，e表示CRISPR位点与对应的脱靶位点的实际错配位置，M指理论错配位置的集合，W[e]表示不同错配位置对脱靶的贡献值，d表示错配位置两两之间的平均距离，nmm表示错配位置的总数；其中，W[e]按照错配位置顺序，满足如下： W [ e ] = [ 0 , 0 , 0.014 , 0 , 0 , 0.395 , 0.317 , 0 , 0.389 , 0.079 , 0.445 , 0.508 , 0.613 , 0.851 , 0.732 , 0.828 , 0.615 , 0.804 , 0.685 , 0.583 ] . 由此，脱靶可能性分数越高，此位点成为脱靶位点的可能性越高。
另外，对每个设计好的CRISPR位点的可靠性分数通过如下公式计算得到：
S g u i d e = 100 100 + Σ i = 1 n o f f S h i t ( i ) ; 其中，i表示所述基因组上的每个脱靶位点，Shit表示每个脱靶位点的脱靶可能性分数，noff表示脱靶位点总数，Sguide表示每个CRISPR位点的可靠性分数。由此，CRISPR位点的可能性分数越高，此位点越佳。
通过上述方法获得LEU2和URA3的可靠性分数前三位的CRISPR位点分别如表1和表2所示。
表1LEU2可靠性分数前三位的CRISPR位点
表2URA3可靠性分数前三位的CRISPR位点
注：
1.名称由设计对象名、设计序号、设计位置、设计所在链和设计的PAM信息构成。如LEU2_15_140_+_CGG代表设计对象是LEU2，这是寻找到的第15个潜在位点，潜在位点在LEU2上的位置140，潜在位点在LEU2上的正链+，PAM位点是CGG；
2.可靠性分数最高为1，最低为0；
3.通过脱靶位点所在基因编码区等信息可大致估计该CRISPR位点引入的突变可能造成的影响；
4.错配情况由错配碱基和错配碱基之间的距离构成，如5A0T1A4C1A4代表第6、7、9、14、16个错配碱基分别为A、T、A、C、A；
5.对于除LEU2和URA3以外的其它报告基因，如HIS3、TRP1、MET17、LYS2也可以通过上述方法设计CRISPR位点。
二.同源重组替换
根据设计的CRISPR位点进行同源重组替换[10]，利用CRISPR-Cas9***对目标位置(报告基因)进行双键断裂后，使得导入的同源片段更容易重组。
对于本发明的CRISPR-Cas9***可以使用如下两种：
1.将Cas9基因和向导RNA所在的两个质粒共转化，然后分别使其表达。
2.只将Cas9基因所在质粒转化，使其表达；对向导RNA所在质粒上的包含着启动子、向导RNA序列和终止子的表达盒使用PCR扩增，在需要的时候，将PCR产物进行转化，以便在细胞体内能够短暂地表达向导RNA。
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以下实施例仅是示例性的，用以说明本发明的可行性，并不应当理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员能够理解，按照本发明公开的方法可以在各种微生物体内，尤其是真核微生物内实现各种DNA片段的组装。
实施例1
1.对报告基因LEU2和URA3、片段替换测试基因YBR157C设计CRISPR位点(具体方法见上述“CRISPR位点设计”部分)(表3)。
表3
2.Cas9基因表达质粒的获得及改造
a.原始Cas9基因表达质粒pYP003由清华大学的戴俊彪老师赠与，也可通过商购获得，也可通过基因合成公司合成。Cas9序列如序列表中SEQIDNO：12所示。
b.由于原始Cas9基因表达质粒的缺陷型标记为LEU2，与替换片段的报告基因冲突，故利用限制酶NheI和SpeI(NEB)酶切pYP003质粒获得Cas9基因片段。在200μLPCR管中配制以下(表4)酶切体系，在酶的最适温度反应3小时。
表4
组分 用量
限制酶NheI 1μL
限制酶SpeI 1μL
10X CutSmart缓冲液 2μL
pYP003质粒 2μg
ddH2O 补足20μL
c.将酶切产物进行琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2％，使用6μLλ-HindIIIdigestMarker，电压为120V，电泳时间为45min。图2为pYP003质粒酶切结果电泳图。再进行切胶纯化，纯化步骤参考胶纯化试剂盒说明书。
d.对pRS413质粒(由纽约大学JefBoeke教授提供，也可通过商购获得)，质粒的图谱信息可参见snapgene网站。使用SpeI限制酶进行酶切，酶切体系及反应条件参见步骤2-b，其中限制酶改为SpeI，由此得到线性化的pRS413。
e.对酶切产物进行纯化，纯化步骤参考PCR纯化试剂盒说明书。
f.将步骤2-c、步骤2-e的两种纯化产物利用T4连接酶，按照表5配制连接反应体系，16℃过夜连接。
表5
组分 用量
Cas9片段 80ng
线性化pRS413质粒载体 20ng
10X连接酶缓冲液 1μL
ddH2O 补足10μL
取10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。最后得到生长有单克隆菌落的平板。
g.挑取单克隆菌落放入3mL已加入氨苄青霉素Ampicilin抗生素(抗生素的类型与pRS413的抗性相对应)的LB液体培养基的摇菌管中，37℃200rpm过夜培养。
h.用1.5mL离心管12000rpm离心1min收集菌体，提取质粒，质粒提取步骤参考质粒提取试剂盒的说明书。
i.取2μL质粒DNA进行琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶浓度为1％，3μLλ-HindIIIdigestMarker，电压为130V，电泳时间为45min。
j.对2～3个带型正确的质粒使用NotI内切酶进行酶切，再次进行电泳，酶切和电泳的步骤分别参见步骤2-b和步骤2-c。图3为pRS413_Cas9质粒NotI酶切验证结果图。
k.对带型正确的质粒所在的菌进行保菌工作。取灭过菌的1.5mL离心管，加入500μL鉴定正确菌株的菌液，500μL50％的甘油，混匀后-80℃冰箱保存，由此得到pRS413_Cas9。
l.利用基因合成公司合成2条引物(序列见ADH1启动子引物(表6)，SEQIDNO：13～14)。
表6
m.用上述两条引物对pYP003质粒进行PCR：98℃(1min)，98℃(10s)->55℃(30s)->72℃(1min)循环30轮，72℃(5min)，12℃(维持)。PCR体系见下(表7)。
表7
组分 用量
PrimerSTAR高保真聚合酶 0.4μL
5X PS缓冲液 8μL
模板DNA(质粒pYP003) 10ng10 -->
引物 4μL
dNTP 3.2μL
ddH2O 补足40μL
n.对PCR扩增产物进行切胶纯化，步骤参见2-c。
o.利用SalI限制酶将pRS413_Cas9质粒线性化并切胶回收，步骤参见2-b和2-c。
p.将2-n和2-o两步获得的纯化产物进行Gibson组装，组装步骤参见文献“EnzymaticassemblyofDNAmolecμLesuptoseveralhundredkilobases”[12]，组装时所需要的组装体系可通过购买NEB公司提供的GibsonMasterMix得到。取10μL组装产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，最后得到生长有单克隆菌落的平板。
q.挑取单克隆菌落放入已加入氨苄青霉素Ampicilin抗生素(抗生素的类型与pRS413的抗性相对应)的3mLLB液体培养基的摇菌管中，37℃200rpm过夜培养。
r.用1.5mL离心管12000rpm离心1min收集菌体，提取质粒，质粒提取步骤参考质粒提取试剂盒的说明书。
s.取2μL质粒DNA进行琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶浓度为1％，3μLλ-HindIIIdigestMarker，电压为130V，电泳时间为45min。
t.对2～3个带型正确的质粒使用BsrGI内切酶进行酶切，再次进行电泳，酶切和电泳的步骤分别参见步骤2-b和步骤2-c。图4为pRS413_ADH1_Cas9质粒BsrGI酶切验证结果图。
u.对带型正确的质粒所在的菌进行保菌工作。取灭过菌的1.5mL离心管，加入500μL鉴定正确菌株的菌液，500μL50％的甘油，混匀后-80℃冰箱保存，由此得到pRS413_ADH1_Cas9质粒。
3.构建gRNA表达质粒
a.将gRNA表达盒分为两个片段：片段1——SNR52启动子加CRISPR位点序列，片段2——CRISPR位点序列、gRNA骨架加SUP4终止子，其中将CRISPR位点序列作为两部分的重合区用于后续Gibson组装。CRISPR位点序列在此指的是表3中anti-LEU2、anti-URA3和anti-YBR157C的CRISPR位点。通过基因合成公司合成用于gRNA表达质粒构建的寡核苷酸链(见gRNA_oligo信息，表8，SEQIDNO：15～28)。
表8
gRNA表达载体选用营养缺陷型标记为MET的pRS411质粒。该质粒由纽约大学的JefBoeke提供(也可通过商购获得)，其序列信息可通过NCBI上关于该质粒的gb格式文件获得。
b.使用寡核苷酸链SNR52p-F和SNR52p-R(SEQIDNO：15～21)为引物，野生型酵母BY4741基因组(通过酚氯仿法提取获得)为模板进行PCR获得片段1：98℃(1min)，98℃(10s)->48℃(30s)->72℃(35s)循环30轮，72℃(5min)，12℃(维持)。PCR体系见下(表9)。
表9
c.使用寡核苷酸链gRNA-F(SEQIDNO：22～27)和gRNA-SUP4-R为引物，以质粒pSB1C3-sgRNA_aroK(构建方法：pSB1C3质粒相关信息可通过iGEM官方网站查询获得；用XbaI和SpeI限制酶酶切pSB1C3质粒后,将序列TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCGCGCCCAATAGTGCTTTTTCgTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTTTTTGTTTTTTATGTCT(SEQIDNO：35)连接入线性化的pSB1C3载体，即得到pSB1C3-sgRNA_aroK质粒)为模板进行PCR获得片段2：98℃(1min)，98℃(10s)->48℃(30s)->72℃(20s)循环30轮，72℃(5min)，12℃(维持)。PCR体系见下(表10)。
表10
d.将3-b和3-c获得的PCR产物进行PCR产物纯化，步骤参见2-e。
e.利用SpeI酶切获得线性化pRS411载体，并切胶回收，步骤参见2-b和2-c。
f.将3-d和3-e两步获得的纯化产物进行Gibson组装，组装步骤参见文献“EnzymaticassemblyofDNAmolecμLesuptoseveralhundredkilobases”[12]，组装时所需要的组装体系可通过购买NEB公司提供的GibsonMasterMix得到。取10μL组装产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，最后得到生长有单克隆菌落的平板。
g.挑取6～8单克隆菌落放入3mL已加入氨苄青霉素Ampicilin抗生素(抗生素的类型与pRS411的抗性相对应)的LB液体培养基的摇菌管中，37℃200rpm过夜培养。
h.用1.5mL离心管12000rpm离心1min收集菌体，提取质粒，质粒提取步骤参考质粒提取试剂盒的说明书。
i.对上一步提取的质粒使用NheI和BsaI限制酶进行酶切，再次进行电泳，酶切和电泳的步骤分别参见步骤2-b和步骤2-c。图5为含有不同CRISPR位点的pRS411_gRNA质粒NheI和BsaI酶切验证结果图。
j.对带型正确的质粒所在的菌进行保菌工作。取灭过菌的1.5mL离心管，加入500μL鉴定正确菌株的菌液，500μL50％的甘油，混匀后-80℃冰箱保存，由此得到含有不同CRISPR位点的pRS411_gRNA质粒(表11，仅选取部分展示)。
表11
gRNA表达质粒名称 对应CRISER位点名称
pRS411_gRNA18 YBR157C_18_226_-_AGG
pRS411_gRNA22 YBR157C_22_303_-_GGG
pRS411_gRNA24 YBR157C_24_305_+_AGG
pRS411_gRNA25 YBR157C_25_314_+_TGG
pRS411_gRNA_LEU15 LEU2_15_140_+_CGG
pRS411_gRNA_URA45 URA3_45_594_+_CGG
k.另外，也可以不需要构建gRNA表达质粒，直接使用包含gRNA的产物。该产物的构建方法如下：使用寡核苷酸链SNR52p-F和gRNA-SUP4-R为引物，以上述构建的含有不同CRISPR位点的pRS411_gRNA质粒为模板，进行PCR(反应体系参考表9/表10)，即可获得包含gRNA的PCR产物。此后使用到gRNA表达质粒的地方均用gRNA的PCR产物替代即可。
4.CRISPR活性测试
为确认上述构建的pRS413_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA质粒，即CRISPR***在酿酒酵母细胞中是否具有基因组编辑活性，选择酿酒酵母内源ADE2基因作为报告基因，URA3作为***片段进行CRISPR活性测试。
a.根据anti-ADE2的CRISPR位点序列：ACTTGAAGATTCTTTAGTGT，设计用于获得gRNA表达载体的组装片段的引物，以及获得***片段URA3_ade2的引物(表12)。
表12
b.获得打靶ADE2基因的gRNA表达质粒pRS411_gRNA-ade，步骤参见3-b至3-j。
c.以pRS416质粒(由纽约大学的JefBoeke提供(也可通过商购获得)，其序列信息可通过NCBI上关于该质粒的gb格式文件获得。)为模板，URA3_ade2_40-F和URA3_ade2_40-R为引物，进行PCR获得***片段URA3_ade2。反应程序为98℃(1min)，98℃(10s)->55℃(30s)->72℃(1min25s)循环30轮，72℃(5min)，12℃(维持)。PCR体系见下(表13)。
表13
组分 用量
PrimerSTAR高保真聚合酶 0.4μL
5X PS缓冲液 8μL14 -->
模板DNA(pRS416质粒) 5ng
引物 4μL
dNTP 3.2μL
ddH2O 补足40μL
d.将4-c获得的PCR产物进行PCR产物纯化，步骤参见2-e。
e.酵母感受态细胞制备及转化
e-1.取出12ml圆底培养管，加入4mLYPD液体培养基和10μL菌液，在30℃下200rpm摇培过夜进行复苏培养。
e-2.在锥形瓶中加入50mlYPD液体培养基，接种过夜培养的菌液，在30℃下200rpm摇培至OD值介于0.6-1.0之间。
e-3.将50mL菌液倒入50mL离心管中，3000rpm离心5min。去除上清，悬空加入50mL灭菌水，颠倒混匀，3000rpm离心5min。去除上清，悬空加入20mL0.1mol/L的醋酸锂溶液，颠倒混匀，3000rpm离心5min。去除上清，加入大约1ml的0.1mol/L的醋酸锂溶液，将菌体吹打混匀，至此，酵母感受态细胞制备完成。
e-4.取4个1.5mL离心管中，分别标记1、2、3、4，向各个管中加入待转化片段。在1号管中加入1000ng步骤4-d中回收的***片段URA3_ade2，2号管中加入1000ng步骤4-d中回收的***片段URA3_ade2、pRS415和pRS411质粒各500ng，3号管中加入1000ng步骤4-d中回收的***片段URA3_ade2、pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA-ade质粒各500ng，在4号管中加入pRS415、pRS411、pRS416质粒各500ng。
e-5.在1、2、3号管中各加入100μL的酵母感受态细胞，然后依次加入25μLssDNA，41μL1mol/L的醋酸锂溶液，312μL50％PEG3350，将菌体吹打混匀或振荡混匀，置于30℃培养箱放置30min，加入50μLDMSO，稍微振荡混匀后，将离心管置于42℃的金属浴锅上放置15min，取出离心管，3000rpm离心2min，小心吸去上清，加入1mL5mM的CaCl2溶液吹打混匀，3000rpm离心1min，仔细去除上清，加入100μL5mM的CaCl2溶液，将菌体吹打混匀。
e-6.在对应SC营养缺陷型平板上倒上灭菌的玻璃珠，在平板中央滴上100μL5mM的CaCl2溶液，然后在平板的CaCl2溶液中央分别加入5μL和10μL样品，用玻璃珠将液体涂布均匀，稍稍晾干后，将平板放置到30℃培养箱倒置培养2-3天。
f.统计e-6平板上生长出的菌落数(结果见表14)和菌落生长状况(结果见图6)。
表14
由表14的CRISPR活性测试结果可知，本发明构建的CRISPR-Cas9***在酿酒酵母细胞中具有正常的剪切活性，可以有效地对宿主基因组进行编辑。
5.CRISPR***1K-40片段替换效率测试
为确定CRISPR***能否提高酵母中的同源重组效率，选择野生型酿酒酵母BY4741中的YBR157C基因作为靶点基因，URA3作为***片段进行CRISPR片段替换效率测试。
a.设计anti-YBR157C的CRISPR位点(具体设计方法见上述“CRISPR”位点设计部分)，得到4个优选CRISPR位点(见表3)。
b.利用Oligo7软件设计引物(表15)，以通过PCR获得***片段1K-40(1K表示该***片段大小约为1Kbp，40表示该***片段与整合位点的同源区长度为40bp)。
表15
c.获得打靶YBR157C基因的gRNA表达质粒，步骤参见3-b至3-j。
d.通过PCR获得1K-40***片段，步骤参见4-c，其中引物换为FT-URA3-40-F和FT-URA3-40-R。
e.将5-d获得的PCR产物进行PCR产物纯化，步骤参见2-e。
f.酵母感受态细胞制备及转化，步骤参见4-e，其中需准备7个1.5ml离心管，加入转化片段。1号管中加入1000ng步骤5-e中回收的1K-40片段；2号管中加入1000ng的1K-40片段，pRS415和pRS411质粒各500ng；3号管中加入1000ng的1K-40片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA18质粒各500ng；4号管中加入1000ng的1K-40片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA22质粒各500ng；5号管中加入1000ng的1K-40片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA24质粒各500ng；6号管中加入1000ng的1K-40片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA25质粒各500ng；7号管中加入pRS415、pRS411、pRS416质粒各500ng。(上述所用的pRS411_gRNA18/22/24/25质粒均可更换为包含对应向导RNA的PCR产物。)
g.统计步骤5-f中转化平板上生长出的菌落数(结果见表16，图7)。
表16
由表16的CRISPR***1K-40片段替换效率测试结果可知，本发明构建的CRISPR-Cas9***在酿酒酵母细胞中可以有效地宿主基因组进行剪切，使基因组DNA双链断裂，增强同源重组时外源DNA通过同源重组整合入基因组的效率。
6.CRISPR***用于合成酵母人工染色体DNA组装测试
1)针对报告基因URA3的测试
a.准备好携带megachunk片段G的酿酒酵母BY4741_synchr07G(进行了megachunk片段A-G替换之后的菌株，megachunk片段H可参见文献[8]设计后通过基因合成公司合成得到，酿酒酵母BY4741由纽约大学JefBoeke教授提供，也可通过商购获得，megachunk片段G的替换方法可以参见文献[8])。
b.取出5个携带megachunk片段H亚片段的菌株(megachunk片段H长约45kb，由5个相互之间具有约1kb同源区的亚片段组成，megachunk片段H及其亚片段可参见文献[8]设计后通过基因合成公司合成得到，存放的菌株由基因合成公司提供。5个亚片段分别命名为H1、H2、H3、H4、H5片段，具体信息见表17，片段间的相互关系见图8)，摇菌、提取质粒，步骤参见2-g、2-h。
表17
megachunk片段H亚片段的名称 酶 目的片段长度(bp)
yeast_chr07_3_56.H1 SalI 8620
yeast_chr07_3_56.H2 BstEII 8437
yeast_chr07_3_56.H3 BssHII 975117 -->
yeast_chr07_3_56.H4 Acc65I 9761
yeast_chr07_3_56.H5 SalI 6238
c.对5个质粒分别进行酶切(参见表17使用对应的酶)，进行胶回收，步骤参见2-b、2-c。
d.酵母感受态细胞制备及转化，步骤参见4-e。其中需准备2个1.5ml离心管，加入转化片段。1号管中加入酶切回收的megachunk片段H亚片段；2号管中加入酶切回收的megachunk片段H亚片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA_LEU15质粒(可使用对应的含有gRNA_LEU15的PCR产物代替该质粒)各500ng。
e.取出上步中培养好的平板，将主平板上的菌影印到灭菌的天鹅绒布上，再通过绒布将拷贝的菌落分别转移到SD-Ura和SD-Leu培养基的选择平板上，30℃培养箱倒置培养过夜。
f.取出培养好的选择平板，标记出在SD-Ura平板上菌落饱满而在SD-Leu平板上菌落扁平的菌，记为真阳性菌落，并进行菌落数和筛选率统计(统计结果见表18)。
表18
转化片段(涂板体积) 阳性菌数/全部菌数 筛选率
H(10μL) 2/217 0.92％
cas9+gRNA_LEU15+H(20μL) 8/234 3.42％
由以上CRISPR***针对报告基因URA3的测试结果可知，本发明构建的CRISPR-Cas9***在携带有半合成染色体的酵母细胞中可以有效地对宿主基因组进行剪切，使基因组DNA双链断裂，显著提高通过同源重组进行DNA组装时的同源重组率，满足增加阳性克隆筛选率的要求。
2)针对报告基因LEU2的测试
a.准备好携带megachunk片段H的酿酒酵母BY4741_synchr07H(进行了megachunk片段A-H替换之后的菌株，megachunk片段I可参见文献[8]设计后通过基因合成公司合成得到，酿酒酵母BY4741由纽约大学JefBoeke教授提供(也可通过商购获得)，megachunk片段H的替换方法可以参见文献[8])。
b.取出6个携带megachunk片段I亚片段的菌株(megachunk片段I长约60kb，由6个相互之间具有约1kb同源区的亚片段组成，megachunk片段I及其亚片段可参见文献[8]设计后通过基因合成公司合成得到，存放的菌株由基因合成公司提供。6个亚片段分别命名为I1、I2、I3、I4、I5、I6片段，具体信息见表19，片段间的相互关系见图9)，摇菌、提取质粒，步骤参见2-g、2-h。
表19
megachunk片段I亚片段的名称 酶 目的片段长度(bp)
yeast_chr07_3_56.I1 MluI 8738
yeast_chr07_3_56.I2 PspOMI 8390
yeast_chr07_3_56.I3 XbaI 9773
yeast_chr07_3_56.I4 PspOMI 977418 -->
yeast_chr07_3_56.I5 SalI 9738
yeast_chr07_3_56.I6 MluI 11337
c.对6个质粒分别进行酶切(参见表19使用对应的酶)，进行胶回收，步骤参见2-b、2-c。
d.酵母感受态细胞制备及转化，步骤参见4-e。其中需准备2个1.5ml离心管，加入转化片段。1号管中加入酶切回收的megachunk片段I亚片段；2号管中加入酶切回收的megachunk片段I亚片段，pRS415_ADH1_Cas9和pRS411_gRNA_URA45质粒(可使用对应的含有gRNA_URA45的PCR产物代替该质粒)各500ng。
e.取出上步培养好的平板，将主平板上的菌影印到灭菌的天鹅绒布上，再通过绒布将拷贝的菌落分别转移到SD-Ura和SD-Leu培养基的选择平板上，30℃培养箱倒置培养过夜。
f.取出培养好的选择平板，标记出在SD-Leu平板上菌落饱满而在SD-Ura平板上菌落扁平的菌，记为真阳性菌落，并进行菌落数和筛选率统计(统计结果见表20)。
表20
转化片段(涂板体积) 阳性菌数/全部菌数 筛选率
I(10μL) 5/211 2.37％
cas9+gRNA_URA45+I(20μL) 6/104 5.77％
由表20的CRISPR***针对报告基因URA3的测试结果可知，本发明构建的CRISPR-Cas9***在携带有半合成染色体的酵母细胞中可以有效地对宿主基因组进行剪切，使基因组DNA双链断裂，显著提高通过同源重组进行DNA组装时的同源重组率，满足增加阳性克隆筛选率的要求。
实施例2
采用本领域公知的染色体或基因组提取技术，从实施例1得到的含有人工合成染色体或人工合成基因组的酿酒酵母中提取人工合成染色体或人工合成基因组。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
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Claims (12)

1.一种用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，包括如下组成部分：
用于表达Cas9基因的质粒；和
第一向导RNA和/或用于表达所述第一向导RNA的质粒，其中所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合用于组装的半合成染色体所携带的第一报告基因。
2.根据权利要求1所述的用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，还包括如下组成部分：
宿主细胞，所述宿主细胞携带所述半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的所述第一报告基因；
待组装片段，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源。
3.根据权利要求2所述的用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，还包括如下组成部分：
第二向导RNA和/或用于表达所述第二向导RNA的质粒，其中所述第二向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第二报告基因。
4.根据权利要求2或3所述的用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，所述第一报告基因和第二报告基因为酵母中的报告基因，优选为LEU2、URA3、HIS3、TRP1、MET17和LYS2中的两种，更优选为LEU2和URA3；
优选地，结合报告基因LEU2的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQIDNO：1)；
优选地，结合报告基因URA3的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GTGGGCCCAGGTATTGTTAG(SEQIDNO：2)。
5.根据权利要求2或3所述的用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，所述待组装片段为合成的基因组片段，所述CRISPR位点在其对应的报告基因的所有潜在位点中具有最高的可靠性分数。
6.根据权利要求5所述的用于DNA组装的CRISPR-Cas9***，其特征在于，所述可靠性分数通过如下公式(1)计算得到：
S g u i d e = 100 100 + Σ i = 1 n o f f S h i t ( i ) - - - ( 1 ) ;
其中，i表示所述基因组上的每个脱靶位点，Shit表示每个脱靶位点的脱靶可能性分数，noff表示脱靶位点总数，Sguide表示每个CRISPR位点的可靠性分数；
所述每个脱靶位点的脱靶可能性分数Shit通过如下公式(2)计算得到：
S h i t = Π e ∈ M ( 1 - W [ e ] ) × 1 ( ( 19 - d ‾ ) 19 × 4 + 1 ) × 1 n m m 2 - - - ( 2 ) ;
其中，e表示所述CRISPR位点与对应的脱靶位点的实际错配位置，M指理论错配位置的集合，W[e]表示不同错配位置对脱靶的贡献值，d表示错配位置两两之间的平均距离，nmm表示错配位置的总数；其中，W[e]按照错配位置顺序，满足如下： W [ e ] = [ 0 , 0 , 0.014 , 0 , 0 , 0.395 , 0.317 , 0 , 0.389 , 0.079 , 0.445 , 0.508 , 0.613 , 0.851 , 0.732 , 0.828 , 0.615 , 0.804 , 0.685 , 0.583 ] .
7.一种DNA组装方法，其特征在于，所述方法包括：
将用于表达Cas9基因的质粒、用于表达第一向导RNA的质粒以及待组装片段转入宿主细胞内，所述宿主细胞携带有半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的第一报告基因，所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第一报告基因，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，所述待组装片段的另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源；
所述Cas9基因和所述第一向导RNA表达，产生Cas9核酸酶和所述第一向导RNA，以使所述第一向导RNA结合到所述第一报告基因上，并介导所述Cas9核酸酶使所述半合成染色体产生双键断裂，使得断裂的半合成染色体更倾向于与所述待组装片段同源重组，从而将所述待组装片段组装到所述半合成染色体上。
8.一种DNA组装方法，其特征在于，所述方法包括：
将用于表达Cas9基因的质粒、包含第一向导RNA的产物以及待组装片段转入宿主细胞内，所述宿主细胞携带有半合成染色体，所述半合成染色体包含合成染色体序列和野生染色体序列以及二者之间的第一报告基因，所述第一向导RNA具有CRISPR位点，该CRISPR位点依据碱基互补配对原则结合所述第一报告基因，所述待组装片段的一端有一段序列与所述合成染色体序列的靠近所述第一报告基因的一段序列同源，所述待组装片段的另一端的内侧有第二报告基因并且外侧有一段序列与所述野生染色体序列同源；
所述Cas9基因表达，产生Cas9核酸酶，以使所述第一向导RNA结合到所述第一报告基因上，并介导所述Cas9核酸酶使所述半合成染色体产生双键断裂，使得断裂的半合成染色体更倾向于与所述待组装片段同源重组，从而将所述待组装片段组装到所述半合成染色体上；
优选地，所述包含第一向导RNA的产物通过PCR方法产生。
9.根据权利要求7或8所述的DNA组装方法，其特征在于，所述第一报告基因和第二报告基因为酵母中的报告基因，优选为LEU2、URA3、HIS3、TRP1、MET17和LYS2中的两种，更优选为LEU2和URA3；
优选地，结合报告基因LEU2的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQIDNO：1)；
优选地，结合报告基因URA3的向导RNA的CRISPR位点序列为：
GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQIDNO：2)。
10.根据权利要求7或8所述的DNA组装方法，其特征在于，所述CRISPR位点在其对应的报告基因的所有潜在位点中具有最高的可靠性分数；
优选地，所述可靠性分数通过如下公式(1)计算得到：
S g u i d e = 100 100 + Σ i = 1 n o f f S h i t ( i ) - - - ( 1 ) ;
其中，i表示所述基因组上的每个脱靶位点，Shit表示每个脱靶位点的脱靶可能性分数，noff表示脱靶位点总数，Sguide表示每个CRISPR位点的可靠性分数；
所述每个脱靶位点的脱靶可能性分数Shit通过如下公式(2)计算得到：
S h i t = Π e ∈ M ( 1 - W [ e ] ) × 1 ( ( 19 - d ‾ ) 19 × 4 + 1 ) × 1 n m m 2 - - - ( 2 ) ;
其中，e表示所述CRISPR位点与对应的脱靶位点的实际错配位置，M指理论错配位置的集合，W[e]表示不同错配位置对脱靶的贡献值，d表示错配位置两两之间的平均距离，nmm表示错配位置的总数；其中，W[e]按照错配位置顺序，满足如下： W [ e ] = [ 0 , 0 , 0.014 , 0 , 0 , 0.395 , 0.317 , 0 , 0.389 , 0.079 , 0.445 , 0.508 , 0.613 , 0.851 , 0.732 , 0.828 , 0.615 , 0.804 , 0.685 , 0.583 ] .
11.一种通过权利要求7-10任一项所述的DNA组装方法构建而成的人工合成染色体或人工合成基因组。
12.一种人工合成微生物，其特征在于，所述人工合成微生物的染色体或基因组通过权利要求7-10任一项所述的DNA组装方法构建而成；
优选地，所述微生物为真核微生物，更优选为酵母。
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